EKSPLORASI GEN POLYKETIDE SYNTHASE DAN IDENTIFIKASI MOLEKULER BAKTERI ENDOFIT AKAR Ageratum conyzoides L.
SKRIPSI
diajukan untuk memenuhi sebagian syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains
Program Studi Biologi
oleh Pina Rosica
NIM 1102319
PROGRAM STUDI BIOLOGI DEPARTEMEN PENDIDIKAN BIOLOGI
FAKULTAS PENDIDIKAN MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS PENDIDIKAN INDONESIA
EKSPLORASI GEN POLYKETIDE SYNTHASE DAN IDENTIFIKASI MOLEKULER BAKTERI ENDOFIT AKAR Ageratum conyzoides L.
Oleh: Pina Rosica
1102319
Sebuah skripsi yang diajukan sebagai salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana pada Fakultas Pendidikan Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
© Pina Rosica 2015 Universitas Pendidikan Indonesia
Hak Cipta dilindungi undang-undang
LEMBAR PENGESAHAN
Eksplorasi Gen Polyketide Synthase dan Identifikasi Molekuler Bakteri Endofit Akar Ageratum conyzoides L.
Oleh Pina Rosica
1102319
DISETUJUI DAN DISAHKAN OLEH: Pembimbing I
Dr. Hj. Any Fitriani, M.Si. NIP. 196502021991032001
Pembimbing II
Dra. R. Kusdianti, M.Si NIP. 196402261989032004
Mengetahui,
Kepala Departemen Pendidikan Biologi
PERNYATAAN
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi dengan judul “Eksplorasi Gen Polyketide Synthase dan Identifikasi Molekuler Bakteri Endofit Akar
Ageratum conyzoides L.” ini beserta seluruh isinya adalah benar-benar karya saya sendiri. Saya tidak melakukan penjiplakan atau pengutipan dengan cara-cara yang tidak sesuai dengan etika ilmu yang berlaku dalam masyarakat keilmuan. Atas
pernyataan ini, saya siap menanggung resiko/sanksi apabila di kemudian hari ditemukan adanya pelanggaran etika keilmuan atau ada klaim dari pihak lain
terhadap keaslian karya saya ini.
Bandung, Oktober 2015
Yang membuat pernyataan
Pina Rosica
EKSPLORASI GEN POLYKETIDE SYNTHASE DAN IDENTIFIKASI MOLEKULER BAKTERI ENDOFIT AKAR Ageratum conyzoides L.
ABSTRAK
Telah dilakukan eksplorasi gen pks dan identifikasi molekuler pada 4 isolat bakteri endofit akar A. conyzoides. Bakteri endofit tanaman obat diketahui memiliki aktifitas antimikroba dari senyawa alami yang dihasilkannya. Gen polyketida synthase (pks) telah banyak digunakan sebagai aplikasi yang memudahkan dalam pencarian obat dari senyawa poliketida. Sementara itu, analisis gen 16S rRNA dapat digunakan untuk identifikasi bakteri secara molekuler. Tujuan dari penelitian ini untuk untuk menganalisis keragaman gen pks dan mendapatkan identitas spesies bakteri endofit akar A. conyzoides. Identifikasi molekuler dilakukan dengan menggunakan gen 16S rRNA yang diamplifikasi oleh pasangan primer 63F-1387R. Sementara itu, gen pks dideteksi dengan menggunakan pasangan primer degenerate DKF-DKR. Analisis filogenetik telah dilakukan dengan merekonstruksi pohon filogenetik dengan menggunakan software MEGA5 dan metode maximum parsimony. Hasil amplifikasi gen 16S rRNA menunjukkan keempat isolat berhasil diamplifikasi dengan ukuran amplikon ±1300bp. Berdasarkan hasil analisis gen 16S rRNA, isolat I13 merupakan strain baru yang memiliki kemiripan dengan Pantoea sp., Isolat I14 merupakan Klabsiella pneumoniae, Isolat B14 merupakan Staphylococcus equorum dan isolat B15 merupakan anggota genus Staphylococcus. Hasil amplifikasi gen pks menunjukkan hanya dua isolat yang berhasil teramplifikasi, yaitu isolat I13 dan I14 dengan ukuran amplikon ±700bp.. Kedua isolat berdasarkan analisis bioinformatik dan filogenetik merupakan gen pks yang memiliki kemiripan dan kekerabatan yang dekat dengan gen pks Bacillus subtilis yang diketahui meghasilkan produk alami yang memiliki aktifitas antimikroba.
THE EXPLORATION OF POLYKETIDE SYNTHASE GENE AND MOLECULAR IDENTIFICATION ENDOPHYTIC BACTERIAL ROOT OF Ageratum conyzoides L.
ABSTRACT
Exploration pks gene and molecular identification to 4 isolates of bacterial endophytes root A. conyzoides has been done. Bacterial endophytes in medicinal plant are known as producer of natural coumpound which has antimicrobial activity. Polyketida synthase (pks) gene had been used in many application which facilitate searching of polyketones coumpound medicine. Meanwhile, 16S rRNA gene analysis can be used to identify bacteria molecularly. The purpose of this research is analysis gene diversity of pks gene and to get species identity bacterial endophytes root of A. c onyzoides. Molecular identification in bacterial endophytes is imploying 16S rRNA gene which using primer 63F-1387R. Pks gene in bacterial endophytes detected with a pair of DKF-DKR degenerate primer. Phylogenetic analysisof 16S rRNA gene has been done by reconstructing phylogenetic tree in MEGA5 software and maximum parsimony method. 16S rRNA gene amplification result showed that DNA segment with ±1300bp length had been successfully amplified from 4 isolates. Based on 16S rRNA gene analysis I13 isolates is a new species which has highest similarity with Pantoea sp. Isolates I14 is Klabsiella pneumonia e, isolates B14 is Staphylococcus equorum and isolates B15 is a member of Staphylococcus genus. Amplification of pks gene showed only isolates I13 and I14 which DNA segment with ±700bp length had been successfully amplified. Sequence in the two isolates are pks gene which have highest similarity and related closely with pks gene in Bacillus subtilis based on bioinformatics analysis. This pks gene has known as natural coumpound producer which has antimicrobial activity
DAFTAR ISI
ABSTRAK……….. i
ABSTRACT……… ii
KATA PENGANTAR……… iii
DAFTAR ISI ….……….. v
DAFTAR TABEL……… vii
DAFTAR GAMBAR……….. viii BAB I PENDAHULUAN……….
A. Latar Belakang……….
B. Rumusan Masalah………
C. Pertanyaan Penelitian………...
D. Batasan Masalah………..
E. Tujuan Penelitian……….
F. Manfaat Penelitian………...
1 1 3 3 3 4 4 BAB II GEN POLYKETIDE SYNTHASE DAN GEN 16S rRNA PADA BAKTERI ENDOFIT AKAR A. conyzoides
A. Ageratum conyzoides L ..……….
B. Polyketide Synthase…….….………...
C. Gen 16S Ribosomal RNA…..…..………
D. Bakteri Endofit……….………..………..
E. Metode Molekuler dalam Eksplorasi Gen …...……… 1. Polymerase Chain Reaction (PCR) ………
2. Elektroforesis………...……….. 3. Sekuensing….………...………..
4. Bioinformatika….……...……….
5 9 13 15 18 18 22 24 27 BAB III METODE PENELITIAN………..
A. Jenis Penelitian……….
B. Populasi dan Sampel Penelitian………. C. Waktu dan Lokasi Penelitian……….
D. Alat dan Bahan……….….
30 30
E. Prosedur Kerja………..
1. Tahap Persiapan………...
2. Tahap Penelitian………...…
a. Subkultur Bakteri ………...………...
b. Isolasi DNA Kromosom………….………...
c. Pengukuran Konsentrasi dan Kemurnian DNA………..
d. Amplifikasi PCR Gen 16S rRNA dan ……..………..
e. Elektroforesis DNA……….
f. Sekuensing DNA………. ……..………
g. Analisis Data Bioinformatika………..
F. Alur Penelitian………..
31 31 31 31 31 32 33 34 34 35 35 BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN………...
A. Isolasi DNA Bakteri Endofit Akar A. conyzoides……… B. Identifikasi Bakteri Endofit Akar A. conyzoides dengan Gen 16S rRNA.. C. Hubungan Filogenetik Gen 16S rRNA Bakteri Endofit Akar A.
conyzoides ……….……….
D. Eksplorasi Gen Pks pada Bakteri Endofit Akar A. conyzoides …………..
E. Hubungan Filogenetik Gen Pks Bakteri Endofit Akar A. conyzoides …
36 35 38 45 48 52 BAB V KESIMPULAN DAN SARAN………....……
A. Kesimpulan……….
B. Saran………
56 56 56
DAFTAR PUSTAKA………... 57
DAFTAR TABEL
Tabel Halaman
4.1 Hasil konsentrasi dan kemurnian DNA bakteri endofit akar A.
conyzoides dengan menggunakan spektrofotometer……… 37 4.2 Hasil alignment nukleotida gen 16S rRNA isolat I13 dengan
menggunakan program Blastn dan Ez Taxon ……….…………. 40 4.3 Hasil alignment nukleotida gen 16S rRNA isolat I14 dengan
menggunakan program nucleotide blast (megablast) dan Ez Taxon
….
42
4.4 Hasil alignment nukleotida gen 16S rRNA isolat B14 dengan
menggunakan program nucleotide blast (megablast) dan Ez Taxon
….
43
4.5 Hasil alignment nukleotida gen 16S rRNA isolat B15 dengan menggunakan program nucleotide blast (megablast) dan Ez Taxon
….
44
4.6 Hasil alignment gen pks isolat I13 dengan program
Blastx……… 50
[image:9.596.115.516.139.506.2]DAFTAR GAMBAR
Gambar Halaman
2.1 2.2
A. conyzoides ………..
PKS Tipe I dalam biosintesis erythromycin ………
5 10 2.3 Tipe modul yang berbeda dari PKS tipe I dan pengaruhnya pada
struktur rangka poliketida …………... 11
2.4 PKS Tipe II dalam biosintesis tetracenomycin ……… 11
2.5 PKS Tipe III dalam biosintesis flavolin ……… 12
2.6 Representasi dari gen 16S rRNA. Warna abu menunjukkan sekuens conserved, dan V1-V9 menunjukkan sekuens variable yang penting dalam analisis filogenetik……… 13
2.7 Perbandingan dendrogram yang dibuat dari sekuens gen 16S rRNA 1500b-p (kiri) atau sekuens gen 16S rRNA 500-bp (kanan) dari beberapa strain Brevibacterium ………... 14
2.8 Tempat kolonisasi tanaman oleh bakteri endofit ……… 16
2.9 Amplifikasi PCR ………. 19
2.10 Pemisahan DNA oleh gel elektroforesis ………. 23
2.11 dideoksinukleotida yang digunakan dalam sekuensing DNA; b. Terminasi rantai karena keberadaan dideoksinukleotida ……… 25
2.12 Gel hasil sekuensing DNA ……….. 26
2.13 3.1 Hasil pembacaan sekuensing DNA ……… Diagram alur penelitian………... 27 35 4.1 Hasil gel elektroforesis isolasi dna isolat bakteri B14, B15, I13, dan I14 dalam 1% (wt/vol) gel agarose dengan komposisi 1µl sampel + 1µl loading dye……….……….. 36
4.2 Gel elektroforesis hasil amplifikasi gen 16S rRNA pada bakteri endofit akar A.conyzoides ……….……… 39
dibuat dengan menggunakan program MEGA5 dan dikelompokkan dengan metode Maximum Parsimony. Bootstrap 1000x
pengulangan.………. 46
4.4 Hasil Elektroforesis amplikon gen PKS dengan primer degenerate
DKF-DKR pada 4 isolat bakteri endofit akar A.conyzoides………… 49 4.5 Hasil multiple alignment gen pks pada isolate I13, I14, dan beberapa
anggota genus Bacillus dengan program ClustalW pada
Bioedit………... 51 4.6 Analisis Filogenetik. Pohon filogenetik sekuens gen PKS dibuat
dengan menggunakan program MEGA5 dan dikelompokkan dengan metode Maximum Parsimony. Bootstrap 1000x
BAB I PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
Penemuan senyawa bioaktif baru dari tanaman obat tradisional saat ini sedang banyak diteliti, berbagai pendekatan ethnoparmacological banyak
dipelajari. Ageratum conyzoides merupakan salah satu tumbuhan obat yang telah banyak digunakan di Asia, Afrika, dan Amerika Selatan. Tumbuhan ini
memproduksi produk alami yang memiliki aktifitas antibakteri, antifungi, insektisidal, dan allelopathic (Okunade, 2012). Selain tanaman yang dapat memproduksi produk alami, bakteri endofit yang berkontribusi dalam bioaktifitas keseluruhan tanaman inang juga mampu memproduksi berbagai produk alami. Bakteri endofit ini dianggap sebagai sumber berharga yang menghasilkan
senyawa bioaktif dan menjadi jalan untuk meningkatkan penelitian pada produk alami. Bakteri endofit tanaman obat juga diketahui memiliki aktifitas antibakteri dan antifungi (Strobel, Daisy, Castillo, & Harper, 2004). Oleh karena itu eksplorasi pada senyawa alami yang dihasilkan oleh bakteri endofit perlu dilakukan untuk bahan analisis dalam pencarian senyawa yang memiliki aktifitas antimikroba yang nantinya dapat digunakan sebagai obat.
Berbagai bidang ilmu turut berperan dalam peningkatan produktifitas produk alami ini. Biologi molekuler yang tengah berkembang pesat saat ini juga
turut berperan penting dalam peningkatan ketersediaan senyawa baru yang dapat dengan mudah diproduksi dalam bakteri atau ragi. Peningkatan senyawa
baru ini dapat dilakukan melalui pendekatan kimia kombinatorial. Pendekatan ini sedang berusaha membuat produk alami yang mirip dengan senyawa obat. Berbagai metode screening sedang dikembangkan untuk mempermudah penemuan produk alami. Harapannya semakin efisien dan efektif aplikasi untuk produk alami maka proses penemuan obat akan semakin meningkat (Harvey, 2008).
Poliketida merupakan salah satu keluarga besar dari produk alami yang ditemukan dalam bakteri, jamur, dan tanaman. Poliketida juga banyak digunakan
2
immunosuppressive, atau anti-kolesterol (Shen, 2003). Beberapa penelitian juga
telah dilakukan untuk mengetahui potensi senyawa ini sebagai obat, diantaranya yaitu bleomycin dari Streptomyces verticillus dan stambomycin yang dihasilkan oleh Streptomyces ambofaciens sebagai obat antikanker (Laureti et al., 2011; Shen
et al., 2001).
Poliketida ini dibentuk oleh bantuan polyketida synthase (PKS). PKS
adalah mega-enzim, multidomain atau kompleks enzim yang menghasilkan berbagai kompleks yang luar biasa dari produk alami mulai dari asam yang
berukuran kecil, seperti asetil CoA, propionil-Co, butiril-CoA dan derivat-derivatnya (Khosla et al, 2014 dalam Fischer, 2014). Pada beberapa penelitian gen
polyketida synthase (pks) telah banyak digunakan sebagai aplikasi yang
memudahkan dalam pencarian poliketida sebagai produk alami untuk obat, seperti yang dilakukan Courtois et al. (2002) yang melakukan screening pada 5.000-klon
pustaka DNA dengan menggunakan PCR dari sekuens yang sama ke gen pks Beberapa penelitian telah memaparkan bahwa sejumlah bakteri endofit dapat mensintesis enzim PKS, namun analisis secara biologi molekuler untuk menganalisis keberadaan gen pks pada bakteri tersebut belum dilakukan. Analisis diversitas dari bakteri endofit pada tanaman yang memiliki potensi antimikroba perlu dilakukan untuk mendapatkan identitas spesies bakteri endofit yang terlibat
didalamnya. Identifikasi jenis bakteri ini dapat dilakukan melalui karakteristik genotif secara molekuler. Identifikasi bakteri secara molekuler yang banyak
digunakan saat ini melalui analisis gen 16S rRNA (Clarridge, 2004). Gen ini banyak digunakan karena memiliki beberapa keuntungan diantaranya gen ini
bersifat universal, hampir ada di semua bakteri dan sekuens gen 16S rRNA memiliki tingkat konservasi yang tinggi, yang menjadi faktor penting untuk membedakan organisme. Oleh karena itu gen 16S rRNA memungkinkan untuk digunakan dalam analisis taksonomi dan filogenetik (Woo, Lau, Teng, Tse, & Yuen, 2008). Empat bakteri endofit dari akar A. conyzoides yang diketahui memiliki aktifitas antibakteri belum diidentifikasi secara molekuler untuk analisis
taksonomi dan filogenetik dari bakteri tersebut.
Berdasarkan latar belakang yang telah dipaparkan, penelitian mengenai
3
dilakukan. Penelitian yang dilakukan difokuskan pada eksplorasi penelitian untuk mengeksplorasi keragaman gen pks dan identifikasi molekuler pada bakteri endofit dari akar A. conyzoides. Hasil analisis gen tersebut diharapkan dapat menambah pengetahuan mengenai diversitas bakteri endofit dalam sistem
biosintesis dan produksi bioaktif dari poliketida.
B. Rumusan Masalah
Berdasarkan latar belakang yang telah dipaparkan sebelumnya, rumusan masalah dalam penelitian ini adalah “Bagaimana keragaman gen pks dan identifikasi gen 16S rRNA pada bakteri endofit A. conyzoides ?”
C. Pertanyaan Penelitian
Rumusan masalah yang telah dipaparkan sebelumnya dijabarkan ke dalam
beberapa pertanyaan penelitian sebagai berikut :
1. Bagaimana hasil identifikasi gen 16S rRNA pada empat bakteri endofit akar A. conyzoides ?
2. Bagaimana hubungan kekerabatan antara gen 16S rRNA yang dimiliki bakteri endofit akar A. conyzoides dengan gen 16S rRNA yang dimiliki bakteri lain yang ada di database?
3. Bagaimana keberadaan gen pks pada empat bakteri endofit akar A.
conyzoides ?
4. Bagaimana hubungan kekerabatan antara gen pks yang dimiliki bakteri endofit akar A. conyzoides dengan gen pks yang dimiliki bakteri lain
yang ada di database?
D. Batasan Masalah
1. Sampel yang digunakan adalah empat isolat biakan bakteri endofit A.
conyzoides. Sampel ini didapatkan dari hasil penelitian sebelumnya dan
dipilih berdasarkan aktivitas antimikroba pada penelitian sebelumnya
(Ihsan, 2011)
2. Analisis yang dilakukan adalah identifikasi dan hubungan kekerabatan
4
gen 16S rRNA dan analisis keberadaan dan hubungan kekerabatan gen
pks pada bakteri endofit akar A. conyzoides. Analisis ini dilakukan
berdasarkan hasil amplifikasi dan komparasi sekuens gen pks dan gen 16S rRNA dari isolat bakteri endofit yang diteliti.
3. Primer yang digunakan untuk amplifikasi gen 16S rRNA adalah pasangan primer 63F-1387R (Marchesi et al., 1998). Primer yang digunakan untuk
amplifikasi gen pks khususnya gen domain ketosynthase adalah primer
degenerate DKF-DKR (Moffit & Neilan, 2002).
E. Tujuan Penelitian
Tujuan dari penelitian ini adalah untuk menganalisis keragaman gen pks dan mendapatkan identitas spesies bakteri endofit akar A. conyzoides berdasarkan gen 16S rRNA.
F. Manfaat Penelitian
Penelitian ini diharapkan dapat memberi beberapa manfaat, diantaranya yaitu :
1. Sebagai sumber infomasi baru tentang jenis bakteri endofit yang ada pada akar A. conyzoides.
2. Menambah biodiversitas bakteri endofit yang ada pada akar A.
conyzoides.
BAB III
METODE PENELITIAN
A. Jenis Penelitian
Metode penelitian yang digunakan pada penelitian ini adalah deskriptif. Penelitian deskriptif bertujuan untuk membuat deskripsi, gambaran, atau lukisan
secara sistematis, faktual, dan akurat mengenai fakta-fakta, sifat-sifat serta hubungan antarfenomena yang diselidiki (Nazir, 2005).
B. Populasi dan Sampel
Populasi yang digunakan dalam penelitian ini adalah bakteri endofit A.
conyzoides. Sampel dari penelitian ini adalah empat isolat biakan bakteri endofit
akar A. conyzoides yaitu I13, I14, B14, dan B15 yang dikultur di Laboratorium
Mikrobiologi, Departemen Pendidikan Biologi Fakultas Pendidikan Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Pendidikan Indonesia. Pemilihan sampel berdasarkan hasil pengujian ektrak potensial antibakteri yang dilakukan pada penelitian sebelumnya yang dilakukan oleh Ihsan (2013).
C. Waktu dan Lokasi Penelitian
Penelitian ini dimulai dari bulan Maret sampai dengan bulan September 2015 dan dilaksanakan di Laboratorium Mikrobiologi dan Laboratorium Riset
Bioteknologi, Departemen Pendidikan Biologi Fakultas Pendidikan Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Pendidikan Indonesia, Jalan Dr.
Setiabudhi 229 Bandung.
D. Alat dan Bahan
Alat dan bahan yang digunakan selama penelitian ini terdapat di Laboratorium Mikrobiologi dan Laboratorium Riset Bioteknologi, Jurusan Pendidikan Biologi Fakultas Pendidikan Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
31
E. Prosedur Penelitian 1. Tahap Persiapan
Sebelum dilakukan penelitian dilakukan pengecekan alat dan bahan yang akan digunakan selama penelitian. Semua alat seperti cawan petri,
tabung erlenmeyer, tip, tabung mikro dan tabung PCR yang digunakan dalam penelitian ini disterilisasi terlebih dahulu untuk mengurangi kontaminasi oleh
organisme lain. Sterilisasi dilakukan dengan menggunakan autoclave selama 15 menit pada suhu 121°C dan tekanan 1,5 atm. Khusus untuk proses PCR
semua tip dan tabung PCR yang akan digunakan harus dalam keadaan baru dan steril. Pada tahap persiapan dilakukan juga pembuatan medium Luria Bertani Agar (LA) untuk subkultur empat isolat bakteri dari cryo dan medium Luria Bertani Broth (LB) untuk subkultur bakteri yang akan digunakan untuk isolasi DNA. Medium Luria Bertani Broth dibuat dengan melarutkan 10g
tryptone, 5g yeast extract, 10g NaCl dalam 1 liter akuades (Sezonov et al.,
2007). Medium yang telah dibuat juga disterilisasi dengan menggunakan
autoclave selama 15 menit pada suhu 121°C dan tekanan 1,5 atm.
2. Tahap Penelitian a. Subkultur Bakteri
Empat isolat bakteri endofit dari penelitian sebelumnya yaitu I13,
I14, B14, dan B15 disubkultur pada medium LA untuk peremajaan. Subkutur bakteri dilakukan dalam laminar air flow yang sebelumnya telah
disinari sinar UV selama 15 menit. Isolat bakteri yang akan disubkultur berasal dari bakteri yang sebelumnya telah diawetkan dalam cryo buffer.
Dilakukan dua kali subkultur untuk mendapatkan koloni biakan murni dari masing-masing bakteri endofit dari akar A. conyzoides dari hasil subkultur
cryo. Setiap isolat diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam kemudian
dipindahkan ke suhu 4°C. b. Isolasi DNA Kromosom
Isolasi DNA dilakukan dengan metode Wilson (1997). Sebanyak
1,5 ml kultur dipindahkan ke dalam tabung mikro dan disentrifugasi selama 2 menit pada 10.000 rpm untuk mendapatkan pelet sel bakteri.
32
hingga jumlah sel mencapai ± 100 µl. Medium lalu dibuang sampai habis, dan pelet diresuspensi dengan menggunakan TE. Pelet ditambahkan deterjen 10% SDS sebanyak 30 µl dan proteinase K sebanyak 3 µl kemudian diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37o C. Setelah inkubasi,
ditambahkan 100 µl 5 M NaCl dan 80 µl larutan CTAB. Sampel diinkubasi pada suhu 65o C selama 10 menit. Suhu 65o C merupakan suhu
optimum bagi kerja CTAB dalam mengikat protein dan polisakarida. Sampel kemudian disentrifugasi pada 15.000 rpm selama 5 menit. Setelah
disentrifugasi terbentuk dua lapisan, lapisan atas (supernatan) dipindahkan ke tabung mikro baru dan ditambahkan RNAse 1010mg/ml sebanyak 1/100 x volume cairan. Setelah itu tabung diinkubasi pada suhu 37o C selama 1 jam. Larutan kloroform isoamil alkohol (24 : 1) ditambahan ke dalam sampel yang telah diinkubasi sebanyak ½ X volume total, kemudian
disentrifugasi pada 15.000 rpm selama 5 menit. Fasa atas yang jernih dipindahkan ke dalam tabung mikro yang baru. Tabung yang mengandung supernatan lalu ditambahkan etanol absolut dan disentrifugasi pada 15.000 rpm selama 5 menit untuk mengendapkan DNA. Supernatan dibuang dan pelet DNA lalu dicuci dengan menggunakan etanol 70% sebanyak 1 x volume total, disentifugasi selama 15. 000 rpm selama 5 menit. Lalu pelet
dikeringkan pada oven, dan diresuspensi dengan menggunakan pelarut TE sebanyak 50 µl. Selanjutnya kualitas dan kuantitas DNA diukur dengan
metode spektrofotometri dan elektroforesis.
c. Pengukuran Konsentrasi dan Kemurnian DNA
Pengukuran konsentrasi dan kemurnian DNA dilakukan dengan menggunakan Spektrofotometer, Genesis Thermoscientific. Penentuan konsentrasi DNA hasil isolasi dilakukan dengan pengukuran absorbansi DNA pada gelombang 260 nm. Kemurnian DNA dilakukan dengan pengitungan rasio absorbansi DNA pada gelombang 260 dan 280 nm. Setelah diketahui konsentrasi dan kemurnian setiap sampel DNA,
dilakukan pengenceran DNA untuk mendapatkan konsentrasi yang baik untuk proses PCR. Konsentrasi ini disamakan dengan tujuan agar kualitas
33
& Russel (2001) konsentrasi DNA yang baik untuk digunakan sebagai
template dalam proses amplifikasi adalah sekitar 1 pg-1 µg.
d. Amplifikasi PCR Gen 16S rRNA dan Pks
Ampifikasi gen 16S rRNA menggunakan pasangan primer
63f-1387r (Marchesi et al., 1998). Amplifikasi gen pks menggunakan pasangan primer DKF-DKR (Moffit & Neilan, 2001). Komposisi mix
PCR yang digunakan terdiri dari 25µL Dream Taq Green Master Mix 1X, 2,5µL forward primer 0,5µM, 2,5µL reverse primer 0,5µM, 1µL template
DNA (100ng), dan 19µL free nuclease water. Semua bahan yang diperlukan dicairkan (thawing), divortex dan dispin terlebih dahulu sebelum digunakan. Kemudian semua bahan mix PCR dihomogenkan dalam tabung pcr, divortex dan dispin kembali selama 5 detik dengan menggunakan sentrifugasi agar semua bahan tercampur secara merata dan
terkumpul di dasar tabung.
Amplifikasi PCR dilakukan dengan Mastercycler Personal Machine (Eppendorf, Jerman). Primer 63f (5’- CAG GCC TAA CAC ATG CAA GTC -3’) – 1387r (5’- GGG CGG WGT GTA CAA GGC -3’) untuk gen 16S rRNA diamplifikasi pada kondisi pra denaturasi pada suhu 95⁰C selama 5 menit, denaturasi pada suhu 94⁰C selama 1 menit, annealing pada suhu 55⁰C selama 1 menit, ekstension pada suhu 72⁰C selama 1 menit, dan ekstension akhir pada suhu 72⁰C selama 10 menit.
Reaksi amplifikasi pada mesin PCR dilakukan selama 25 siklus. Kondisi
ini berdasarkan Marchesi et al. (1998) yang dioptimasi oleh Yusuf (2012). Gen pks diamplifikasi oleh primer degenerate DKF (5’- GTG CCG GTN
CCR TGN GYY TC -3’) – DKR (5’- GCG ATG GAY CCN CAR CAR MG -3’) pada kondisi pra denaturasi pada suhu 94⁰C selama 5 menit,
denaturasi pada suhu 94°C selama 1 menit, annealing pada suhu 52°C selama 1 menit, ekstensi pada suhu 72°C selama 1 menit, dan ekstensi
akhir pada suhu 72°C selama 5 menit. Reaksi amplifikasi pada mesin PCR dilakukan selama 30 siklus. Kondisi ini berdasarkan Moffit & Neilan
34
e. Elektroforesis DNA
Hasil amplifikasi DNA kemudian dianalisis secara kualitatif dengan menggunakan elektroforesis DNA. Elektroforesis dilakukan dengan menggunakan alat elektroforesis gel mini dari Bio-rad. Langkah
kerja dilakukan berdasarkan Sambrook & Russell (2001). Proses elektroforesis dilakukan pada 1% gel agarosa. Gel agarosa dibuat
sebanyak 40 ml setiap kali pencetakan, sehingga diperlukan 0,4g agarosa yang dilarutkan dalam 40mL ddH2O untuk mendapatkan agarosa dengan
konsentrasi 1%. Agarosa yang telah dilarutkan kemudian dididihkan dengan menggunakan microwave hingga agar larut dan berwarna bening. Selanjutnya, gel agarosa didiamkan hingga hangat-hangat kuku lalu dituangkan ke dalam cetakan yang dilengkapi dengan sisir (comb) dan dibiarkan hingga mengeras pada suhu ruang, waktu yang diperlukan
hingga gel agarosa mengeras dengan sempurna kurang lebih 1 jam. Sisir dipasang dengan posisi tegak dan berjarak 0,5-1 mm dari dasar cetakan.
Hasil cetakan gel yang sisirnya telah dilepas, kemudian diletakkan pada kolom elektroforesis dan direndam dengan buffer TAE 1X. Amplikon sebanyak 1 µl dicampurkan dengan 1 µl loading dye, kemudian dimasukkan ke dalam sumur yang terdapat dalam gel pada kolom
elektroforesis. Elektroforesis sampel dilakukan pada tegangan 100 volt selama 40 menit. Gel yang telah dielektroforesis kemudian diwarnai
dengan Ethidium bromide (EtBr) 0,5 µg/ml selama 5 menit, kemudian kelebihan EtBr dibilas dengan menggunakan akuades steril (Sambrook &
Russel, 2001). Gel hasil elektroforesis kemudian diamati di bawah sinar UV (UV transluminator) dan hasil fragmen DNA yang muncul didokumentasikan
f. Sekuensing DNA
Sekuensing DNA dilakukan dengan menggunakan mesin
sequencer BigDye Applied Biosystem yang dilakukan di Macrogen Inc.,
35
g. Analisis Data Bioinformatika
Analisis data bioinformatika dilakukan pada kedua sekuens gen pks dan gen 16S rRNA. Hasil sekuensing setiap sekuens gen pks dan gen 16S
rRNA disejajarkan dan dibandingkan dengan data sekuens gen pks yang terdapat pada GenBank National Center for Biotechnology Information
(NCBI) dan Ez Taxon (http://www.ezbiocloud.net/eztaxon/). Selanjutnya, dilakukan proses alignment dari setiap sekuens dan gen pks menggunakan
program multiple-sequence alignment dari software Clustal X . Analisis filogenetik bakteri endofit tersebut melalui pohon filogenetik yang dihasilkan menggunakan software MEGA5.
F. Alur Penelitian
Tahap Penelitian Tahap Persiapan
Isolasi (subkultur) cryo bakteri endofit akar A. Conyzoides pada medium LB (37o C, 24 jam) dan LA (37o C, 16 jam)
Isolasi DNA Kromosom dengan metode CTAB
Amplifikasi PCR gen 16S rRNA dengan menggunakan pasangan primer 63F-1387R dan amplifikasi gen pks dengan menggunakan
pasangan primer degenerate DKF-DKR
Elektroforesis DNA hasil pada tegangan 100 volt selama 40 menit (1% gel agarosa)
Sterilisasi alat dan medium dengan
Autoclave
Persiapan alat dan bahan penelitian
Analisis Bioinformatik hasil sekuensing
36
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
A. Kesimpulan
Empat bakteri endofit akar A.conyzoides berdasarkan hasil analisis gen 16S rRNA diidentifikasi sebagai K. pneumonia (Isolat I14), strain baru yang
memiliki kemiripan dengan Pantoea sp. (Isolat I13), S. equorum (Isolat B14) dan anggota genus Staphylococcus (Isolat B15). Berdasarakan analisis filogenetik
semua isolat memiliki kekerabatan yang dekat dengan genus yang teridentifikasi. Hasil amplifikasi gen pks menunjukkan hanya Pantoea sp. (Isolat I13) dan
K. pneumoniae (Isolat I14) yang memiliki gen pks dari empat isolat yang
dianalisis. Gen pks kedua isolat ini melalui hasil blast dan analisis filogenetik menunjukkan kemiripan dan kekerabatan yang dekat dengan gen pks Bacillus
subtilis yang diketahui sebelumnya memiliki aktifitas antimikroba. Pantoea sp.
dan K. pneumoniae dari bakteri endofit akar A.conyzoides berpotensi sebagai sumber produksi poliketida.
B. Saran
Berdasarkan hasil temuan ini perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk
mengamplifikasi bagian domain lain yang ada pada gen pks pada bakteri Pantoea
sp. (Isolat I13) dan K. pneumoniae (Isolat I14), karena pada penelitian ini hanya
gen domain ketosynthase yang di amplifikasi. Selain itu, perlu dilakukan penelitian lanjutan untuk mengetahui jenis protein yang diekspresikan oleh
Pantoea sp. (Isolat I13) dan K. pneumoniae (Isolat I14) yang telah terdeteksi
DAFTAR PUSTAKA
Amann, R. I., Ludwig, W., & Schleifer, K.-H. (1995). Phylogenetic Identification and In Situ Detection of Individual Microbial Cells without Cultivation.
Microbiological Reviews, 143-169.
Brady, C., Cleenwerck, I., Venter, S., Vancanneyt, M., Swings, J., & Coutinho, T. (2008). Phylogeny and identification of Pantoea species associated with plants humans and the natural environment based on multilocus sequence analysis (MLSA). Systematic and Applied Microbiology, 1-12.
Bredow, C., Azevedo, J., Pamphile, J., Mangolin, C., & Rhoden, S. (2015). In silico analysis of the 16S rRNA gene of endophytic bacteria, isolated from the aerial parts and seeds of important agricultural crops. Genetics and Molecular
Research, 9701-9721.
Brown, T. (1986). Gene Cloning An Introduction. London: Chapmann and Hall.
Campbell, N. A., Reece, J. B., & Mitchell, L. G. (2008). Biologi Edisi Kedelapan
JJilid 1. Jakarta: Erlangga.
Chelius, M. K., & Triplett, E. W. (2000). Immunolocalization of Dinitrogenase Reductase Produced by Klebsiella pneumoniae in Association with Zea mays L. Applied and Enviromental Microbiology, 783–787.
Chiu, S., Wu, M., Chen, P., Ho, Y., Tai, M., Ho, C., & Yen, J. (2013). Neurotrophic action of 5-hydroxylated polymethoxyflavones: 5-demethylnobiletin and gardenin A stimulate neuritogenesis in PC12 cells. Journal Agricultur Food
Chemistry, 9453-9463.
Clarridge, J. E. (2004). Impact of 16S rRNA Gene Sequence Analysis for Identification of Bacteria onClinical Microbiology and Infectious Diseases.
Clinical Microbiology Reviews, 840-862.
Claverie, J.-M., & Notredame, C. (2007). Bioinformatics for Dummies Second
Edition. Hoboken: Wiley Publishing Inc.
Compant, S., Clément, C., & Sessitsch, A. (2010). Plant growth-promoting bacteria in the rhizo- and endosphere of plants: Their role, colonization, mechanisms involved and prospects for utilization. Soil Biology and Biochemistry, 669-678.
58
Courtois, S. C. (2002). Recombinant Environmental Libraries Provide Access to Microbial Diversity for Drug Discovery from Natural Products. Applied and
Enviromental Microbiology, 49-55.
Dasuki, U. A. (1992). Sistematik Tumbuhan Tinggi. Bandung: Pusat Antar Universitas Ilmu Hayati ITB.
Denyer, S., Hodges, N., Gorman, S., & Gilmore, B. (2012). Pharmaceutical
Microbiology 8th Edition. United Kingdom: Wiley-Blacwell.
Donadio, S., Monciardini, P., & Sosio, M. (2007). Polyketide synthase and nonribosomal peptide synthethase: the emerging view from bacterial genomics. Natural Product Report, 1073-1109.
Dunn, B. C. (2013). Mechanism and Specificity of an Acyltransferase Domain from a Modular Polyketide Synthase. Biochemistry, 1-9.
Everett, K. D., Bush, R. M., & Andersen, A. A. (1999). Emended description of the order Chlamydiales, proposal of Parachlamydiaceae fam. nov. and Simkaniaceae fam. nov., each containing one monotypic genus, revised taxonomy of the family Chlamydiaceae, including a new genus and five new species, and standards. International Journal of Systematic Bacteriology, 415-440.
Fiori, A. C., Schwan-Estrada, K. R., Stangarlin, J. R., Vida, J. B., Scapim, C. A., Cruz, M. E., & Pascholati, S. F. (2000). Antifungal Activity of Leaf Extracts and Essential Oils of some Medicinal Plants against Didymella bryoniae.
Journal of Phytopathology, 483–487.
Fischer, R. (2014). Promiscuity Breeds Diversity The Role of Polyketide Synthase in Natural Product Biosynthesis. Chemistry & Biology Elsevier, 701-702.
Folorunso, A. E., & Awosode, O. D. (2013). Comparative anatomy of invasive and non-invasive species in the family Asteraceae in Nigeria. International
Journal of Biological and Chemical Sciences, 1804-1819.
Harvey, A. L. (2008). Natural Product in Drug Discovery. Drug Discovery Today
Elsevier, 894-901.
Ihsan, F. (2013). Identifikasi Metabolit Sekunder Potensial Antibakteri Pada Bakteri
Endorizosfer Ageratum Conyzoides. Skripsi Sarjana pada FPMIPA UPI
Bandung: tidak diterbitkan.
59
Kamboj, A., & Saluja, A. K. (2008). Ageratum conyzoides L.: A review on its phytochemical and pharmacological profile. International Journal of Green
Pharmacy, 59-68.
Kattar, M. M., Chavez, J. F., Limaye, A. P., Rassoulian-Barrett, S. L., Yarfitz, S. L., Carlson, L. C., . . . Cookson, B. T. (2000). Application of 16S rRNA Gene Sequencing To Identify Bordetella hinzii as the Causative Agent of Fatal Septicemia. Journal of Clinical Microbiology, 789-794.
Laureti, L., Song, L., Huang, S., Corre, C., Leblond, P., Challis, G., & Aigle, B. (2011). Identification of a bioactive 51-membered macrolide complex by activation of a silent polyketide synthase in Streptomyces ambofaciens.
PNAS, 6258-6263.
Marchesi, J. R., Sato, T., Weightman, A. J., Martin, T. A., Fry, J. C., Hiom, S. J., & Wade., W. G. (1998). Design and Evaluation of Useful Bacterium-Specific PCR Primers That Amplify Genes Coding for Bacterial 16S rRNA. Applied
and Enviromental Microbiology, 795–799.
McInroy, J. A., & Kloepper, J. W. (1995). Survey of indigenous bacterial endophytes from cotton and sweet corn. Plant and Soil, 337-342.
McPherson, M. J., & Moller, S. G. (2006). PCR Second Edition. New York: Taylor & Francis Group.
Metsa-Ketela, M., Halo, L., Munukka, E., Hakala, J., Mantsala, P., & Ylihonko, K. (2002). Molecular Evolution of Aromatic Polyketides and Comparative Sequence Analysis of Polyketide Ketosynthase and 16S Ribosomal DNA Genes from Various Streptomyces Species. Applied and Enviromental
Microbiology, 4472–4479.
Miller, C., Garton-Kenny, R. M., Redgrave, B., Sears, J., Condron, M., Teplow, D., & Strobel, G. (1998). Ecomycins, unique antimycotics from Pseudomonas viridiflava. Journal of Applied Microbiology, 937–944.
Moffit, M. C., & Neilan, B. A. (2001). On the presence of peptide synthetase and polyketide synthase genes in the cyanobacterial genus Nodularia. FEMS
Microbiology Letters, 207-214.
Nazir, M. (2005). Metode Penelitian. Jakarta: Penerbit Ghalia Indonesia.
60
Ndip, N. R., Ajonglefac, A. N., Wirna, T., Luma, H. N., Wirmum, C., & Efange, S. M. (2009). In-vitro antimicrobial activity of Ageratum conyzoides (Linn) on clinical isolates of Helicobacter pylori. African Journal of Pharmacy and
Pharmacology, 585-592.
Nolan, T., & Bustin, S. A. (2013). PCR Technology Third Edition . Boca Raton: Taylor & Francis Group.
Okunade, A. L. (2002). Ageratum conyzoides L. (Asteraceae). Fitoterapia, 1-16.
Ridley, C. P., Lee, H. Y., & Khosla, C. (2007). Evolution of polyketide synthases in bacteria. PNAS, 4595–4600.
Rosenbluth, M., & Martinez-Romero, M. (2006). Bacterial Endophytes and Their Interactions with Hosts. MPMI, 827-837.
Ryan, R., Germaine, K., Franks, A., Ryan, D., & Dowling, D. (2008). Bacterial Endophytes : Recent Development and Applications. FEMS Microbiology
Letters, 1-9.
Saleem, M., Nazir, M., Ali, M. S., Hussain, H., & Lee, Y. S. (2010). Antimicrobial natural products: an update on future antibiotic drug candidates. Natural
Product Report, 238–254.
Sambrook, J., & Russell, D. W. (2001). Molecular Cloning A Laboratory Manual
Third Edition. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Sezonov, G., Joseleau-Petit, D., & D’Ari, R. (2007). Escherichia coli Physiology in Luria-Bertani Broth. Journal Bacteriology, 8746-8749.
Shen, B. (2003). Polyketide Biosynthesis Beyond The Type I, II and III Polyketide Synthase Paradigms. Current Opinion in Chemistry Biology, 285-295.
Shen, B., Du, L., Sanchez, C., Edwards, D., Chen, M., & Murrel, M. (2001). The biosynthetic gene cluster for the anticancer drug bleomycin from Streptomyces verticillus ATCC15003 as a model for hybrid peptide– polyketide natural product biosynthesis. Journal of Industrial Microbiology &
Biotechnology, 378-385.
Song, L., Barona-Gomez, F., CoXiang, L., Udwary, D., Austin, M., Noel, J., . . .
Challis, G. (2006). Type III Polyketide Synthase β-Ketoacyl-ACP Starter Unit
and Ethylmalonyl-CoA Extender Unit Selectivity Discovered by Streptomyces coelicolor Genome Mining. Journal American Chemistry
Society, 14754-14755.
61
Sun, L., Qiu, F., Zhang, X., Dai, X., Dong, X., & Song, W. (2008). Endophytic Bacterial Diversity in Rice (Oryza sativa L.) Roots Estimated by 16S rDNA Sequence Analysis. Microbial Ecology, 415–424.
Tamura, K., Dudley, J., Nei, M., & Kumar, S. (2007). MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) Software Version 4.0. Molecular
Biology and Evolution, 1596-1599.
Vega, F. E., Pava-Ripoll, M., Posada, F., & Buyer, J. S. (2005). Endophytic bacteria in Coffea arabica L. Journal Basic Microbiology, 371–380.
Velázquez, E., Rojas, M., Lorite, M. J., Rivas, R., Zurdo-Piñeiro, J. L., Heydrich, M., & Bedmar, E. J. (2008). Genetic diversity of endophytic bacteria which could be find in the apoplastic sap of the medullary parenchym of the stem of healthy sugarcane plants. Journal of Basic Microbiology, 118–124.
Watson, J. D., Baker, T. A., Bell, S. P., Gann, A., Levine, M., & Losick, R. (2013).
Molecular Biology of The Gene Seventh Edition. New York: Benjamin
Cummings.
Wiedenfeld, H., & Räder, E. (1992). Pyrrolizidine Alkaloids from Ageratum conyzoides. Planta Medica, 578-579.
Wilson, K. (1997). Preparation of genomic DNA from bacteria. Bio.Curr. Prot. Mol., 2.4.1.–2.4.5.
Woo, P. C., S. K., Teng, J. L., Tse, H., & Yuen, K.-Y. (2008). Then and now: use of 16S rDNA gene sequencing for bacterial identification and discovery of novel bacteria in clinical microbiology laboratories. Clinical Microbiology Infectious, 908–934.
Yuan, Z.-S., Liu, F., & Zhang, G.-F. (2015). Isolation of Culturable Endophytic Bacteria from Moso Bamboo (Phyllostachys edulis) and 16S rDNA Diversity Analysis. Archieves of Biological Sciences, 1-7.
