EKSPLORASI GEN NRPS (NONRIBOSOMAL PEPTIDE SYNTHETASE) DARI BAKTERI ENDOFIT PADA AKAR TUMBUHAN OBAT: Ageratum conyzoides L. DAN Vetiveria zizanioides L.

EKSPLORASI GEN NRPS (NONRIBOSOMAL PEPTIDE SYNTHETASE) DARI BAKTERI ENDOFIT PADA AKAR TUMBUHAN OBAT (Ageratum

conyzoides L. DAN Vetiveria zizanioides L.)

SKRIPSI

Diajukan untuk memenuhi persyaratan dalam memperoleh gelar Sarjana Sains

oleh:

Sandy Ahmad Herdiansyah

NIM 1105084

PROGRAM STUDI BIOLOGI DEPARTEMEN PENDIDIKAN BIOLOGI

FAKULTAS PENDIDIKAN MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUANALAM

EKSPLORASI GEN NRPS (NONRIBOSOMAL PEPTIDE SYNTHETASE) DARI BAKTERI ENDOFIT PADA AKAR TUMBUHAN OBAT (Ageratum

conyzoides L. DAN Vetiveria zizanioides L.)

Oleh:

Sandy Ahmad Herdiansyah 1105084

Sebuah skripsi yang diajukan sebagai salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana pada Fakultas Pendidikan Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

© Sandy Ahmad Herdiansyah 2015 Universitas Pendidikan Indonesia

Hak Cipta dilindungi undang-undang

LEMBAR PENGESAHAN

Eksplorasi Gen NRPS (Nonribosomal Peptide Synthetase) dari Bakteri Endofit pada Akar Tumbuhan Obat (Ageratum conyzoides L. dan Vetiveria

zizanioides L.)

Oleh

Sandy Ahmad Herdiansyah 1105084

DISETUJUI DAN DISAHKAN OLEH: Pembimbing I

Dr. Hj. Any Fitriani, M.Si. NIP. 196502021991032001

Pembimbing II

Dra. R. Kusdianti, M.Si NIP. 196402261989032004

Mengetahui,

Kepala Departemen Pendidikan Biologi

Sandy Ahmad Herdiansyah, 2015

ABSTRAK

Sandy Ahmad Herdiansyah, 2015

ABSTRACT

Study to analyze nonribosomal peptide synthetase (NRPS) gene diversity on bacterial endophyte isolates from roots of Vetiveria zizanioides and Ageratum conyzoides has been conducted. The aim of the research is to study the presence and diversity of NRPS gene on nine bacterial endophytes from root of medicinal plant. The bacterial DNA chromosomes has been isolated and amplified by PCR methods using primer which targeting adenilation domain of NRPS gene. The amplified segments were sequenced and analyzed in silico with bioinformatics methods. The 700 bp length DNA segment have been amplified on seven bacterial endophyte isolates of plant root. Bioinformatics analysis of the DNA sequence showed that all of the amplicon were coding NRPS enzymes that contain conservative domains of AFD superfamily. Sequence motif that determine NRPS substrates detected from three sequences of bacterial endophyte. Phylogenetic studies indicates that NRPS genes from V. zizanioides endophytes were grouping with NRPS from Gammaproteobacteria group, otherwise NRPS genes from A. conyzoides were grouping with NRPS genes from Firmicutes Group. Study indicates that NRPS genes of bacterial endophytes from each host plants evolved separately.

v

Sandy Ahmad Herdiansyah, 2015

DAFTAR ISI

Halaman

ABSTRAK ... i

KATA PENGANTAR ... iii

DAFTAR ISI ... v

DAFTAR TABEL ... vii

DAFTAR GAMBAR ... viii

BAB I PENDAHULUAN ... 1

A. Latar belakang ... 1

B. Rumusan masalah ... 3

C. Batasan masalah ... 3

D. Tujuan ... 3

E. Manfaat ... 3

BAB II BAKTERI ENDOFIT, KOMPLEKS ENZIM NRPS, DAN METODE MOLEKULER DETEKSI GEN ... 6

A. Bakteri Endofit... 5

B. Kompleks Enzim NRPS ... 10

C. Ageratum conyzoides ... 12

D. Vetiveria zizanioides ... 14

E. Metode Molekuler dalam Analisis Gen ... 17

1. Elektroforesis Gel ... 17

2. Kuantifikasi DNA ... 20

3. Isolasi Segmen Tertentu pada DNA ... 22

4. Sikuensing ... 28

vi

Sandy Ahmad Herdiansyah, 2015

A. Desain Penelitian ... 30

B. Populasi dan Sampel ... 30

C. Waktu dan Lokasi Penelitian ... 30

D. Alat dan Bahan ... 30

E. Langkah Kerja ... 30

1. Tahap Persiapan ... 30

2. Isolasi DNA Kromosom ... 31

3. Pengukuran Konsentrasi dan Kemurnian DNA ... 32

4. Elektroforesis DNA ... 32

5. Amplifikasi DNA ... 33

6. Sikuensing DNA ... 33

7. Analisis Data Bioinformatika ... 34

F. Alur Penelitian ... 35

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ... 36

A. Kualitas dan Kuantitas Sampel DNA ... ₃₆

B. Amplifikasi Gen NRPS ... 38

C. Pensejajaran Sikuens DNA ... 39

D. Analisis Domain Konservatif ... 42

E. Prediksi Substrat Enzim NRPS ... 44

F. Pohon Filogenetik ... 46

BAB V PENUTUP ... 51

A. Kesimpulan ... ₅₁

B. Saran ... ₅₁

DAFTAR PUSTAKA ... 52

vii

Sandy Ahmad Herdiansyah, 2015

DAFTAR TABEL

Tabel Halaman

2.1. Karakteristik buffer TAE dan TBE ... 20

4.1. Konsentrasi dan kemurnian sampel DNA bakteri endofit ... 37

4.2. Hasil analisis homologi amplikon bakteri endofit ... 40

4.3. Hasil deteksi domain spesifik sikuen bakteri endofit ... 43

viii

Sandy Ahmad Herdiansyah, 2015

DAFTAR GAMBAR

Gambar Halaman

2.1. Proses kolonisasi bakteri endofit pada jaringan akar dan xilem ... 7

2.2. Contoh senyawa yang dihasilkan bakteri endofit pada tumbuhan ... 8

2.3. Proses pembentukan peptida nonribosom pada enzim NRPS ... 11

2.4. Ageratum conyzoides ... 13

2.5. Vetiveria zizanioides ... 15

2.6. Skema ilustrasi susunan elektroforesis horizontal ... 18

2.7. Elektroforegram marker pada berbagai konsentrasi ... 19

2.8. Gambaran reaksi molekul DNA pada PCR ... 23

2.9. Grafik hubungan suhu dan waktu pada siklus PCR ... 24

2.10. Grafik pembacaan sikuens DNA. ... 29

4.1. Elektroforegram sampel DNA kromosom bakteri endofit ... 36

4.2. Elektroforegram amplikon PCR gen NRPS ... 38

4.3. Daerah domain adenilasi target primer A3F – A7R ... 39

4.4. Diagram hasil analisis CDS pada sikuen bakteri endofit ... 42

1

Sandy Ahmad Herdiansyah, 2015

BAB I PENDAHULUAN

A. Latar belakang

Sebagai negara dengan iklim tropis, Indonesia memiliki wilayah dengan

biodiversitas yang tinggi. Faktor lingkungan sangat mendukung tumbuhnya

berbagai jenis tumbuhan yang tersebar di wilayah Indonesia. Banyak jenis

tumbuhan tersebut memiliki nilai etnobotani, menunjukkan tingginya potensi

sumber daya hayati nusantara. Penggunaan tersebut tidak terlepas dari keberadaan

senyawa bioaktif yang dimiliki oleh tumbuhan. Berbagai senyawa bioaktif yang

dimiliki oleh tumbuhan telah banyak diekstraksi, diidentifikasi dan dikaji

keefektifannya dalam menangani penyakit dan penyebabnya. Cara tersebut

menunjukkan tren baru pemanfaatan senyawa bioaktif dalam pengembangan obat

- obatan (Keller & Nugraha, 2011).

Akar wangi (Vetiveria zizanioides) dan babadotan (Ageratum conyzoides)

merupakan tumbuhan yang memiliki nilai etnobotani dengan pemanfaatan sebagai

tumbuhan obat oleh masyarakat Indonesia, khususnya dalam penanganan luka.

Akar wangi dan babadotan memiliki banyak jenis metabolit sekunder yang

terakumulasi pada berbagai bagian organ. Beberapa jenis metabolit sekundernya

pun diproduksi sebagai minyak esensial pada kedua jenis tumbuhan (Amadi et al.,

2012 ; Maffei, 2002). Kelompok senyawa bioaktif yang disintesis oleh kedua

tumbuhan meliputi kelompok senyawa fenol, terpenoid, alkaloid, dan flavonoid.

Variasi senyawa yang tinggi menyebabkan tingginya potensi penggunaan kedua

tumbuhan sebagai sumber daya biologis senyawa aktif yang fungsional (Keller &

Nugraha, 2011).

Senyawa bioaktif yang berada pada tumbuhan tidak hanya dihasilkan oleh

tumbuhan itu sendiri. Beberapa mikroorganisme endofit yang hidup dalam

tumbuhan menghasilkan berbagai jenis senyawa aktif yang terakumulasi pada

jaringan tumbuhan. Senyawa hasil sintesis bakteri endofit tersebut memiliki

fungsi yang bermacam – macam, diantaranya sebagai senyawa antibakteri,

antifungal, dan fitohormon. Berbagai jenis senyawa bioaktif telah diisolasi dari

mikroorganisme endofit pada tumbuhan. Namun, keragaman jenis senyawa

2

Sandy Ahmad Herdiansyah, 2015

bioaktif yang dapat diproduksi oleh mikroorganisme sangat tinggi sehingga

diperkirakan masih banyak jenis senyawa aktif yang belum tereksplorasi

(Clardy et al., 2006). Keragaman senyawa hasil sintesis mikroorganisme

menunjukkankan potensi mikroorganisme sebagai sumber senyawa bioaktif

dengan fungsi spesifik, diantaranya adalah senyawa antibakteri dan antifungal

(Gunatilaka, 2006)

Eksplorasi senyawa aktif juga dilakukan dengan mempelajari jalur biosintesis

dari senyawa yang dihasilkan mikroorganisme. Kelompok senyawa poliketida

dan peptida nonribosom, atau hibrida antara keduanya merupakan kelompok

senyawa bioaktif yang memiliki aktivitas antibakteri. Kompleks enzim

multimodular Polyketide Synthase (PKS) dan Non Ribosomal Peptide Synthase

(NRPS) merupakan kelompok enzim yang terlibat dalam sintesis kelompok

senyawa aktif poliketida dan peptida nonribosom (Fishbach & Walsch, 2006).

Studi molekuler saat ini banyak berfokus pada pencarian gen yang

mengekspresikan enzim NRPS dan PKS, serta mempelajari evolusi dan

keragaman dari enzim tersebut. Studi juga memprediksi senyawa aktif yang dapat

disintesis oleh enzim yang dihasilkan. Hal tersebut dilakukan karena kedua gen

tersebut memiliki potensi yang besar bagi perkembangan senyawa antibiotik

generasi berikutnya (Amoutzias et al., 2008).

Kompleks enzim pada sistem NRPS mikroorganisme terdiri dari banyak

modul yang rangkaiannya dapat bermacam - macam pada tiap jenis bakteri,

sehingga variasi dari produk peptida nonribosom yang dihasilkan sangat beragam.

Selain itu, substrat asam amino yang digunakan oleh enzim NRPS dalam

mensintesis peptida non ribosom tidak terbatas pada yang digunakan dalam sistem

sintesis protein ribosom. Sintesis protein pada ribosom hanya menggunakan 20

jenis substrat asam amino, sementara enzim NRPS dapat menggunakan 20 asam

amino berikut jenis asam amino yang lain misalnya ornithin dan asetilsteamin.

Kelebihan tersebut menyebabkan kompleks enzim NRPS digunakan oleh

mikroorganisme untuk mensintesis senyawa bioaktif yang bervariasi (Konz &

Marahiel, 1999).

Berdasarkan beberapa penelitian, bakteri endofit yang memiliki karakteristik

3

Sandy Ahmad Herdiansyah, 2015

kompleks enzim NRPS (Neilan et al., 1999 ; Okoro et al., 2009 ; Zhang et al.,

2009) Tumbuhan obat seperti V. zizanioides dan A. conyzoides merupakan habitat

bagi bakteri endofit yang mengkolonisasi jaringan akar tumbuhan. Bakteri endofit

pada tumbuhan obat banyak terdeteksi memiliki gen yang mengekspresikan

kelompok enzim NRPS dan PKS (Miller et al., 2012). Isolat bakteri endofit akar

tumbuhan A. conyzoides dan V. zizanioides diprediksi memiliki gen NRPS yang

berperan dalam produksi senyawa bioaktif, terutama isolat bakteri endofit yang

memiliki aktivitas antibakteri. Untuk mempelajari potensi genetik isolat bakteri

endofit pada kedua akar tumbuhan, perlu dilakukan deteksi gen biosintesis

senyawa aktif, khususnya gen NRPS dengan metode molekuler. Oleh karena itu,

perlu dilakukan studi untuk mempelajari gen NRPS pada bakteri endofit akar

A.conyzoides dan V. zizanioides.

B. Rumusan Masalah

“Bagaimana keragaman gen NRPS pada bakteri endofit akar tumbuhan obat (V. zizanioides dan A. conyzoides) ?”

C. Batasan Masalah

Untuk memfokuskan ruang lingkup penelitian, pembatasan dilakukan pada

parameter :

1. Sampel yang digunakan yaitu lima isolat bakteri endofit akar V. zizanioides dan

empat isolat bakteri endofit A. conyzoides.

2. Analisis yang dilakukan adalah analisis homologi sikuen dan kekerabatan

sikuen NRPS berdasarkan hasil komparasi sikuen dari isolat bakteri yang

terdeteksi memiliki gen tersebut.

3. Primer yang digunakan untuk deteksi gen NRPS adalah pasangan primer

forward – reverse A3F dan A7R (Ayuso-Sacido & Genilloud, 2003).

D. Tujuan

Tujuan dari penelitian yaitu menganalisis keragaman gen NRPS pada bakteri

4

Sandy Ahmad Herdiansyah, 2015 E. Manfaat

1. Memberikan informasi isolat bakteri endofit akar V. zizanioides dan A.

conyzoides yang memiliki gen NRPS.

2. Memberikan informasi mengenai keragaman gen NRPS dari isolat bakteri

endofit V. zizanioides L. dan A. conyzoides.

3. Sebagai pustaka dalam pengembangan penelitian selanjutnya, dalam

pengembangan produk antibiotik dari metabolit sekunder dengan bantuan gen

NRPS yang disintesis dari bakteri endofit.

4. Sebagai tambahan ilmu khususnya dalam bidang mikrobiologi dan biologi

30

Sandy Ahmad Herdiansyah, 2015

BAB III

METODE PENELITIAN A. Desain Penelitian

Penelitian yang dilakukan merupakan penelitian deskriptif. Penelitian

deskriptif membahas secara sistematik suatu fakta dan karakteristik pada populasi

tertentu secara faktual dan akurat (Isaac & William, 1971)

B. Populasi dan Sampel

Populasi dan sampel pada penelitian adalah isolat biakan murni bakteri

endofit akar tumbuhan Ageratum conyzoides L. dan Vetiveria zizanioides L yang

berjumlah sembilan buah. Sampel merupakan hasil isolasi yang dilakukan pada

penelitian sebelumnya (Permatasari, 2011).

C. Waktu dan Lokasi Penelitian

Penelitian dilakukan selama bulan Maret hingga September 2015 di

Laboratorium Mikrobiologi dan Laboratorium Riset Bioteknologi, Departemen

Pendidikan Biologi, Fakultas Pendidikan Matematika dan Ilmu Pengetahuan

Alam, Universitas Pendidikan Indonesia, Bandung.

D. Alat dan Bahan

Peralatan yang digunakan dalam penelitian merupakan yang tersedia di

Laboratorium Mikrobiologi dan Laboratorium Riset Bioteknologi Departemen

Pendidikan Biologi UPI. Daftar alat dan bahan yang digunakan pada penelitian ini

dijabarkan secara rinci pada Lampiran 1.

E. Langkah Kerja

1. Tahap Persiapan

Tahap persiapan meliputi pembuatan medium, sterilisasi alat dan bahan, dan

subkultur bakteri. Medium tumbuh yang digunakan adalah Luria Bertani (LB)

agar dan LB cair yang telah disterilisasi sebelum penggunaan. Sterilisasi

menggunakan alat autoclave pada suhu 121oC selama 15 menit.

31

Sandy Ahmad Herdiansyah, 2015

Subkultur bakteri dilakukan dalam laminar air flow dengan peralatan yang

telah disterilisasi. Sembilan isolat bakteri yang diawetkan pada medium cryo

ditumbuhkan pada medium LB agar steril . Setiap biakan murni diinkubasi pada

suhu 37o C selama 24 jam lalu dipindahkan ke dalam kulkas 4o C. Isolat bakteri ini

digunakan sebagai stok dan disubkultur ke medium agar yang baru pada saat

persiapan isolasi DNA.

2. Isolasi DNA Kromosom

Untuk preparasi isolasi DNA kromosom bakteri, sembilan isolat bakteri

endofit ditumbuhkan selama 18 jam pada medium LB cair. Isolasi DNA dilakukan

dengan metode Wilson (1997). Sebanyak 1,5 ml kultur dipindahkan ke dalam

tabung mikro dan disentrifugasi selama 2 menit pada 10.000 rpm untuk

mendapatkan pelet sel bakteri. Pemisahan sel pelet bakteri dari supernatan

medium terus dilakukan hingga jumlah sel mencapai ± 100 µl. Medium lalu

dibuang sampai habis, dan pelet diresuspensi pada 567 µl TE.

Pelet yang tersuspensi pada TE ditambahkan deterjen 10% SDS sebanyak 30

µl dan proteinase K sebanyak 3 µl. Campuran diinkubasi selama 1 jam pada suhu

37o C. Setelah inkubasi, ditambahkan 100 µl 5 M NaCl, dan 80 µl larutan CTAB.

Sampel diinkubasi pada suhu 65o C selama 10 menit supaya CTAB dapat bekerja

mengikat debris protein dan polisakarida. Lalu ditambahkan larutan kloroform

isoamil alkohol (24 : 1) dan disentrifugasi pada 15.000 rpm selama 5 menit. Fasa

atas yang jernih dipindahkan ke dalam tabung mikro yang baru. Tabung yang

mengandung supernatan lalu ditambahkan ethanol absolut dan disentrifugasi pada

15.000 rpm selama 5 menit untuk mengendapkan DNA. Supernatan dibuang dan

pelet DNA lalu dicuci dengan menggunakan ethanol 70%, disentifugasi selama

15. 000 rpm selama 5 menit. Pelet DNA lalu dikeringkan pada oven, dan

diresuspensi dengan menggunakan pelarut TE sebanyak 50 µl. Selanjutnya

kualitas dan kuantitas DNA diukur dengan metode spektrofotometri dan

elektroforesis.

32

Sandy Ahmad Herdiansyah, 2015

3. Pengukuran Konsentrasi dan Kemurnian DNA

Pengukuran konsentrasi dan kemurnian DNA dilakukan berdasarkan

Sambrook & Russel (2001). Konsentrasi DNA hasil isolasi ditentukan pengukuran

absorbansi DNA untuk panjang gelombang 260 nm dengan menggunakan

spektrofotometer. Konsentrasi DNA yang diperoleh menentukan volume DNA

yang mesti dimasukkan pada tahap PCR. Parameter yang dihitung selain

konsentrasi yaitu kemurnian DNA. Angka kemurnian DNA didapat dengan

menghitung rasio absorbansi pada panjang gelombang 260 dan 280 nm.

Berdasarkan Sambrook et al. (2001), rumus yang digunakan dalam menghitung

kedua parameter adalah sebagai berikut :

(i) Konsentrasi DNA = A260 x faktor pengenceran x 50 (ng/ µl)

(ii) Kemurnian DNA = A260 / A280

4. Elektroforesis DNA

Elektroforesis dilakukan dengan menggunakan alat elektroforesis gel mini.

Dalam penelitian ini elektroforesis digunakan untuk mengecek kualitas DNA

kromosom dan pengecekan amplikon hasil PCR. Langkah kerja dilakukan

berdasarkan Sambrook & Russel (2001) dengan konsentrasi gel berdasarkan

Ayuso-Sacido dan Genilloud (2005). Proses elektroforesis dilakukan pada 1% gel

agarose. Gel agarose dilarutkan dengan konsentrasi 1 % pada buffer TBE 0,5X

dan dihomogenkan dengan pemanasan pada microwave. Gel agarose dalam

kondisi hangat dituangkan pada cetakan yang telah dilengkapi sisir, untuk

membentuk sumur elektroforesis. Gel yang telah dituang dibiarkan hingga

memadat.

Cetakan gel yang telah memadat diletakkan pada kolom elektroforesis.

Kolom elektroforesis telah diisi dengan buffer TBE 0,5X sehingga gel terendam

dengan buffer TBE. Masing – masing sampel amplikon sebanyak 2 µl

dicampurkan dengan 1 µl loading dye lalu dimasukkan ke dalam sumur

elektroforesis yang tersedia.. Sampel dielektroforesis dengan tegangan 80 volt

selama 40 menit.

Visualisasi hasil elektroforesis menggunakan bahan etidium bromida yang

33

Sandy Ahmad Herdiansyah, 2015

Gel yang berisi pita DNA direndam selama 5 menit pada ethidium bromida

dengan konsentrasi 0,5 µg/ml. Gel dibilas selama 3 menit dengan menggunakan

aquades untuk membersihkan kelebihan ethidium bromida. Gel diamati dibawah

sinar UV, lalu didokumentasikan.

5. Amplifikasi DNA

Proses amplifikasi DNA dilakukan dengan metode PCR. Langkah pertama

yang dilakukan adalah mencampurkan bahan PCR dengan volume akhir 50 µl

untuk satu reaksi. Bahan yang digunakan merupakan bagian dari kit DreamTaq

Green Fermentas. Konsentrasi akhir dari setiap bahan adalah 1x Dreamtaq Green

Polymerase; 0,5 µM primer forward; 0,5 µM primer reverse. Jumlah DNA yang

digunakan untuk setiap sampel adalah 200 ng. Primer yang digunakan merupakan

pasangan primer A7F – A3R untuk deteksi gen NRPS (Ayuso – Sacido &

Genilloud, 2004).

PCR dilakukan dengan alat Mastercycler Personal Machine (Eppendorf,

Jerman). Kondisi PCR yang cocok dalam mengamplifikasi gen target dengan

menggunakan pasangan primer A3F – A7R dioptimasi. Kondisi optimum proses

amplifikasi dengan menggunakan primer A3F – A7R yang diperoleh yaitu tahap

predenaturasi awal dengan suhu 95o C selama 5 menit, tahap predenaturasi dengan

suhu 95o C selama 30 detik, tahap annealing dengan suhu 51,5o C selama 1 menit,

tahap elongasi suhu 72o C selama 1 menit 30 detik, tahap elongasi suhu 72o C

selama 10 menit, diakhiri penurunan suhu hingga suhu penyimpanan. Tahap

denaturasi, annealing, dan elongasi diprogram untuk melakukan siklus berulang

sebanyak 35 kali.

6. Sikuensing DNA

Gen target yang teramplifikasi dari sampel lalu disiapkan untuk proses

sikuensing. Sebanyak 40 µl masing – masing amplikon dikirimkan ke Macrogen

inc. Korea untuk disikuensing dengan mesin Sequencer BigDye Applied

34

Sandy Ahmad Herdiansyah, 2015

7. Analisis Data Bioinformatika

Sikuen NRPS yang didapatkan setelah proses sikuensing di-contig. Sikuen

lalu dibandingkan dengan data yang tersedia pada database bank gen pada

National Center for Biotechnology Information (NCBI) untuk mendapatkan

sikuen yang paling homolog dengan sikuen amplikon. Analisis homologi tersebut

dilakukan dengan perangkat lunak BLASTX (www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/).

Seluruh sikuen ditranslasikan menjadi bentuk asam amino dengan pemilihan

reading frame berdasarkan kecocokan hasil BLASTX. Beberapa sikuen gen

NRPS bakteri dan sikuen gen NRPS dari fungi sebagai outgroup diambil dari

database untuk pembuatan pohon filogenetik. Pensejajaran untuk setiap sikuen

gen dilakukan dengan perangkat lunak Clustal X. Hasil pensejajaran dijadikan

data untuk pembuatan pohon filogenetik dengan bantuan perangkat lunak MEGA

versi 5.0. Pada penelitian ini dicari juga domain konservatif pada urutan asam

amino yang diperoleh dengan menggunakan perangkat lunak CDS

(Marchler-Bauer et al., 2015). Selain itu, sikuen isolat bakteri dianalisis secara in silico

untuk memprediksi substrat yang digunakannya dengan menggunakan program

online NRPSpredictor yang tersedia pada laman

35

Sandy Ahmad Herdiansyah, 2015 F. Alur penelitian

Penyusunan Proposal

Tahap Persiapan

Persiapan alat dan bahan yang dibutuhkan

Sterilisasi alat dan medium yang akan

digunakan

Tahap Penelitian

Subkultur bakteri endofit

Isolasi DNA kromosom bakteri endofit

Pengukuran konsentrasi dan kemurnian DNA

Sekuensing

Analisis Data Bioinformatika

Penyusunan Skipsi Amplifikasi Gen NRPS

51 Sandy Ahmad Herdiansyah, 2015

BAB V PENUTUP A. Kesimpulan

Gen NRPS terdeteksi dimiliki oleh tujuh dari sembilan isolat bakteri endofit

akar tumbuhan V. zizanioides dan A. conyzoides. Isolat bakteri endofit tersebut

diantaranya adalah isolat M, O, dan H dari V. zizanioides dan isolat I13, I14, B14,

dan B15 dari A. conyzoides. Analisis menunjukkan ketujuh sikuen yang diperoleh

merupakan bagian domain adenilasi yang termasuk kelompok Superfamili AFD I.

Berdasarkan studi filogenetik, gen NRPS isolat bakteri yang diperoleh dari V.

zizanioides memiliki kekerabatan terdekat dengan gen pada kelompok

Gammaproteobacteria sementara gen NRPS isolat bakteri endofit A. conyzoides

berkerabat dekat dengan gen pada kelompok Firmicutes. Hal tersebut

menunjukkan keragaman yang berbeda antara gen NRPS bakteri endofit yang

berhabitat di akar tanaman V. zizanioides dan A. conyzoides

B. Saran

Dengan hasil penelitian yang diperoleh, terdapat beberapa saran untuk

mengembangkan penelitian terkait untuk menambah wawasan dan pengetahuan

diantaranya yaitu perlu adanya penelitian yang menganalisis klaster gen NRPS

secara utuh hingga ke tingkat modul sehingga jalur biosintesis metabolit sekunder

dapat ditinjau, membuka jalan untuk melanjutkan hingga tingkat ekspresi enzim

52

Sandy Ahmad Herdiansyah, 2015

DAFTAR PUSTAKA

Amadi, B.A., Duru, M.K.C. dan Agomuo, E.N. (2012). Chemical profiles of leaf, stem, root, and flower of Ageratum conyzoides. Asian Jurnal of Plant

Science and Research 2 (4) : 428 – 432

Amoutzias, G.D., Peer, Y.V.dan Mossialos, D. (2008). Evolution and taxonomic distributon of nonribosomal peptide and polyketide synthases. Future

Microbiol. 3 (3) : 361 – 370

Ayuso-Sacido, A. dan Genilloud, O. (2005). New PCR primers for the screening of NRPS and PKS-I systems in actinomycetes : detection and distribution of these biosynthetic gene sequences in major taxonomic groups.

Microbial Ecology 49, hlm. 10 – 24

BPOM RI. 2008. Taksonomi Koleksi Tanaman Obat Kebun Tanaman Obat

Citeureup. Jakarta : Badan Pengawas Obat dan Makanan Republik

Indonesia

Barrill, P. dan Nates, S. (2012). Introduction to agarose and polyacrilamide gel electrophoresis matrices with respect to their detection sensitivities. Dalam Magdeldin, Sameh (Penyunting), Gel Electrophoresis – Principles and Basic (hlm. 3 - 14). Rijeka : InTech.

Caboche, S., Leclere, V., Pupin, M., Kucherov, G. dan Jacques, P. (2010). Diversity of monomers in nonribosomal peptides : towards the prediction of origin and biological activity. Journal of Bacteriology 192 (19) : 5143 – 5150

Cane, David E., Walsh, C.T., dan Kosla, C. (1998). Harnessing the biosynthetic code : combinations, permutations, and mutations. Science 282, hlm. 63 - 68

Chi, F., Shen, S., Cheng, H., Jing, Y., Yanni, Y.G. dan Dazzo, F.B. (2005). Ascending migration o endophytic microbia, from roots to leave inside rice plants and assessment of benefit to rice growth physiology. Applied

and Environmental Microbiology 71 (11) : 7271 – 7278

Cipollini, D., Risby, C.M., dan Barto, E.K. (2012). Microbes as targets and mediators of allelopathy in plants. J. Chem. Ecol. 38 : 714 - 727

53

Sandy Ahmad Herdiansyah, 2015

Clardy, J., Fischbach, M. A., dan Walsh, C.T. (2006). New antibiotics from bacterial natural products. Nature Biotechnology 24, hlm.1541 – 1550

Claverie, J. dan Notredame, C. (2007). Bionformatics for Dummies, Second

Edition. Indianapolis : Wiley Publishing Inc.

Compant, S., Clement, C. dan Sessitch, A. (2010). Plant growth-promoting bacteria in the rhizo- and endosphere of plants : their role, colonization, mechanisms involved and prospect for utilization. Soil Biology &

Biochemistry 42 : 669 – 678

Conqruist, A. (1981). An Integrated System of Classification of Flowering Plants. New York : Columbia University Press

Dafforn, M.R. (1996). Know Your Hedge : Environmental Concerns About

Vetiveria zizanioides. Washington DC : Office of International Affairs,

National Academy of Sciences.

Fauziah, N. (2012). Potensi Bakteri Simbion Endorizosfer Ageratum Conyzoides

L. Sebagai Antagonis Terhadap Mikroorganisme Patogen pada Manusia.

(Skripsi). Fakultas Pendidikan Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Pendidikan Indonesia, Bandung.

Fewer, D.P., Rouhiainen L., Jokela, J., Wahlsten, M.,Laakso, K., Wang, H. dan Sivonen, K. (2007). Recurrent adenylation domain replacement in the microcystin synthetase gene cluster. BMC Evolutionary Biology 7(183) doi: 10.1186/1471-2148-7-183

Finking, R. dan Marahiel, M.A. (2004). Biosynthesis of nonribosomal peptides.

Annu.Rev.Microbiol.58, hlm. 453 – 488

Fishbach, M.A. dan Walsh, C.T. (2006). Assembly-line enzymology for polyketide and nonribosomal peptide antibiotics : logic, machinery, and mechanisms. Chem. Rev. 106, hlm. 3468 – 3496

Fitriany, A., Ihsan, F., Hamdiyati, Y. dan Maemunah. (2015). Antibacteria activity of Shewanella and Pseudomonas as endophytic bacteria from the root of Ageratum conyzoides L. Asian Journal of Applied Sciences 3 (3). ISSN : 2321-0893

54

Sandy Ahmad Herdiansyah, 2015

Franca, L.T.C, Carrilho, E., dan Kist, T.B.L. (2002). A review of DNA sequencing techniques. Quarterly Review of Biophysics 35 (2), hlm. 169 -200

Gallagher, Sean R. (2004). Quantitation of DNA and RNA with absorption and fluorescence spectroscopy. Curr. Protoc. Mol. Biol. 66: A.3D.1-A.3D.12

Giudice, L.D., Massardo, D.R., Pontieri, P., Bertea, C.M., Mombello, D., Carata, E., Tredici, S.M., Tala, A., Mucciarelli, M., Groudeva, V.I., Stefano, M., Vigliotta, G., Maffei, Massimo E. dan Alfano, P. (2008). The microbial community of vetiver root and its involvement into essential oil biogenesis. Environmental Microbiology 10 (10) : 2824 - 2841

Grunenwald, H.. (2003). Optimization of polymerase chain reaction. Dalam Bartlett, J. M.S. dan Stirling, D. (Penyunting), PCR Protocols, Second

Edition (hlm. 89 - 100). New York : Humana Press.

Gunatilaka, A.A.L. (2006). Natural products from plant- associated microorganisms: distribution, structural diversity, bioactivity, and implications of their occurence. J. Nat. Prod. 69(3), hlm. 509 – 526

Harnpicharncai P., Thongaram T., Sriprang, R., Champreda, V., Tanapongpopat, S. dan Eurwilaichitr, L. (2007). An efficient purification and fractionation of genomic from soil by modified troughing method. Letters in Applied

Microbiology 45 : 387 – 391

Isaac, S. dan Michael W.B. 1971. Handbook in Research nd Evaluation. San Diego, California : Edits Publisher

Joshi, M. dan Deshpande, J.D. (2010). Polymerase chain reaction : methods, principles, and application. International Journal of Biomedical Research 1 (5), hlm. 81 – 97

Karan, S.K., Pal, D., Mishra, S.K. dan Mondal, A. (2013). Antihyperglycaemic effect of Vetiveria zizanioides (L.) Nash root extract in alloxan induced diabetic rats. Asian Journal of Chemistry 25 (3) : 1555 – 1557

55

Sandy Ahmad Herdiansyah, 2015

Kohli, R.K., Batish, D.R., Singh, H.P. dan Dogra, K.S. (2006). Status, invasiveness and environmental threats of three tropical American invasive weeds (Parthenium hysteophorus L., Ageratum conyzoides L., Lantana

camara L.) in India. Biological Invasions 8 (7) : 1501 - 1510

Konz, D. dan Marahiel, M.A. (1999). How do peptide synthetae generate structural diversity. Chemistry & Biology 8 (2) : 39 - 48

Lodewyckx, C., Vangronsveld, J., Porteous, F., Moore, E.R.B., Taghavi, S., Mezgeay, M. dan Lelie, D. (2002). Endophytic bacteria and their potential application. Critical Reviews in Plant Sciences 21 (6) : 583 – 606

Luo, C., Liu, X., Zhou, H.,Wang, X. dan Z. Chen. Identification of four NRPS gene clusters in Bacillus subtilis 916 for four families of lipopeptides biosynthesis and evaluation of their intricate functions to the typical phenotypic features. Appl. Environ. Microbiol. doi: 10.1128/AEM.02921-14

Maffei, M. (2002). Vetiveria : The Genus Vetiveria. New York : Taylor & Francis

Magazine, B.C., Nayak, V., dan Pradeep A.N. (2014). Analgesic effect of methanolic extract of Vetiveria zizanioides in wistar rats. Journal of Drug

Discovery and Therapeutics 2 (14) : 1 – 3

Marahiel, M.A. (1997). Protein templates for the biosynthesis of peptide antibiotics. Chemistry and Biology 4, hlm. 561 – 567

Marchler-Bauer A., Derbyshire Myra K., Gonzales N.R., Lu, S., Chitsaz, F., Geer, R.C., He, J., Gwadz, M., Hurwitz, D.I., Lanczycki, C.J., Lu, F., Marchler, G.H., Song, J.S., Thanki, Z.W., Yamashita, R.A., Zhang, D., Zheng, C.

dan S.H. Bryant. (2015). CDD: NCBI’s conserved domain database. Nucleic Acids Research 43 : 222 – 226

56

Sandy Ahmad Herdiansyah, 2015

Ming, L.C. (1999). Ageratum conyzoides : a tropical source of medicinal and agricultural products. Dalam Junick, J. (Penyunting), Perspectives on New

Crops and New Uses (hlm. 469 - 473). Alexandria : ASHS Press

Mooers, A. O. dan Heard, S.B. (1997). Inferring evolutionary process from phylogenetic tree shape. The Quaterly Review of Biology 72 (1) : 31 – 54

Mootz, H.D., Schwarzer, D. dan Marahiel, M.A. (2002). Ways of Assembling complex natural products on modular nonribosomal peptide synthetases.

Chem.Biochem. 3, hlm. 490 – 504

Neilan, B.A., Dittmann E., Rouhiainen L., Bass R.A., Schaub V., Sivonen K., dan Borner, T. (1999). Nonribosomal peptide synthesis and toxigenicity of cyanobacteria. J. Bacteriol. 181(13), hlm. 4089 – 4097

Nongkhlaw, F.M. dan Joshi, S.R. (2015). Horizontal gene transfer of the non-ribosomal peptide synthetase gene among endophyti and epiphytic bacteria associated with ethnomedicinal plants. J. Curr. Microbiol. : 0343-8651 doi : 10.1007/s00284-015-0910

Okoro, C. K., Brown, R., Jones, A. L., Andrews, B. A., Asenjo, J.A., Goodfellow, M., dan Bryan, A.T. (2009). Diversity of culturable actinomycetes in hyper-arid soils of the Atacama Desert, Chile. Antonie van Leeuwenhoek 95, hlm.121 – 133

Okunade, A. L. (2002). Ageratum conyzoides L. (Asteraceae). Fitoterapia 73 : 1 - 16

Palmer, K.L., Kos, V.N. dan Gilmore, M.S. (2010). Horizontal gene transfer and the genomics of enterococcal antibiotic resistance. Curr. Opin. Microbiol. 13(5) : 632 – 639

Parker, D.L., Lee, S., Gezsvain, K., Davis, R.E., Gruffaz, C., Meyer, J., Torpey, J.W., dan Tebo, B.M. (2014). Pyoverdine synthesis by the Mn (II) – oxidizing bacterium Pseudomonas putida GB-1. Front. Microbiol. 5 (202) : 1 -10

Permatasari. (2011). Karakterisasi dan identifikasi molekuler bakteri endofit akar

Vetiveria zizanioides L. (Skripsi). Fakultas Pendidikan Matematika dan

57

Sandy Ahmad Herdiansyah, 2015

Pimentel, M.R., Molina, G., Diosinio, A.P., Junior, M. R. M., dan Pastore, G.M. (2011). The use of endophytes to obtain bioactive compounds and their application in biotransformation process. Biotechnology Research

International, hlm. 1 – 11

Prajapati, R., Roy, S., Mishra, S., Raza, S.K. dan Thakur, L.K. (2014). Formulation development, standardization and antimicrobial activity of

Ageratum conyzoides extracts and their formulation. Int. J. Pharm. Sci. 6 :

369 – 374

Prajna, J., Richa, J., dan Dipjyoti, C. (2013). HPLC quantification of phenolic acids from Vetiveria zizanioides (L.) Nash and its antioxidant and antimicrobial activity. Hindawi Journal of Pharmaceutics : doi 0.1155/2013/270472

Preston, G.M., Haubold, B. dan Rainey, P.B. (1998). Bacteial genomics and adaptation to life on plants : implications for the evolution of pathogenicity and symbiosis. Current Opinion in Microbiology 1 : 589 – 597

Pupin, M., Smail-Tabon, M., Jacques, P., Devignes, M. dan Leclere, V. (2012). NRPS toolbox for the discovery of new nonribosomal peptides and synthetases. JOBIM : 89 – 93

Qin, S., Xing, K., Jiang, J., Xu, L. dan Li, W.. (2011). Biodiversity, bioactive natural products and biotechnological potential of plant-associated endophytic actinobacteria. Appl. Microbiol. Biotechnol. 89, hlm. 457 – 473

Quadt-Hallmann, A., Benhamou, N., dan Kloepper, J.W. (1997). Bacterial endophytes in cotton : mechanisms of entering the plants. Can. J.

Miicrobiol. 43 : 577 – 582

Rahman, M.A., Akter, N., Rashid H., Ahmed, N.U., Uddin, N. dan Islam. M.S. (2012). Analgesic and anti-inflammatory effect of whole Ageratum

conyzoides and Emilia sonchifolia alcoholic extract in animal models. Afr. Jour. Pharm. Pharmacol. 6 (20) : 1469 – 1476

58

Sandy Ahmad Herdiansyah, 2015

Rausch, C., Weber, T., Kohlbacher, O., Wohlleben, W. dan Huson, D.H. (2005). Specitifity predition of adenylation domains on nonribosomal peptide synthetases (NRPS) using transductive support vector machines (TSVMs)

Reddy, P. R. dan Namula, R. (2012). Gel-electrophoresis and its aplications. Dalam Magdeldin, Sameh (Penyunting), Gel Electrophoresis – Principles and Basic (hlm. 3 - 14). Rijeka : InTech.

Rosenblueth, M. dan Martinez-Romero, E. (2006). Bacterial endophytes and their interactions with hosts. Mol. Plant. Microbe. Interact. 19 (8), hlm. 827 – 837

Rottig, M., Medema, M.H., Blin, K., Weber, T., Rausch, C. dan Kohlbacher,O. (2011). NRPSpredictor2 –a web server for predicting NRPS adenylation domain specifity. Nucleic Acid Research 39 : 362 – 367

Ryan, R.P., Germaine, K., Franks, A., Ryan, D.J., dan Dowlig, D.N. (2007). Bacterial endophytes : recent developments and applications. FEMS

Microbiol. Lett. 278 : 1 – 9

Saiki, R.K., Gelfand D.H., Stoffel, S., Scharf, S.J., Higuchi, R., Horn, G.T., Mullis, K.B., dan Erlich, H.A. (1988). Primer – directed enzymtic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science 239, hlm. 487 – 491

Sambrook, J. dan Russell, D.W. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory

Manual, 3rd Ed. Plainview, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Sangeetha, D. dan Stella, D. (2012). Screening of antimicrobial activity of vetiver extracts againts certain pathogenic microorganisms. IJPBA 3 (1) : 197 - 203

Schmid, F. (2001). Biological Macromolecules : UV – visible spectrophotometry.

Encyclopedia of Life Sciences. New York : Macmillan Publishers

59

Sandy Ahmad Herdiansyah, 2015

Singh, S.P., Sharma, S.K., Singh, T. dan Singh, L. (2013). Review on Vetiveria

zizanioides : a medicinal herbs. Journal of Drug Discovery and Therapeutics 1 (7) : 80 - 83

Srivastava, J., Kayastha, S., Jamil, S. dan Srivastava, V. (2008). Environmental properties of V. zizanioides (L.) Nash. Acta. Physiol. Plant 30 : 413 – 417

Strobel, G. dan Daisy, B. (2003). Bioprospecting for microbial endophytes and their natural products. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 67 (4), hlm. 491 – 502

Taechowisan, T. dan Lumyong, S. (2003). Activity of endophytic actinomycetes from roots of Zingiber officinale and Alpinia galanga againts phytopathogenic fungi. Annals of Microbiology 53(3), hlm. 291 – 298

Taghavi, S., Barac T., Greenberg B., Borremans, B., Vangronsveld J. dan Lelie, D. (2005). Horizontal gene transfer to endogeneus bacteria from poplar improves phytoremediation of toluene. App. Environ. Microbiol. 71 (12) : 8500 – 8505

Walsh, C. T. (2007). The chemical versatility of natural-products assembly lines.

Accounts of Chemical Research 41, hlm. 4 – 10

Watson, J.D., Baker., T.A., Bell, S.P., Gann, A., Levine, M., Losick, R., dan Harrison, S.C. (2014). Molecular Biology of the Gene, Seventh Edition. New York : Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Wilson, K. (1997). Preparation of genomic DNA from bacteria. Curr. Prot. Mol.

Biol. 59 : 2.4.1.–2.4.5.

Wyatt, M.A., Wang, W., Roux, C.M., Beasley, F.C., Heinrichs, D.E., Dunman, P.M., dan Magarvey, N.A. (2010). Staphylococcus aureus nonribosomal peptide secondary metabolites regulate virulence. Sciencexpress

doi:10.1126./science1188888

Yilmaz, M., Ozim, C., dan Gok, I. (2012). Principles of nucleic acid separation by agarose gel electrophoresis. Dalam Magdeldin, Sameh (Penyunting), Gel

60

Sandy Ahmad Herdiansyah, 2015

Yuan, M., Yu, Y., Li, H., Dong, N. dan Zhang, X. (2014). Phylogenetic diversity and biological activity of actinobacteria isolated from Chukchi shelf marine sediments in the Arctic Ocean. Mar. Drugs. 12 : 1281 – 1297

Zhang, H.W., Song, Y.C., dan Tan, R.X. (2006). Biology and chemistry of endophytes. Nat. Prod. Rep. 23, hlm. 753 – 771

Zhang, W., Zhiyong, L., Miao X., dan Zhang, F. (2009). The screening of antimicrobial bacteria with diverse novel Nonribosomal Peptide Synthetase (NRPS) genes from South China sea sponges. Mar. Biotecnol. 11, hlm. 346 – 355

Zinniel, D. K., Lambrecht, P., Harris, N.B., Feng, Z., Kuczmarski, D., Higley, P., Ishimaru, C.A., Arunakumari, A., Barletta, R.G., dan Vidaver, A.K. (2002). Isolation and characterization of endophytic colonizing bacteria from agronomics crops and prairie plants. Applied and Environmental