ANALISIS METAGENOMIK GEN KETOSYNTHASE DAN NONRIBOSOMAL
PEPTIDE SYNTETHASE PADA BAKTERI ENDOFIT AKAR Vetiveria zizanioides L.
SKRIPSI
Disusun untuk Memenuhi Sebagian dari Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Sains Program Studi Biologi
Jurusan Pendidikan Biologi
Oleh
Fauzi Akhbar Anugrah
0909004
PROGRAM STUDI BIOLOGI
JURUSAN PENDIDIKAN BIOLOGI
FAKULTAS PENDIDIKAN MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS PENDIDIKAN INDONESIA
ANALISIS METAGENOMIK GEN KETOSYNTHASE DAN NONRIBOSOMAL
PEPTIDE SYNTETHASE PADA BAKTERI ENDOFIT AKAR Vetiveria zizanioides L.
Oleh
Fauzi Akhbar Anugrah
Sebuah skripsi yang diajukan untuk memenuhi salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana pada Fakultas Pendidikan Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
© Fauzi Akhbar Anugrah 2013 Universitas Pendidikan Indonesia
Oktober 2013
Hak Cipta dilindungi undang-undang.
LEMBAR PENGESAHAN
ANALISIS METAGENOMIK GEN KETOSYNTHAS DAN NONRIBOSOMAL PEPTIDE SYNTETHASE PADA BAKTERI ENDOFIT AKAR Vetiveria zizanioides L.
Oleh
Fauzi Akhbar Anugrah 0909004
DISETUJUI DAN DISAHKAN OLEH:
Pembimbing 1
Dr. Hj. Any Fitriani, M.Si. NIP. 196502021991032001
Pembimbing 2
Dr. Topik Hidayat, M.Si. NIP. 197004101997021001
Mengetahui,
Ketua Jurusan Pendidikan Biologi FPMIPA UPI
PERNYATAAN
Saya menyatakan bahwa skripsi yang berjudul “Analisis Metagenomik Gen Ketosynthase dan Nonribosomal Peptide Syntethase pada Bakteri Endofit Akar Vetiveria zianioides
L.” ini sepenuhnya karya saya sendiri. Tidak ada bagian di dalamnya yang merupakan
bentuk plagiat dari karya orang lain dan saya tidak melakukan penjiplakan atau pengutipan dengan cara-cara yang tidak sesuai dengan etika keilmuan yang berlaku dalam masyarakat keilmuan. Atas penyataan ini, saya siap menanggung resiko atau sanksi yang dijatuhkan kepada saya apabila kemudian ditemukan adanya pelanggaran terhadap etika keilmuan dalam karya saya ini atau ada klaim dari pihak lain terhadap keaslian karya saya ini.
Bandung, Oktober 2013 Yang membuat pernyataan,
ANALISIS METAGENOMIK GEN KETOSYNTHASE DAN NONRIBOSOMAL
PEPTIDE SYNTETHASE PADA BAKTERI ENDOFIT AKAR Vetiveria
zizanioides L.
METAGENOMICS ANALYSIS OF KETOSYNTHASE AND NONRIBOSOMAL PEPTIDE SYNTETHASE GENE IN EDOPHYTIC BACTERIAL ROOT OF
Vetiveria zizanioides L.
ABSTRAK
Modul enzim Ketosynthase (KS) dan Nonribosomal Peptide Syntethase (NRPS) diketahui banyak berperan dalam proses biosintesis senyawa alami dari berbagai mikroorganisme. Studi mengenai keragaman gen KS dan NRPS pada bakteri endofit dapat memberikan gambaran bagaimana pola kekerabatan atau keragaman gen tersebut. Analisis metagenomik gen KS dan NRPS pada bakteri endofit akar Vetiveria zizanioides, L. telah berhasil dilakukan, amplifikasi menunjukkan ukuran 700 bp untuk KS dan 1000 bp untuk NRPS. Penyusunan pohon filogenetik, menunjukkan adanya pola kekerabatan yang saling terkait, dari 10 sampel Vetiveria Endophytic Bacteria (VEB) Ketosynthase diketahui VEB KS 5 memiliki kedekatan dengan Pseudomonas flourescens, VEB KS 6 dengan Sterptomyces aureofaciens, VEB KS 7 dan 9 dengan sekuen KS dari Paenibacillus sp. strain F6B70, VEB KS 1 dan 4 memiliki kekerabatan dengan gen KS dari Streptomyces coelicolor, VEB KS 3 dan 10 juga memiliki kedekatan dengan kelompok KS Actinobacteria. Untuk 10 sampel gen NRPS, genus yang berkerabat dekat dengan kelompok sampel adalah Bacillus untuk VEB NRPS 1, 2, 3, 4, 7 dan 8, dan Streptomyces VEB NRPS 5, 6 dan 10. Sampel VEB NRPS 9 memiliki kemiripan dengan Saccharopolyspora erythrea. Adanya pola percabangan yang terbentuk menunjukkan bahwa terjadi evolusi atau perubahan pada sekuens gen baik KS maupun NRPS.
Kata Kunci: Ketosynthase, NRPS, Metagenomik, Bakteri Endofit, Vetiveria zizanioides
ABSTRACT
that VEB KS 5 has been related with Pseudomonas flourescens, VEB KS 6 with Sterptomyces aureofaciens, VEB KS 7 and 9 related to KS sequences from Paenibacillus sp . F6B70 strain, VEB KS 1 and 4 have a kinship with KS genes from Streptomyces coelicolor, VEB KS 3 and 10 also have close relations with KS from Actinobacteria. Ten sample of NRPS gene, which is closely related to the genus Bacillus are VEB NRPS 1, 2, 3, 4, 7 and 8, whereas the genus of Streptomyces has been related with VEB NRPS 5, 6 and 10 samples. VEB NRPS number 9 has a similarity with Saccharopolyspora erythrea. These results revealed the great diversity and novelty of both KS and NRPS genes in endophytic bacterial root of Vetiveria zizanioides, L.
KATA PENGANTAR
Rasa syukur yang begitu besar penulis panjatkan kepada Allah SWT yang tiada henti memberikan karunia dan limpahan rahmat-Nya, hingga akhirnya penulis dapat menyelesaikan skripsi ini, yang berjudul “Analisis Metagenomik Gen
Ketosynthase dan Nonribosomal Peptide Syntethase Bakteri Endofit Akar
Vetiveria zizanioides L.”. Shalawat serta salam akan selalu tercurah pada Nabi Muhammad SAW hingga akhir zaman.
Banyak suka duka yang penulis rasakan selama proses menyelesaikan skripsi ini, tak jarang kendala serta tantangan yang harus penulis hadapi, namun berkat do’a
dan dukungan yang diberikan terutama dari orang tua, dan semua pihak yang berkontribusi, akhirnya penulis dapat menyelesaikan skripsi ini. Oleh karena itu penulis ingin memberikan apresiasi setinggi-tingginya dan ucapan terimakasih yang begitu dalam kepada :
1. Ibu Dr. Hj. Any Fitriani, M.Si. selaku Dosen Pembimbing I yang telah memberikan bimbingan, arahan, motivasi, wawasan baru dan ilmu kepada penulis sejak awal penelitian penyusunan proposal hingga selesainya skripsi ini. 2. Bapak Dr. Topik Hidayat, M.Si. selaku Dosen Pembimbing II yang telah
bersedia meluangkan waktu memberikan bimbingan, motivasi dan ilmu kepada penulis sejak awal penelitian hingga akhir penyusunan skripsi ini.
4. Bapak Dr. Phill. H. Ari Widodo, M.Ed.. selaku Sekertaris Jurusan Pendidikan Biologi FPMIPA UPI, segenap pimpinan dan staf Jurusan Pendidikan Biologi FPMIPA UPI.
5. Ibu Any Aryani, M.Si. selaku Pembimbing Akademik yang selalu memberikan arahan dan motivasi kepada penulis sejak tahun pertama awal perkuliahan.
6. Bapak Kusnadi, M.Si. selaku Kepala Sub Laboratorium Mikrobiologi dan Bapak Rahadian Deden Juansah, S.Pd. selaku Laboran Lab. Mikrobiologi yang banyak sekali berjasa bagi penulis terutama memberikan bantuan kelancaran fasilitas dan arahan dalam melaksanakan penelitian.
7. Kedua orang tua, Abah (Agus Kurniawan) dan Ibu (Suhartini) juga keluarga tercinta yang selalu menjadi sumber motivasi bagi penulis, terutama Aki dan Ema.
8. Kakak tingkat, Kang Hasby, Kang Rio, Kang Zamzam, Mba Puji, Teh Indah, Teh Tri, Teh Iki, Teh Nurul dan Teh Eka yang selalu memberi dukungan semangat, dan terutama Kang Riki Ahmad yang banyak membantu penulis dalam pengambilan sampel di Kamojang garut.
9. Rekan kerja terbaik selama kuliah dan penelitian penulis, yakni: Dwi Pratiwi, Maesaroh, Visi, Fajrul, Widdy, Gayatri, Verawaty, Agie, Hana, Lia, Hayatun, Adella, Eva dan teman-teman di kelas C 2009 lainya.
Pada akhirnya penulis menyadari bahwa skripsi ini tidak luput dari berbagai kekurangan dan keliru, dengan segala kerendahan hati penulis berharap adanya kritik dan saran membangun untuk kesempurnaan dimasa mendatang. Semoga skripsi ini dapat bermanfaat bagi penulis dan pembaca pada umumnya.
Bandung, Oktober 2013
DAFTAR ISI
Halaman
ABSTRAK ……….. i
KATA PENGANTAR ………... ii
DAFTAR ISI ……….. v
DAFTAR TABEL ……….. viii
DAFTAR GAMBAR ………. ix
DAFTAR LAMPIRAN ………. x
BAB I PENDAHULUAN ……….. 1
A. Latar Belakang ………. 1
B. Rumusan Masalah ……… 2
C. Pertanyaan Penelitian ………... 3
D. Batasan Masalah ………... 3
E. Tujuan Penelitian ……….. 3
F. Manfaat Penelitian ……… 3
BAB II METAGENOMIK, KETOSYNTHASE, NONRIBOSOMAL PEPTIDE SYNTETHASE, FILOGENETIKA MOLEKULER, DAN Vetiveria zizanoides L ……….……….. 5
A. Metagenomik ……… 5
B. Gen Penyandi Ketosynthase ………. 6
C. Nonribosomal Peptide Syntethase (NRPS) ……….. 8
D. Bakteri Endofit ………. 9
F. Vetiveria zizanioides L ………. 14
BAB III METODE PENELITIAN ……….. 16
A. Jenis Penelitian ……… 16
B. Populasi dan Sampel ………... 16
C. Objek penelitian ……….. 16
D. Tempat Penelitian .…...……….. 16
E. Cara Kerja ………... 16
1. Pengambilan Sampel ………. 16
2. Isolasi DNA ……….. 17
3. PCR ……….. 18
4. Elektroforesis Hasil PCR ………. 18
5. Purifikasi Hasil PCR ……… 18
6. Kloning gen Ketosynthase dan NRPS pada vektor ………. 19
7. Transformasi ……… 20
8. Isolasi Plasmid ……… 20
9. Sequencing DNA Plasmid Rekombinan ………. 21
10.Analisis Bioinformatik ……… 21
11.Alur penelitian ... ... 22
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ………. 23
A. Sequencing DNA Plasmid Rekombinan ………... 23
B. Amplifikasi dan Purifikasi ……… 25
C. Trasnformasi ………. 28
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ………. 37
A. Kesimpulan ……….. 37
B. Saran ……… 38
DAFTAR PUSTAKA ………. 39
LAMPIRAN-LAMPIRAN ……… 42
DAFTAR TABEL
Tabel Halaman
4.1 Hasil Kuantifikasi Isolasi DNA ………... 25
4.2 Hasil spektrofotometri Purifikasi Gel ………. 28
DAFTAR GAMBAR
Gambar Halaman
2.1 Tahapan yang dilakukan dalam analisis metagenomik ………. 5
2.2 Langkah dasar sintesis peptide NRPS ……… 8
2.3 Lokasi Bakteri endofit dalam jaringan tanaman ... 9
2.4 Contoh pohon filogenetik ………... 13
2.5 Tanaman Vetiveria zizanioides L ………... 14
3.1 Diagram alir penelitian ………... 22
4.1 Elektroforesis DNA genom ……… 24
4.2 Hasil Elektroforesis amplikon gen KS ……… 26
4.3 Hasil Elektroforesis amplikon gen NRPS ……… 27
4.4 Peta vektor pGEM-T Eassy ………. 29
4.5 Koloni hasil transformasi ………. 30
4.6 Pohon filogenetik gen KS ……… 33
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran Halaman
1
BAB I
PENDAHULUAN
A. Latar belakang
Tanaman akar wangi (Vetiveria zizanioides L.) merupakan tanaman herba yang banyak digunakan sebagai pengharum karena dapat menghasilkan senyawa metabolit sekunder seperti minyak atsiri yang juga dapat berfungsi sebagai obat (Champagnant et al., 2006). Selama ini, pemanfaatan dan pengetahuan mengenai potensi tanaman akar wangi masih terbatas pada pengolahan minyak atsiri dan kerajinan dari akar wangi. Tanaman akar wangi sendiri dewasa ini banyak digunakan dalam pengobatan herbal, hal tersebut mengindikasikan adanya kandungan senyawa metabolit yang berguna dalam bidang farmakologi. Potensi terbentuknya metabolit sekunder pada tanaman akar wangi, beberapa terkait dengan aktivitas bakteri endofit yang berada pada organ tanaman dimana bakteri mampu merombak senyawa kompleks menjadi lebih sederhana yang dapat memicu tanaman menghasilkan metabolit sekunder (Fitriani et al., 2013).
Hampir setiap tanaman tingkat tinggi memiliki bakteri endofit yang berada pada jaringan tanaman baik batang, daun, maupun akar, dari berbagai jenis tanaman yang tersebar di muka bumi ini, masing-masing tanaman memiliki satu atau lebih mikroba endofit yang terdiri dari jamur dan bakteri (Rosenblueth & Romero, 2006). Kemampuan pembentukan senyawa metabolit sekunder oleh tanaman inang, juga diduga dimiliki oleh mikroorganisme endofit, dimana bahan aktif yang dapat dibentuk oleh mikroorganisme endofit diperkirakan memiliki kemampuan yang sama dengan bahan aktif yang dihasilkan tanaman inang (Strobel et al., 2003). Kemampuan bakteri endofit dalam memproduksi senyawa metabolit sekunder merupakan potensi untuk dimanfaatkan sebagai sumber produksi dan sebagai upaya mengurangi pemanfaatan tanaman untuk ditebang.
2
Ketosynthase (KS) dan Nonribosomal Peptide Syntethase (NRPS) diketahui sebagai superfamili dari enzim kompleks biosintetik yang berasosiasi dengan prokaryotik, fungi dan tumbuhan yang berperan dalam pembentukan metabolit sekunder. Ketosynthase dan NRPS ini telah banyak diketahui dapat berperan dalam produksi berbagai produk seperti antibiotik maupun produk lainya yang diperlukan untuk keperluan medis dan industri farmakologi dalam skala besar. Berdasarkan sejumlah penelitian yang telah dilakukan, diketahui bahwa enzim dari kelompok KS dan NRPS dapat disintesis oleh bakteri endofit.
Identifikasi secara mendalam mengenai potensi mikroorganisme endofit yang dapat dilakukan dengan analisis genetik dan analisis keragaman gen bakteri serta potensinya untuk produksi senyawa metabolit sekunder sangat diperlukan. Telah banyak penelitian yang dilakukan untuk mengisolasi mikroorganisme endofit pada beberapa tanaman, misalnya pada tanaman obat, tanaman perkebunan dan tanaman budidaya seperti jagung, padi (Fisher, 1992), dan kentang (Sessitsch, 2002). Namun hanya 0,02 % atau kurang dari 99 % dari mikroorganisme di muka bumi yang dapat dikultur dalam medium pertumbuhan sehingga belum cukup memberikan data keragaman dan potensi yang sebenarnya (Streit & Schmitz, 2004). Berbagai pendekatan telah dilakukan salah satunya melalui analisis bakteri tanpa proses pengkulturan dikenal dengan istilah metagenomik. Analisis metagenomik adalah teknik isolasi DNA dari sampel alam secara langsung tanpa melalui tahapan kultivasi mikroorganisme, yang meliputi tahapan isolasi DNA, kloning, transformasi, dan isolasi plasmid (Handelsman, 2004). Analisis hasil isolasi plasmid akan memberikan gambaran mengenai diversitas gen pada bakteri endofit yang terkait dengan biosintesis dan produksi bioaktif, sehingga dapat dimanfaatkan sebagai referensi dan aplikasinya dalam penelitian lebih lanjut (Moffit & Neilan, 2002).
B. Rumusan masalah
3
sebab itu, pada penelitian ini ingin mengetahui bagaimanakah keragaman dari gen KS dan NRPS pada bakteri endofit akar Vetiveria zizanioides, L, dengan analisis metagenomik?
C. Batasan masalah
1. Isolasi DNA genome bakteri endofit di ambil dari sampel akar Vetiveria zizanioides L. Secara langsung tanpa tahapan pengkulturan, sampel akar
didapatkan dari perkebunan akar wangi di Kamojang, Kabupaten Garut Jawa Barat.
2. Amplifikasi gen ketosynthase dengan oligonukleotida (primer) DKF/DKR (Moffit & Neilan, 2002) yang akan mengamplifikasi ±700 bp. Sedangkan amplifikasi gen Nonribosomal Peptide Syntethase (NRPS) dengan oligonukleotida (primer) MTR/MTF (Zheng et al., 2008; Li et al., 2009) yang akan mengamplifikasi sekuens dengan ukuran ±1000 bp.
D. Tujuan
Untuk mengetahui keragaman gen Ketosynthase dan Nonribosomal Peptide Syntethase pada bakteri endofit akar Vetiveria zizanioides L. melalui
analisis metagenomik.
E. Manfaat
1. Memberikan informasi mengenai hubungan kekerabatan antara masing-masing gen ketosynthase dan nonribosomal peptide syntethase yang terdapat pada bakteri endofit akar Vetiveria zizanioides L..
2. Memberikan gambaran mengenai keragaman jenis gen ketosynthase dan nonribosomal peptide syntethase bakteri endofit akar Vetiveria zizanioides
L.
3. Sebagai pustaka awal untuk penelitian selanjutnya.
16
Fauzi Akhbar Anugrah, 2013
BAB III
METODE PENELITIAN
A. Jenis penelitian
Jenis penelitian yang dilakukan adalah penelitian dasar dengan metode deskriptif (Nazir, 1988).
B. Populasi dan sampel
Populasi pada penelitian ini adalah seluruh bakteri endofit yang ada pada akar Vetiveria zizanioides L. yang ada di alam, sedangkan sampel yang digunakan adalah bakteri endofit yang ada pada akar Vetiveria zizanioides L. dari perkebunan Usar Kamojang, Kab. Garut.
C. Objek penelitian
Objek penelitian ini adalah materi genetik (DNA), terutama gen Ketosynthase (KS) dan Nonribosomal Peptide Synthetase (NRPS).
D. Tempat penelitian
Penelitian ini dimulai pada bulan Maret 2013 sampai bulan September 2013 yang dilaksanakan di laboratorium mikrobiologi FPMIPA UPI.
E. Cara kerja
1. Pengambilan sampel
Isolasi mikroba endofit dilakukan dengan mengambil sampel akar tanaman Vetiveria zizanioides L., kemudian akar yang didapat dicuci pada air mengalir
17
Fauzi Akhbar Anugrah, 2013
Analisis Metagenomik Gen Ketosynthase Dan Nonribosomal Peptide Synthase Pada Bakteri Endofit Akar Vetiveria zizanoides, L.
selama 5 menit, dan terakhir dicuci dengan etanol 75% selama 30 detik. Setelah disterilisasi permukaan, akar kemudian dipotong lebih halus dan dimasukan pada cairan fisiologis NaCl 0,98% pada tabung reaksi, kemudian divorteks selama 1,5 jam (Lumyong et al., 2001).
2. Isolasi DNA
Isolasi DNA dilakukan dengan mengambil 3 ml (@ 1,5 ml) larutan hasil vorteks pada tabung 1,5 ml, kemudian disentrifugasi pada 5000 rpm selama 2 menit. Bagian supernatan dibuang, kemudian proses isolasi DNA dari pellet dengan metode yang tersedia dalam katalog “ FERMENTAS DNA Purification KIT”. Pellet hasil sentrifugasi ditambahkan dengan 200 µl TE buffer diresuspensikan hingga homogen. Selanjutnya ditambahkan 400 µl larutan lysis solution. Tabung kemudian diinkubasi pada suhu 65oC selama 10 menit. Setelah diinkubasi, kemudian ditambahkan 600 µl kloroform kedalam tabung dan dihomogenkan dengan dibolak-balik sebanyak 3-5 kali. Sentrifugasi pada 10.000 rpm selama 2 menit, kemudian fasa cair dipindahkan pada tabung baru dan ditambahkan 800 µl larutan presipitasi (80 µl larutan presipitation solution dilarutkan dengan 720 µl ddH2O steril) kemudian disentrifugasi pada kecepatan 10.000 rpm selama 2 menit. Supernatan yang terbentuk dibuang hati-hati kemudian ditambahakan NaCl solution 1,2 M sebanyak 100 µl pastikan pellet DNA larut. Kemudian ditambahkan RNAse free DNAse sebanyak 10 µl lalu diinkubasi pada suhu 37oC selama 10 menit. Setelah itu ditambahkan 300 µl etanol absolute dingin dan disimpan pada – 20oC selama 1-2 jam. Selanjutnya disentrifugasi pada 12.000 rpm selama 5 menit, cairan atas dibuang dengan hati-hati endapan DNA jangan sampai terbuang biarkan hingga mengering. Pellet yang terbentuk kemudian dilarutkan dengan ddH2O steril sebanyak 20 µl, larutan tersebut disimpan pada -20oC hingga siap digunakan.
18
Fauzi Akhbar Anugrah, 2013
Komposisi mix PCR untuk amplifikasi gen KS dan gen NRPS adalah dengan buffer enzim 10x Dream Taq Buffer sebanyak 5 µl hingga konsentrasi akhir 2,5 mM, dNTPs (mix) sebanyak 5 µl dengan konsentrasi akhir 0,2 mM tiap dNTP, enzim Dream Taq polimerase dengan konsentrasi akhir 1,25 u/µl (Sambrook dan Russel, 2001). Amplifikasi menggunakan primer DKF/DKR (untuk Ketosynthase), dan MTF/MTR (untuk NRPS) masing-masing 2,5 µl, dan di tambahkan ddH2O hingga 25 µl. Tabung PCR dimasukan kedalam mesin PCR Thermocycler (Eppendorf) yang di program untuk tahap pre-denaturasi pada suhu 95oC selama 5 menit, tahap denaturasi pada suhu 94oC selama 1 menit, annealing untuk primer MTR/MTF dan DK/DKR pada suhu 50oC (Zheng et al., 2008; Li et al., 2009) dan 51oC, ekstensi pada suhu 72oC selama 1 menit, tahan ekstensi akhir selama 72oC selama 7 menit dan diinkubasi pada suhu 4oC. Reaksi amplifikasi dilakukan sebanyak 40 siklus untuk KS dan 35 siklus untuk NRPS. Amplikon kemudian dielektroforesis pada gel agarose 1 % dalam buffer TBE 0,5x untuk melihat kualitas hasil amplifikasi (Moffit & Neilan, 2003).
4. Elektroforesis hasil PCR
Elektroforesis dilakukan secara horizontal pada agarose 1% dengan tegangan 75 volt selama 40 menit dalam larutan TAE 1x/TBE 0,5x. Alat yang digunakan adalah alat elektroforesis BIORAD. Gel berisi DNA hasil elektroforesis direndam dengan Ethidium Bromide (EtBr) selama lima menit, kemudian dibilas dengan aquadest selama 3 menit. Agar-agar yang telah direndam dalam EtBr kemudian dilihat dan diamati pada UV transluminator.
5. Purifikasi hasil PCR
19
Fauzi Akhbar Anugrah, 2013
Analisis Metagenomik Gen Ketosynthase Dan Nonribosomal Peptide Synthase Pada Bakteri Endofit Akar Vetiveria zizanoides, L.
pada katalog Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega, USA). Diambil ±300 µl gel kedalam tabung 1,5 ml, selanjutnya ditambahkan membrane binding solution dengan perbandingan berat gel 1:1, campuran
divortex dan diinkubasi pada suhu 60oC hingga potongan gel terlarut semua. Tabung disentrifugasi secara singkat untuk memastikan DNA berada pada bagian dasar tabung. Masing-masing SV minicolumb diambil dan diletakan pada tabung koleksi kemudian larutan pertama dimasukan pada tabung filter dan diinkubasi selama 1 menit pada suhu kamar untuk selanjutnya disentrifugasi pada keceptan 14.000 rpm selama 1 menit. Cairan yang berada pada tabung koleksi dibuang, kemudian SV minicolumb dikembalikan pada tabung koleksi, dan ditambahkan 700 µl membrane wash solution untuk disentrifugasi kembali pada 14.000 rpm selama 1 menit dan mengulangi ditambahkan lagi 500 µl membrane wash solution. Kembali sentrifugasi SV minicolumb dengan kecepatan 14.000 rpm selama 5 menit. Kosongkan tabung koleksi dan sentrifugasi SV minicolumb bersama tabung koleksi dalam keadaan kosong pada kecepatan yang sama selama 1 menit untuk menguapkan residu etanol. Selanjutnya tabung SV minicolumb dipindahkan pada tabung eppendorf yang baru untuk ditambahkan 50 µl nuclease free water, disentrifugasi pada 14.000 rpm selama 1 menit, hasil purifikasi disimpan pada suhu -20oC.
6. Kloning gen KS dan NRPS pada vektor
Amplikon hasil PCR diklonkan pada plasmid pGEM-T Easy vector (Promega, USA) dengan bantuan enzim ligase. 2x Rapid Ligation Buffer T4 Ligase 5 µl, pGEM-T Easy vector (50 ng) 1 µl, Amplikon 2 µl, T4 DNA Ligase 1 µl, dan ddH2O hingga 10 µl kemudian diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37oC atau semalaman (16 jam) pada suhu 4oC.
20
Fauzi Akhbar Anugrah, 2013
Untuk transformasi sel yang digunakan merupakan sel kompeten E.coli
DH5α yang telah diberi perlakuan CaCl2 dingin, kemudian dipindahkan 50 µl/
100 µl sel kompeten ke tabung steril dingin dengan menggunakan mikropipet. Tambahkan DNA (50 ng) 2 µl hasil kloning DNA atau 0,1 µl kontrol uncut ke setiap tabung. Campurkan isi tabung dengan membolak-balikan tabung perlahan. Tabung disimpan dalam es selama 20 menit. Tabung dipindahkan pada rak waterbath dengan suhu tepat 42oC selama 45-50 detik, jangan digoyang. Pindahkan tabung dengan cepat pada es agar sel menjadi dingin selama 2 menit. Tambahkan 950 µl medium SOC atau 900 µl pada tabung kontrol. Inkubasi kultur selama 45 menit dalam water bath suhu 37oC agar bakteri dapat pulih dan mengekspresikan penanda resistensi antibiotik yang dikodekan oleh vektor plasmid. Sebanyak 100 µl sel ditumbuhkan dan kemudian diikuti seleksi biru-putih pada medium LBA yang telah dibubuhi ampicilin 100 µg/ml dan X-gal 40 µg/ml diinkubasi pada 37oC selama 24 jam Berdirikan cawan dan inkubasi dapa suhu 37oC. Untuk hasil maksimal simpan biakan dalam inkubator 4oC pada 24 jam ke 2. Efisiensi transformasi dihitung berdasarkan instruksional KIT Promega dan pGEM-T Eassy yang mengacu pada (Sambrook & Russel, 2001).
8. Isolasi Plasmid
21
Fauzi Akhbar Anugrah, 2013
Analisis Metagenomik Gen Ketosynthase Dan Nonribosomal Peptide Synthase Pada Bakteri Endofit Akar Vetiveria zizanoides, L.
ditutup rapat dan dihomogenkan dengan membolak-balikan tabung secara cepat sebanyak 5 kali (tidak di vortex). Kemudian simpan tabung diatas es, tambahkan 150 µl pelarut alkaline lysis III tabung didtutup kemudian mendispersikan larutan melalui kekentalan lisat bakteri dengan membalikan tabung beberapa kali. Tabung kembali dimasukan pada es selama 3-5 menit. Setelah itu disentrifugasi kembali pada kecepatan maksimum 13.000 rpm selama 5 menit dengan suhu 4oC pada sentrifuge. Supernatant dipindahkan pada tabung baru, kemudian ditambahkan phenol : chloroform dengan perbandingan volume yang sama dengan volume supernatant, Mencampur materi organik (DNA) dan air dengan vortex, kemudian menyentrifugasi emulsi pada sentrifuge dengan kecepatan maksimum selama 2 menit pada suhu 4oC. lapisan air yang terbentuk di bagian atas dipindahkan pada tabung baru. Kemudian dipresipitasi dengan menambahkan 2x volume etanol pada suhu ruang. Mencampur larutan dengan vortex, kemudian didiamkan selama 2 menit dengan cara memberdirikan tabung pada suhu kamar. Asam nukleat kemudian diendapkan dengan sentrifugasi dalam sentrifuge dengan kecepatan maksimum selama 5 manit pada suhu 4oC. supernatant dibuang kemudian ditambahakan 1 ml etanol 70% ke pellet dalam tabung lalu membolak-balikan tabung beberapa kali, dan disentrifugasi kembali selama 2 menit, supernatant dibuang dan dikeringkan diatas tissue. DNA dilarutkan dalam 50 µl TE (pH 8,0) yang berisi 20 µl/ml DNAse – free RNAse. Vortex selama beberapa detik selanjutnya disimpan pada suhu -20oC.
9. Sequencing DNA Plasmid Rekombinan
Proses Sequencing dilakukan dengan BigDye Applied Biosystem sequencer engine model 3730 pada Macrogen Inc. Korea, selanjutnya hasil sequencing dilakukan analisis bioinformatik.
22
Fauzi Akhbar Anugrah, 2013
Analisis Metagenomik Gen Ketosynthase Dan Nonribosomal Peptide Synthase Pada Bakteri Endofit Akar Vetiveria zizanoides, L.
Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu
Setiap sekuens gen KS dan NRPS yang didapatkan dari proses sequencing disejajarkan dan dibandingkan dengan data sekuens gen KS dan NRPS yang terdapat pada data base Gene Bank NCBI (National Center for Biotechnology Information). Proses blast dilakukan pada alamat website http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/Blast.cgi, selanjutnya alignment dari setiap sekuens gen KS dan NRPS menggunakan program tool multiple-sequence alignment dari software Clustal X dan software MEGA5 untuk
melakuka analisis pohon filogenetik yang dihasilkan.
F. Alaur Penelitian
Adapun alur penelitian yang dilakukan sebagai berikut:
Penyusunan Proposal
Tahap Persiapan
Menyiapkan alat dan Bahan yang dibutuhkan untuk isolasi DNA Pengmbilan sampel tanaman Vetiveria zizanioides L.di perkebunan User Garut
Isolasi DNA Genom
Tahap Penelitian
PCR menggunakan pasangan primer gen Ketosynthase (DKF-DKR) dan NRPS (MTF-MTR)
Elektroforesis hasil PCR
Purifikasi DNA
Seleksi biru-putih dan Isolasi plasmid Kloning pada vektor pGMT Easy
BAB V
SIMPULAN DAN SARAN
A. Simpulan
Isolasi gen Ketosynthase dan Nonribosomal Peptide Syntethase pada bakteri endofit akar Vetiveria zizanioides, L. secara langsung telah berhasil dilakukan. Amplifikasi gen KS dan NRPS pada sampel DNA genom menunjukkan ukuran 700 bp untuk KS dan 1000 bp untuk NRPS. Penyusunan pohon filogenetik dari hasil isolasi plasmid 20 sampel terpilih untuk masing-masing gen, menunjukkan adanya pola kekerabatan yang saling terkait antara sampel dengan spesies yang telah diketahui. Dari 10 sampel Ketosynthase diketahui VEB KS 5 memiliki kedekatan dengan Pseudomonas flourescens, VEB KS 6 dengan Sterptomyces aureofaciens, VEB KS 7 dan 9 dengan sekuen KS dari Paenibacillus sp. strain
F6B70, VEB KS 1 dan 4 memiliki kekerabatan dengan gen KS dari Streptomyces coelicolor, VEB KS 3 dan 10 juga memiliki kedekatan dengan kelompok KS
Actinobacteria. Untuk gen NRPS, genus yang berkerabat dekat dengan kelompok
sampel adalah Bacillus untuk VEB NRPS 1, 2, 3, 4, 7 dan 8, dan Streptomyces untuk VEB NRPS 5, 6 dan 10. Sampel VEB NRPS 9 memiliki kemiripan dengan Saccharopolyspora erythrea. Adanya pola percabangan yang terbentuk
menunjukkan bahwa terjadi evolusi atau perubahan pada sekuens gen baik KS maupun NRPS.
B. Saran
Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan ada beberapa saran untuk penelitian terkait berikutnya yaitu:
38
Daftar Pustaka
Backer, C. A. and Brink, R. C. B. V. D. (1968). Flora of Java (Spermatophytes only) Vol III. Netherland. Wolters-Noordhoof. V.-Groningen.
Castoe, T.A., Stephens T., Noonan B., Calestani C. (2006). “A novel group of type I polyketide synthases (PKS) in animals and the complex phylogenomics of PKSs”, ScienceDirect, Gene 392, 47–58
Champagnat, P., Figueredo, G.C , Bessière, J.E. (2006). “Essential Oil Composition of Vetiveria nigritana from Mali”. Journal of Essential Oil Research: JEOR.
Dharmayanti, N. I. (2012). “Filogenetika Molekuler Metode Taksonomi Organisme Berdasarkan Sejarah Evolusi”. Indonesian Journal of animal and Veterinary science, 17(4).
Delmont, T. O., Robe, P., Clark, I., Simonet, P., Vogel, T. M. (2011). “Metagenomic
comparison of direct and indirect soil DNA extraction approaches”. Journal
of microbiological methods, 86(3), 397-400.
Dewick, Paul M. (2011). Medicinal natural products: a biosynthetic approach. John
Wiley & Sons.
Donadio S., Monciardini P., Sosio M. (2007). “Polyketide synthases and nonribosomal peptide synthetases: the emerging view from bacterial genomics”. The Royal Society of Chemistry. 24, 1073–1109
Fisher, P.J., Petrini, O., Lappin Scott, HM. (1992). “The distribution of some fungal and bacterial endophytes in maize (Zea mays L.)”. New Phytol, 122: 299-305.
Fitriani, A., Aryani, A., Yusuf, H., Permatasari, Y. (2013). “The Exploration of Ketosynthase Gene on Endophytic Bacterial Root of Vetiveria zizanioides L”. International Journal of Basic & Applied Sciences Vol:13, No:04, 112-119.
40
Handelsman, J. (2004). “Metagenomics: Application of Genomics to Uncultured Microorganisms”. Microbiology And Molecular Biology Reviews. p. 669– 685.
Hallmann, J., Quadt-Hallmann, A., Mahaffee, W. F., Kloepper, J. W. (1997). “Bacterial endophytes in agricultural crops”. Canadian Journal of Microbiology. 43.(10), 895-914.
Hertweck, C., A. Luzhetskyy, Y. Rebbets and A. bechthold. (2007). “Type 2 Polyketide Synthase : Gaining a Deeper Insight Into Enzymatic Teamwork”. Nat. prod. Rep. 24, 162-190.
Kamarudin, K.R., Rehan, A.M., Hashim, R., Usup, G., Ahmad, H.F., Anua, M.H., Idris, M.Y. (2011). “Molecular Phylogeny of Holothuria (Mertesiothuria) leucospilota (Brandt 1835) as Inferred from Cytochrome C Oxidase I Mitochondrial DNA Gene Sequence”. Sains Malaysia. 40,(2), 125-133. Kumar, S., Tamura, K., Peterson, D., Peterson, N., Stecher, G., Nei, M. (2013).
“MEGA5: Molecular Evolutionary Genetics Analysis Using Maximum Likehood, Evolutionary Distance, and Maximum Parsimony Methods”. Molecular Biology Evolution. 28, (10), 2731-2739.
Li, S., Pearl, D. K., & Doss, H. (2000). “Phylogenetic tree construction using Markov chain Monte Carlo”. Journal of the American Statistical Association,95,(450), 493-508.
Li, Z., Zhang, W., Miao, X., Zhang, F. (2009). “The Screening of Antimicrobial Bacteria with Diverse Novel Nonribosomal Peptide Synthetase (NRPS) Genes from South China Sea Sponges”. Springer Science + Business Media. 11, 346–355.
Lipko, I. A., Kalyuzhnaya, O. V., Kravchenko, O. S., Parfenova, V. V. (2012). “Identification of polyketide synthase genes in genome of Pseudomonas fluorescens strain 28Bb-06 from freshwater sponge Baikalospongia bacillifera”. Molecular Biology. 46.(4), 609-611.
Lumyong, S., Norkaew, N., Ponputhachart, D., Lumyong, P., Tomita, F. (2001). “Isolation, optimitation, and characterization of xylanase from endophytic fungi”. Biotechnology for Sustainable Utilization of Biological Resources in the Tropic, 15, 98-103.
41
Metsä-Ketelä, M., Halo, L., Munukka, E., Hakala, J., Mäntsälä, P., Ylihonko, K. (2002). “Molecular evolution of aromatic polyketides and comparative sequence analysis of polyketide ketosynthase and 16S ribosomal DNA genes from various Streptomyces species”. Applied and environmental microbiology. 68.(9), 4472-4479.
Misaghi IJ and Donndelinger CR (1990).”Endophytic bacteria in symptom-free cotton plants”. Phytopathology. 80, 808-811.
Moffitt, M.C., Neilan, B.A. (2002). “Evolutionary Affiliation Within the Superfamily of Ketosynthases Reflect Complex Pathway Associations”. Journal of molecular evolution. 56, 446-457.
Mount, D. W. (2004). Sequence and genome analysis. Bioinformatics. CSHL New York Press. Pp 237-280.
Nazir, M. (1988). Metode Penelitian. Jakarta. Ghalia Indonesia.
Nielsen, R., & Yang, Z. (1998).” Likelihood models for detecting positively selected
amino acid sites and applications to the HIV-1 envelope
gene”.Genetics. 148,(3), 929-936.
Oliynyk, M., Samborskyy, M., Lester, J. B., Mironenko, T., Scott, N., Dickens, S., Leadlay, P. F. (2007). “Complete genome sequence of the erythromycin-producing bacterium Saccharopolyspora erythraea NRRL23338”. Nature biotechnology. 25,(4), 447-453.
Page, R. D., & Holmes, E. C. (2009). Molecular evolution a phylogenetic approach. Wiley. com.
[Promega]. (2010). pGEM®-T and pGEM®-T Easy Vector Systems (Technical Manual No.042. Madison. Promega Corporation.
Rosenblueth, M., & Romero, E. M. (2006). “Bacterial Endophytes and Their Interactions with Host. The American Phytopathologycal Society. 19. (8), 827-837.
Saikkonen, K., Faeth, S. H., Helander, M., Sullivan, T. J. (1998). “Fungal endophytes: a continuum of interactions with host plants”. Annual Review of Ecology and Systematics, 29, 319-343.
42
Sambrook, J. & Russel. (2001). Molecular Cloning - A Laboratory Manual. New York. Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Sessitsch, A., Reiter,B., Pfeifer,U., Wilhelm,E. (2002). “Cultivation-independent population analysis of bacterial endophytes in three potato varieties based on eubacterial and Actinomycetes-species PCR of 16S rRNA genes”. FEMS Microbiology Ecology. 39, 23-32.
Shen, B. (2003). “Polyketide Biosynthesis beyond the Type 1, 2 and 3 Polyketide Synthase Pardigms”. Curr. Opin. Chem. Biol. 7, 285-295.
Staunton, J. & K.J. Weissman, (2001). “Polyketide Biosynthesis: A millennium review”. Nat. Prod. Rep. 18, 380-416.
Streit, W. R., & Schmitz, R. A. (2004). “Metagenomics–the key to the uncultured microbes”. Current Opinion in Microbiology, 7, (5), 492-498.
Strobel, G., Daisy, B. (2003). “Bioprospecting for Microbial Endophytes and Their Natural Products”. Microbiology and Molecular Biology Reviews. p. 491– 502.
Sturz A.V., Christie B.R., Nowak J. (2000). “Bacterial endophytes: potential role in developing sustainable systems of crop production”. Crit. Rev. Plant Sci. 19, 1-30.
Zinniel, D. K., Lambrecht, P., Harris, N. B., Feng, Z., Kuczmarski, D., Higley, P., Ishimaru, C.A., Arunakumari, A., Barletta, R.G., Vidaver, A. K. (2002). “Isolation and characterization of endophytic colonizing bacteria from agronomic crops and prairie plants”. Applied and environmental microbiology, 68(5), 2198-2208.
