1
2
3
4
5
Tahap pendahuluan: Penentuan komponen proksimat
Analisis kadar air (metode No. 950.46), protein (metode No. 928.08), lemak (metode No. 960.39), abu (metode No. 920.153) seperti yang telah ditetapkan dalam standar Association of Official Analytical Chemists, (Anonymous, 2000) dan telah mendapat persetujuan tentang penentuan metode analisis kualitas daging unggas dan disepakati secara Internasional (Petracci dan Baéza, 2011). Kadar karbohidrat ditentukan secara perhitungan by difference (BeMillers, 2003).
Preparasi daging ayam untuk analisis, diawali dengan pembelian ternak ayam pedaging (broiler) dan ayam petelur afkir dari peternakan komersial yang secara random diambil dari kandang. Ayam lokal asli Nusa-Bali dibeli dari beberapa masyarakat yang memelihara ayam secara dilepas di pekarangan rumah sekitar kebun atau di pegunungan dan pada malam hari ditangkap sebagai ayam dewasa untuk dijual (usia ayam tidak diketahui secara detail). Sebelum ayam disembelih, ayam dipuasakan 12 jam, penyembelihan secara konvensional dengan memotong bagian leher, darah dibiarkan keluar sekitar 2 menit, selanjutnya dicelup dalam air panas ( 60oC) selama 2 menit, untuk memudahkan pencabutan bulu dan selanjutnya disiram air kebagian permukaan tubuh ayam. Pengeluararan organ visera dan saluran pencernaan secara manual. Penyiapan karkas dilakukan untuk mengambil bagian dada (muskulus pektoralis major dan minor), selanjutnya dimasukkan dalam kantong plastik, ditempatkan dalam termos berisi es kering untuk dibawa ke laboratorium Universitas, dan di simpan dalam lemari beku (freezer, suhu - 20oC) sebelum dianalisis kimiawi daging ayam segar (Jaturasitha, et al., 2008).
6
1. Penentuan kadar air metode gravimetris (Anonymous, 2000:950.46)
Botol timbang dikeringkan dalam oven (Cole-Parmer) pada suhu 105oC selama 1 jam, kemudian didinginkan dalam desikator lalu ditimbang. Sampel daging ayam atau bebontot daging ayam peteur afkir ditimbang dengan berat 2 g dimasukkan dalam botol timbang dan dioven pada suhu 105oC selama 12 jam.
Setelah didinginkan dalam desikator selama 1 jam, kemudian ditimbang dan proses pemanasan demikian dilakukan kembali sampai mendapatkan berat sampel konstan (selisih penimbangan terakhir dan sebelumnya kurang dari 0,0002 g).
Perhitungan kadar air (% bb) = Z
Y -
X x 100%
Keterangan: X= berat botol timbang dan sampel sebelum dipanaskan dalam oven Y= berat botol timbang dan sampel setelah dipanaskan dalam oven Z= berat sampel basah
7
2. Penentuan kadar protein metode Kjeldhal (Anonymous, 2000:928.08)
Sampel daging ayam atau bebontot daging ayam petelur afkir yang telah dihaluskan ditimbang 2 g dan dimasukkan dalam labu Kjeldahl, ditambah 10 g Na2SO4 anhidrat, Cu So4 (0,1-0,3 g) dan 20 ml H2SO4 pekat, kemudian digojok dan dipanaskan pada pemanas listrik dalam almari asam. Pemanasan mula-mula dengan api kecil dan setelah asap sampel hilang selanjutnya api dibesarkan, dan pemanasan diakhiri setelah cairan sampel berwarna hijau bening. Dibuat perlakuan blanko seperti perlakuan sampel di atas namun tanpa sampel daging. Setelah labu Kjeldhal beserta cairannya menjadi dingin kemudian ditambah 150 ml aquades, 1 g Zn dan 80 ml larutan NaOH 40% dan ditambahkan indikator phenolphtalin 3 tetes.
Selanjutnya sampel didestilasi sampai semua amonia menguap, destilat ditampung dengan erlenmenyer berisi 10 ml asam borat 3%, kemudian dititrasi dengan HCL 0,1 N yang sudah ditambah indikator metyl red sebanyak 15 tetes. Destilasi diakhiri setelah volume distilat mencapai 150 ml. Kelebihan HCL 0,1 N dalam destilat dititrasi dengan larutan basa standar yaitu larutan NaOH 0,1 N.
Kadar protein sampel diperoleh dengan rumus sebagai berikut:
Kadar N total (% bb) =
10 x sampel gram
14,008 x
NaOH N.
x sampel NaOH
blanko NaOH
ml
Kadar protein (% bb) = % N total x faktor konversi (6,25)
8
3. Penentuan kadar lemak metode ekstraksi Soxhlet (Anonymous, 2000:
960.39)
Sampel daging ayam yang telah dihaluskan ditimbang 2 g. sampel dicampur dengan pasir yang telah dipijarkan sebanyak 8 g dan dimasukkan dalam tabung ekstraksi Soxhlet dalam Timble. Pendingin dialirkan melalui kondensor, dan tabung ekstraksi dipasang pada alat distilasi Soxhlet (Hot Plate, Thermolyne type 2200) yang diisi petroleum ether secukupnya selama 4 jam. Setelah residu dalam tabung ekstraksi diaduk, kemudian ekstraksi dilanjutkan lagi selama 2 jam dengan pelarut yang sama. Petroleum eter yang telah mengandung ekstrak lemak dan minyak dipindahkan kedalam botol timbang yang bersih dan diketahui beratnya, kemudian diuapkan dengan penangas air sampai pekat. Pengeringan sampel dalam oven 100oC diteruskan sampai berat konstan yaitu selisih penimbangan terakhir dengan penimbangan sebelumnya kurang dari 0,0002 g. Berat residu dalam botol timbang dinyatakan sebagai berat lemak dan minyak.
9
4. Penentuan kadar abu metode termogravimetris (Anonymous. 2000:
920.153)
Penentuan abu yang mengindikasikan kadar mineral daging unggas dan produk daging unggas merupakan bagian analisis proksimat. Metode untuk penentuan kadar abu daging dan produk daging dapat dikerjakan dalam 2 tahap (i) penambahan larutan magnesium asetat pada sampel otot ( 3 g), selanjutnya dipemanaskan pada suhu 100oC, diikuti pengabuan (Furnace 47900, Barnstead Thermolyne) pada suhu 550-600oC (berat residu dikurangi turunan magnesium oksida dari magnesium asetat yang direpresentasikan sebagai kadar abu): (ii) perbedaan berat sampel setelah pengabuan pada suhu 550oC tanpa penambahan larutan magnesium asetat. Direkomendasikan sampel duplikat dari tiap keseluruhan karkas unggas maupun sampel dalam bentuk produk bebontot daging ayam petelur afkir.
5. Penentuan kadar karbohidrat metode by difference (BeMillers, 2003).
Kadar karbohidrat daging ayam ditentukan secara perhitungan by difference, yaitu dengan cara: 100% - total (kadar air, protein, lemak dan abu), dan diperoleh persentase kadar karbohidrat daging.
10
6. Penentuan perlakuan terbaik (Pemilihan jenis daging ayam terbaik dari 3 jenis daging ayam) menggunakan metode Indeks Efektifitas de Garmo (Susrini, 2003)
Responden (30) diminta pendapatnya tentang urutan (ranking) pentingnya peran variabel yang akan diuji terhadap mutu produk, dengan menggunakan daftar isian (kuesioner). Selanjutnya hasil ranking tersebut ditabulasi, dijumlahkan lalu dirata-rata untuk mengetahui urutan (ranking) masing-masing variabel. Dari hasil ranking tersebut kemudian dihitung bobot variabelnya.
Variabel dengan rata-rata tertinggi diberi bobot 1, sedangkan bobot variabel lain yang diperoleh dari hasil bagi antara rata-rata masing-masing variabel dengan rata-rata variabel ranking 1. Bobot normal dihitung dengan membagi bobot masing-masing variabel dengan jumlah bobot normal masing-masing. Nilai efektifitas (Ne) dihitung dengan rumus sebagai berikut:
Ne =
Selanjutnya nilai hasil (Nh) dihitung dari semua variabel dengan mengalikan Ne dengan bobot normal masing-masing. Nh dari semua variabel untuk masing- masing perlakuan kemudian dijumlahkan. Perlakuan dengan jumlah Nh tertinggi adalah perlakuan yang terbaik.
11
Lembar Pemilihan urutan (ranking) pentingnya peranan variabel terhadap mutu Daging ayam (Susrini, 2003)
Produk : Daging Ayam
Saudara diminta untuk mengemukakan pendapat tentang urutan (ranking) pentingnya peranan kelima variabel tersebut terhadap mutu Daging Ayam dengan mencantumkan nilai 1 – 5 mulai dari kurang penting sampai terpenting.
Variabel Urutan (ranking)
Kadar Air ...
Kadar Protein ...
Kadar Lemak ...
Kadar Abu ...
Kadar Karbohidrat ...
Atas partisipasi saudara, diucapkan terima kasih
12
7. Penentuan profil asam amino daging ayam dan bebontot daging ayam petelur afkir metode HPLC (Anwar Nur, dkkl., 1992; Antoine, et al., 2001).
Pembuatan pereaksi OPA
Larutan stok pereaksi OPA dibuat dengan cara melarutkan 50 mg OPA dalam 4 ml metanol dan yang telah ditambah 2-merkaptoetanol 0,025 ml. Campuran tersebut digojok dengan hati-hati kemudian ditambah larutan Brij-30, 30% sebanyak 0,050 ml dan buffer borat 0,5M, pH = 10,4 sebanyak 1 ml. Larutan ini harus disimpan dalam botol berwarna gelap pada suhu 4oC dan akan stabil selama 2 minggu. Pereaksi derivatisasi dibuat dengan cara mencampurkan 1 bagian larutan stok dengan 2 bagian larutan buffer kalium borat pH 10,4 dan harus dibuat segar setiap hari saat diperlukan untuk analisa.
Fase mobil
Bufer A (Na-asetat anhidrat 0,025 M, pH 6,5; Na.EDTA 0,05 %; Metanol 9,0 % dan THF1 %), kemudian dilarutkan dalam 1 liter air High Pure (HP). Buffer disaring dengan kertas saring Millipore 0,45 mikron dan akan stabil selama 5 hari pada suhu kamar apabila disimpan di dalam botol berwarna gelap yang diisi dengan gas helium atau nitrogen. Buffer B mengandung metanol 95% dalam air (H.P) dibuat dengan cara disaring dengan kertas saring Millipore 0,45 mikron. Larutan akan stabil dalam waktu yang tidak terbatas.
Kondisi alat
Peralatan HPLC dikondisikan sebagai berikut: kolom “Ultra Techspere”, laju alir fase mobil 1 ml/menit, dan digunakan detektor flouresensi. Fase mobil: buffer A (buffer asetat 0,025 M, pH 6,5) dan buffer B (larutan metanol 95%) dengan gradient konsentrasi.
13 Preparasi sampel untuk analisis asam amino
Kadar protein sampel ditentukan dengan metode Kjeldahl. Sampel yang mengandung 3 mg protein dimasukan dalam tabung reaksi Pyrex yang telah dipersiapkan, kemudian ditambah 1 ml larutan HCl 6N. Campuran sampel tersebut dibekukan dalam es kering-aseton dengan menggunakan “freeze dryer” yang dihubungkan dengan pompa vakum, untuk mongering-bekukan sampel.
Udara yang ada dalam sampel yang telah dibekukan, dikeluarkan dengan cara:
tabung reaksi dikeluarkan dari dalam es kering–aseton dan pada saat campuran tersebut mencair, udara yang terlarut dalam sampel akan keluar, jika gelembung udara terlalu banyak atau keluar terlalu cepat, tabung reaksi dimasukkan ke dalam es kering – aseton dan divakum kembali. Cara ini diulangi sampai udara yang ada dalam sampel keluar seluruhnya. Jika gelembung udara masih banyak juga, maka ditambah 1 atau 2 tetes n-oktil alkohol sebagai anti bubbling. Tabung reaksi divakum kembali selama 20 menit, kemudian ditutup dengan cara dipanaskan di atas api sebelum dipanaskan masukkan gas N2 ke dalam tabung reaksi. Ampul yang telah tertutup tersebut dimasukkan dalam oven dan dipanaskan pada suhu 110oC, selama 24 jam. Sampel yang telah dihidrolisis didinginkan pada suhu kamar. Isinya dipindahkan dalam labu evaporator (50 ml), ampul dibilas dengan 2 ml HCl 0,01 N dan dimasukkan dalam labu evaporator. Hal demikian diulangi 2–3 kali. Sampel yang telah dihidrolisis dilarutkan dalam 5 ml HCl 0,01 N, kemudian disaring dengan kertas saring Millipore 0,45 mikron (Whatman). Buffer kalium borat pH 10,4 ditambahkan dengan perbandingan 1:1. Vial kosong dan bersih diisi 5l sampel yang telah dihidrolisis dan ditambah 25 l pereaksi OPA, dibiarkan selama 1 menit agar proses derivatisasi berlangsung sempurna. Sampel diinjeksikan dalam kolom
14
HPLC sebanyak 5 l kemudian ditunggu sampai pemisahan semua asam amino selesai, dan waktu pemisahan yang diperlukan 25 menit.
Catatan: untuk pekerjaan penambahan OPA dan injeksi ke dalam kolom HPLC dapat dilakukan dengan penyampel otomatis (autosampler)
Perhitungan
Konsentrasi asam amino (dinyatakan dalam mol asam amino) dalam sampel dapat dihitung sebagai berikut:
=
x konsentrasi larutan standar asam amino =
x 0,5 mol/ml x 5 ml Persen asam amino dalam sampel adalah :
% Asam amino =
15
8. Penentuan kadar senyawa fenolik total daging ayam dan bebontot daging ayam petelur afkir
Kadar senyawa bioaktif fenolat total sampel daging ayam, dan bebontot daging ayam petelur afkir dianalisa menurut metode dilakukan oleh Jang, et al. (2008) dengan beberapa modifikasi. Tabung reaksi yang telah berisi 5 g sampel ditambah air destilat 15 ml, kemudian disentrifugasi (Centrifuge DAMON IEC HN – SII/IEC Division) pada kecepatan 3000 rpm, selama 2 menit. Selanjutnya ke dalam homogenat tersebut ditambahkan 9 ml kloroform dan diguncang (di vorteks, Thermolyne MAXI MIX PLUSTM) dua sampai tiga kali agar bagian lipida terpisah.
Kadar senyawa bioaktif fenolat total diukur / diestimasikan dengan Folin-Ciocalteu Reagent (FCR) dilakukan dalam air, dalam fase berair (Huang, et al., 2005).
Satu mililiter alikuot tersebut (bagian yang berair) dilakukan pengenceran (1 : 4, volume/volume) kemudian ditambah 0,5 ml larutan Folin-Ciocalteu, dan diikuti dengan penambahan 1 ml larutan 5% natrium karbonat, campuran tersebut di vorteks agar bereaksi dengan sempurna dan dibiarkan 1 jam pada suhu ruang.
Absorbansi diukur dengan menggunakan alat spektrofotometer (SP-870 TURNER BARNSTEAD USA) pada 700 nm. Kadar senyawa bioaktif fenolat total dikuantitatifkan berdasarkan kurva kalibrasi / standar asam galat (dibuat konsentrasi 100 ppm dengan cara menimbang 0,01 gram asam galat dalam seratus milliliter air destilata). Selanjutnya dibuat pengenceran berseri (0, 10, 20, 30 dan 40 ppm) dan ditera pada 700 nm, diperoleh persamaan garis linear y = 0,01x – 0,0078 dengan koefisien regresi R2=0,99. Masing-masing jenis daging ayam diamati 9 kali ulangan dan untuk sampel bebontot diamati 3 kali ulangan pada waktu fermentasi.
Pembacaan absorbansi 2 kali., dan hasil yang diperoleh diekspresikan sebagai ekuivalen miligram asam galat per gram sampel.
16
9. Penentuan aktivitas senyawa antioksidan dengan metode DPPH
Pengukuran penangkapan-radikal 1,1-difenil-2-picrylhydrazyl (DPPH) diestimasikan dari supernatan encer dalam sampel menurut metode Blois seperti yang dilakukan oleh Jang et al. (2008) untuk daging ayam dan produk bebontot; Lin dan Chang (2000) untuk isolat BAL bebontot dengan sedikit modifikasi. Sebanyak 0,1 ml alikuot tersebut (bagian yang berair diambil dari preparasi untuk penentuan senyawa fenolat total) ditambah 50 ml air (pengenceran 150 kali). Kemudian diambil 1,5 ml dan ditambah 1,5 ml larutan DPPH (0,2 mM) dalam metanol, total volume 3 ml siap untuk ditera. Campuran di vorteks dan dibiarkan pada suhu ruang selama 30 menit. Sebagai kontrol diambil 1,5 ml metanol ditambah 1,5 ml larutan DPPH (0,2 mM) dalam metanol.
DPPH 0,2 mM dibuat dengan menimbang 0,008 g DPPH dan dilarutkan dalam 100 ml metanol, dibuat segar. Campuran di vorteks dan dibiarkan pada suhu ruang, selama 30 menit. Pembacaan absorbansi dilakukan 2 kali dengan alat spektrofotometer (SP-870 TURNER BARNSTEAD USA) pada 517 nm.
Untuk isolat BAL (sampel 0 hari dan 5 hari fermentasi) dilakukan filtrasi setelah pengenceran dengan menggunakan filter membran Millipore 0,45 m (Whatman), dan ditera pada spektrofotometer (GENESYS 10S UV-VIS). Aktivitas penangkapan radikal oleh DPPH 0,2 mM diperoleh dari persamaan berikut:
Aktivitas penangkapan radikal = 1 – (
) x 100.
Masing-masing jenis daging ayam segar diamati 9 kali ulangan dan untuk bebontot diamati 3 kali ulangan pada waktu fermentasi.
17
10. Penentuan derajat keasaman (pH) (Anonymous, 2000: 981.12; Jang et al., 2008).
Pengukuran pH sampel daging ayam atau bebontot daging ayam petelur afkir menurut metode Jang et al. (2008). Lima gram daging ayam atau bebontot dihomogenkan dengan 25 ml air destilat, kemudian disaring, dan diukur dengan alat pH meter digital (Model 720 P ISTEK, Inc) yang dilengkapi dengan elektroda, sebelumnya pH tersebut telah dikalibrasi dengan larutan standar pH 7 dan pH 4.
Masing-masing jenis daging ayam diamati 9 kali ulangan dan 3 kali ulangan untuk produk bebontot pada waktu fermentasi dan pembacaan dilakukan 2 kali.
11. Penentuan total asam (Anonymous, 2000: 947.05).
Sebanyak 10 g bebontot daging ayam petelur afkir diblender dengan penambahan akuades sebanyak 100 ml, kemudian disaring dengan kertas saring.
Filtrat yang didapatkan diambil 10 ml dan dititrasi dengan larutan NaOH 0,1 N dengan indikator phenolphtalin hingga mencapai warna merah muda. Total asam dihitung sebagai kadar asam laktat dengan rumus sebagai berikut:
T.A. =
(mg) sampel G
P Laktat x AS.
BM . x NaOH N.
x NaOH
V. x 100%
Keterangan:
V = volume NaOH N = normalitas NaOH
BM = berat molekul asam laktat P = pengenceran
18
12. Penentuan asam lemak daging ayam dan bebontot daging ayam petelur afkir metode GC-MS (Oyugi et al., 2011).
Preparasi sampel daging ayam dan bebontot dicincang bentuk kubus 1,5-2 cm dan dihomogenkan menggunakan penggiling dan dikeringkan dalam oven (50oC selama 12 jam). Sampel kering dihaluskan dengan mortar menjadi bubuk halus secara terpisah, kemudian disaring dengan membran (250 m). Seratus miligram sampel halus dicampur dengan 1 mL (1000 L) metanol absolut atau heksana, kemudian disentrifugasi (Beckman Coulter Avanti JE) pada kecepatan 15000 rpm selama 5 menit pada suhu kamar. 100 L supernatan ditambahkan ke 900 L metanol absolut, kemudian disentrifugasi pada 15000 rpm 5 menit dan dibiarkan pada suhu ruang sebagai yang dijelaskan oleh Oyugi et al. (2011) dengan sedikit modifikasi. Supernatan yang dihasilkan secara langsung digunakan sebagai sampel akhir dan 1 L supernatan siap untuk diinjeksikan ke alat GC-MS yang telah diprogram. Analisis ekstrak sampel dilakukan dengan menggunakan satu set peralatan kromatografi gas (GC) Agilent Technologies 6890 N (G.1540M) (Palo Alto, CA, USA) yang dihubungkan dengan detektor (Agilent Technologies 5973 Inert Mass Selective Detector) untuk menghasilkan data, dilengkapi dengan HP5MS kolom (id.30mx 0,32mm). Spektrum massa yang diperoleh (ionizations mode) pada kondisi dampak elektron (Electron Impact, EI) 70eV dan sumber ion distel 230oC.
Rentang scan pada basis data m/z 40-400. Suhu injektor distel pada 250oC, volume injeksi 1L. Gas helium digunakan sebagai gas pembawa dengan laju alir 1 ml/min.
Oven GC diprogram pada suhu 70oC selama 5 menit dan kemudian suhu dinaikkan 10oC/menit ke 270oC, dari 70 sampai 270oC selama 20 menit, 270oC selama 5 menit. Waktu analisis selama 30 menit. Puncak yang terintegrasi dengan perangkat lunak HP GC Chemstation Operation (rev. A. 08.00 Agilent Technologies).
19
Konsentrasi individu komponen asam lemak yang dinyatakan sebagai persentase dari daerah puncak spektrum massa diperoleh melalui pencarian pustakanya (data base) pada alat tersebut. Analisis struktural berdasarkan pola fragmentasi spektrum massa, dibandingkan langsung pada profil massa spektral data base dari Institut Nasional Standar dan Teknologi (NIST02.L) dan data base wiley.7n.1 (John Wiley and Sons Inc. Agilent Technologies).
20
13. Analisis mikrobiologis daging atau produk bebontot daging ayam
Produk bebontot daging ayam petelur afkir, sampel diuji untuk (1) total mikroba (2) BAL (3) micrococcaceae (4) koliform (5) kapang (6) ragi/khamir. Sepuluh gram masing-masing sampel secara aseptik dipindahkan ke kantong stomacher steril dengan 90 ml larutan garam (Natrium klorida 0,85%). Persiapan dicampur selama 3 menit dalam stomacher. Pengenceran desimal disiapkan, dan analisis berikut dilakukan: (1) total mikroba menggunakan media Plate Count Agar dengan waktu inkubasi selama 48 jam pada 37°C, (2) BAL pada media de Man-ROGOSA Sharpe (MRS) agar, diinkubasi selama 48 jam pada 37°C dalam anaerobik jar atau kondisi oksigen terbatas (2 Gas-Pack amplop, BBL, Baltimore, Maryland, USA), (3) Micrococcaceae pada media Manitol Salt Agar (MSA, PRONADISA, cat.1062) yang diinkubasi selama 48 jam pada 37°C, (4) koliform pada media Eosin metilen blue Agar (EMBA, PRONADISA, cat.1039) diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37°C, (5) ragi dan kapang pada media Malt Extract Agar (MEA, PRONADISA cat.1038) diinkubasi selama 48 jam pada 30oC untuk ragi, namun untuk kapang diinkubasi selama 72 jam pada suhu 30°C. Setelah penghitungan jumlah koloni, data disajikan dalam bentuk rataan standar deviasi.
21
14. Isolasi dan identifikasi BAL dengan sekuensing 16S rDNA
Pembungkus bebontot dibuka secara aseptik, ditimbang 10 g dan dihomogenasi dalam 90 ml 0,85% natrium klorida (Merck, Darmstadt, Jerman) steril.
Pengenceran dalam stomacher (Lab-blender, Seward, London, UK) selama 2 menit,selanjutnya pengenceran serial desimal disiapkan. Total BAL ditentukan setelah 48 jam dalam anaerobik-jar (Gas-Pack, amplop, BBL, Baltimore, Maryland, USA) pada suhu 37oC pada MRS (de Man ROGOSA dan Sharpe) agar (PRONADISA, cat. 1043), setelah ditambah dengan indikator Brome Cresol Purple (BCP). Koloni dipilih secara acak dari petri MRS yang mengandung kurang dari 300 koloni dan pemurnian pada MRS agar dengan menambahkan 1 % kalsium karbonat (Merck) steril (penambahan Ca CO3 ditujukan untuk seleksi BAL) dan diinkubasi dalam anaerobik jar pada suhu 37oC selama 24 jam. Setelah semalam terlihat pertumbuhan BAL, disekitar koloni terlihat zona bening/jernih kekuningan. Kemudian koloni tunggal yang tumbuh diisolasi dengan jarum ose dan kembali ditumbuhkan pada media MRSB yang diinkubasi secara aerob selama 24 jam pada suhu 37 oC.
Pertumbuhan ditandai dengan kekeruhan pada media. Bila sudah tumbuh dilakukan pemeriksaan morfologi menggunakan pewarnaan Gram, kemudian dilihat di bawah mikroskop dan difoto. Selanjutnya diperiksa untuk produksi gas (uji gas dengan memasukkan ose panas ke dalam kultur yang sudah tumbuh, bila timbul gas dideskripsikan heterofermentatif dan tanpa gas disebut homofermentatif); uji katalase dilakukan dengan cara meneteskan H2O2 10% pada kultur, bila muncul gelembung menunjukkan reaksi katalase positif (terbentuknya gas CO2) dan tanpa gelembung rekasi katalase negatif. Hanya Gram-positif, katalase negatif, oksidase/gas-negatif dipilih untuk stok kultur BAL (umur 24 jam, 500 µl) dan disimpan pada suhu -20oC dalam MRSB (PRONADISA,cat.1215) yang mengandung
22
30% gliserol (Panreac, Badalona, Spanyol) steril (500 µl) sebelum diidentifikasi secara molekuler.
Species-specific PCR assays yang digunakan untuk mengidentifikasi strain BAL (Antara et al., 2002) dengan sedikit modifikasi (penggunaan primer terbalik/1541R reverse primer). Secara singkat, dilakukan ekstraksi DNA dengan mengambil koloni tunggal dimasukkan dalam tabung PCR yang ditambah 10 µl air distilat steril dan kemudian ke dalam tabung ditambahkan 90 µl Insta Gene Matrix (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) dan selanjutnya diinkubasi dalam blok pemanas/siklus termal dengan suhu 100oC selama 15 menit, setelah diinkubasi kemudian digojok (vortex) selama 2 menit dan disentrifugasi selama 3 menit pada kecepatan 12.000 rpm. Sampel siap untuk digunakan sebagai template pada amplifikasi DNA dan sebanyak 25 µl yang digunakan pada PCR amplifikasi. . DNA disusun dengan menggunakan 16S r-RNA yang diamplifikasi dengan PCR menggunakan primer maju 9F, GAGTTTGATYMTGGCTCAG, dan primer terbalik 1541R, AAGGAGGTGWTCCARCC. Campuran reaksi dengan total volume 50µl:
berisikan 30µl ddH2O, 5µl MgCl2, 5µl 10X Buffer, 4µl de-oxy-nucleoside-tri-fosfat, 1 µl dari masing-masing primer, 0,25µl Takara Taq Polymerase (Takara Bio Inc, Jepang), dan 5µl sel lisis sebagai template. Kondisi PCR diatur sebagai berikut:
denaturasi pada suhu 98°C selama 20 detik, annealing pada 52°C selama 45 detik, dan perpanjangan pada suhu 72°C selama 2 menit. Sebanyak 30 siklus dilakukan, diikuti dengan waktu perpanjangan akhir selama 4 menit pada 72°C. Produk PCR dimurnikan dengan Gene-aid PCR Fragments Extraction Kit according sesuai dengan instruksi dari pabriknya (Gene-aid, Taiwan). Amplikon disekuensing dengan analisis sekuensing/urutan otomatis (Applied Bio-sistem 3130 DNA Analyzer, Applied Bio- sistem, CA, USA) menggunakan Big-Dye_Terminator Cycle Sequencing Kit v3.1 (Applied Bio-systems). Urutan yang terkait diidentifikasi dengan
23
melakukan pencarian pada urutan database menggunakan Basic Local Alignment Search Tool (BLAST). Data urutan untuk spesies yang terkait diambil dari Gen Bank.
Pembuatan pohon filogenetik dilakukan dengan mengumpulkan keseluruhan sekuen, kemudian dimasukkan dalam program Clustal W, selanjutnya di aligment, kemudian dimasukkan ke program Gendoc, di edit selanjutnya baru masuk ke program Tree view.
24
15. Petunjuk Pelaksanaan Hazard Analysis Critical Control Points pada pembuatan bebontot daging ayam petelur akhir
A. PROSES PEMOTONGAN AYAM
Jenis bahan makanan
dan operasinya
Bahaya
Derajat Bahaya
Ukuran
Kontrol Pemantauan Keparahan
Penyakit Resiko Jenis CCP
Ayam Hidup Kolonisasi oleh Kebersihan
kadang, peristirahatan, kontaminasi feses
Awasi kebersihan feses, serangga dan
binatang pengerat
Salmonella SI H r
Campylobacter SI H r
L monocytogenes SI/MI V r
Y enterocolitica SI L r
Kolonisaasi / Kontaminasi oleh:
C perfringens
MI H r
Pemotongan Pencelupan air panas (scalding)
Penebaran bakteri patogen dari hewan ke hewan
MI/SI L r Temperatur air
pencelup
>58⁰C
Ukur temperatur air, amati penambahan air
Pencabutan bulu
Penyebaran bakteri Pathogen
MI/SI M r
Pengeluran jeroan
Penyebaran bakteri pathogen
MI/SI M r Karkas tidak
terkontaminasi oleh
isi saluran pencernaan
Amati proses
Pencucian
Tidak berhasil mengurangi bakteri pathogen
MI/SI
H
r
Kebersihan air pencuci
Amati kebersihan air
25
B.PENYIAPAN BUMBU
Jenis bahan makanan dan operasinya
Bahaya
Derajat Bahaya Ukuran
Kontrol
Pemantauan
Keparahan Penyakit
Resiko
Jenis CCP Bawang putih
Lengkuas B. cereus MI V/L r Buang yang
Berjamur
Merica B. cereus MI M r Kontrol kualitas
bumbu Ketumbar Jamur Aspergillus
Gula merah Pencucian bumbu
Gagal mengurani patogen pada bumbu
MI-SI H Sumber air
yang bersih dan tidak mengandung pathogen
Sumber air PAM atau air sumur yang diklorinasi
Pengupasan/
Pengirisan
Kontaminasi dari permukaan pisau dan
talenan.
Kontaminasi dari tangan pekerja (mis: S. aureus,
MI-SI V r Kebersihan
alat, higiene pekerja
Amati kebersihan Peralatan Amati pekerja yang
menunjukkan gejala sakit Shigella, Norwalk
dan Hepatitis virus)
Menghaluskan bumbu
Kontaminasi dari peralatan/blender
Kebersihan alat
Amai kebersihan Peralatan
26
C.PROSES PENYIAPAN BAHAN PEMBUNGKUS Jenis bahan
makanan dan operasinya
Bahaya
Derajat Bahaya
Ukuran
Kontrol Pemantauan Keparahan
Penyakit Resiko Jenis CCP
Perendaman daun pinang Pengirisan Pemotongan
Tidak berhasil mengurangi patogen
V r Kebersihan air
Kebersihan alat penirisan Pisau dan Talenan
D.PROSES PENGOLAHAN
Jenis bahan makanan dan operasinya
Bahaya
Derajat Bahaya Ukuran
Kontrol
Pemantauan
Keparahan Penyakit
Resiko
Jenis CCP Karkas ayam Kontaminasi oleh
Salmonella SI H r Proses
pemotongan yang higienis dan
sesuai prosedur
Amati proses pemotongan ayam
Campylobacter SI H r
L monocytogenes SI/MI V r
Y enterocolitica SI L r
C perfringens MI H r
Pemberian bumbu
Kontaminasi patogen dari bumbu (B.
cereus)
MI-SI H r Kebersihan
persiapan bumbu Kebersihan peralatan Kesehatan pekerja
Kontrol kebersihan persiapan bumbu dan alat Kontaminasi dari
Wadah
MI V r
Kontaminasi dari tangan pekerja (Staph.
aureus, S. typhi, Norwalk, Hepatitis virus)
MI-SI H r
Pencucian Kontaminasi dari air
(S. typhi, Shigella, Vibrio)
MI-SI H r Kebersihan air Periksa
sumber air yang digunakan Klorinasi air sumur
Pembungkusan Kontaminasi dari bahan
pembungkus
LI L p
27
Penjemuran/
Pengeringan
e Temperatur cukup untuk
membunuh sel vegetatif, parasit dan virus
Periksa suhu tengah ayam
Pendinginan Temperatur tidak cukup dingin untuk menghambat pertumbuhan pathogen
MI-SI V p Penurunan
suhu dengan cepat Terpisah dari bahan mentah
Penyimpanan
Pertumbuhan bakteri
patogen selama suhu
kamar
Temperatur
dan lama penyimpanan
Temperatur penyimpanan dalam lemari es Gilir stok
Ket:
LI : Mengancam kehidupan (life-threating illnesses) SI : Parah/ Kronis (Severe illnesses)
MI : Penyakit sedang (Moderate illnesses) H : Berisiko tinggi (high)
M : Berisiko sedang (moderate) L : Berisiko rendah (low) N : Dapat diabaikan (negligible) V : Situasi risiko bervariasi (Varied)
CCPe : Titik control dimana bahan berbahaya dapat dihilangkan CCPr : Titik control dimana bahan berbahaya dapat dikurangi,
diminimalkan tetapi tidak dapat dihilangkan atau dicegah CCPp : Titik control dimana bahan berbahaya dapat dicegah
