17 III. METODOLOGI PENELITIAN
A. BAHAN DAN ALAT
1. Bahan
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain media penyegaran mikroba, media pertumbuhan, media pemupukan mikroba, pengencer, medium pemanas, dan bahan pewarnaan gram. Media penyegaran dan medium pemanas yang digunakan dalam penelitian ini adalah Trypticase Soya Broth (TSB). Agar miring Tryptose Soya Agar (TSA (Oxoid)) sebagai media pertumbuhan, pemupukan bakteri Staphylococcus aureus menggunakan media Baird Parker Agar (BPA (Difco)) dan egg yolk tellurite. Untuk media pengeceran, digunakan Butterfield’sPhosphate Buffered (BPB). Pembuatan pengencer Butterfield’sPhosphate Buffered (BPB) dapat dilihat pada Lampiran 4. Pewarnaan gram menggunakan kristal violet, lugol, alkohol 96 % dan safranin. Isolat yang digunakan dalam penelitian ini adalah isolat asal ayam suwir, nasi uduk dan isolat klinis ATCC 25923 yang diisolasi dari orang sakit. Kesemua isolat merupakan koleksi Laboratorium SEAFAST CENTER IPB. Digunakan tiga isolat Staphylococcus aureus asal ayam suwir hasil isolasi (Dwintasari, 2010), tiga isolat Staphylococcus aureus asal nasi uduk dan dua isolat Staphylococcus aureus jari tangan yang diiolasi oleh (Apriyadi, 2010) (Tabel 8.). Bahan lain yang digunakan adalah air destilata, dan alkohol 70%.
Tabel 8. Isolat Staphylococcus aureus yang digunakan dalam pemilahan galur cepat
No. Kode Isolat Sumber
1. AS2 Ayam Suwir
2. AS3 Ayam Suwir
3. AS4 Ayam Suwir
4. NU1 Nasi Uduk
5. NU2 Nasi Uduk
6. NU3 Nasi Uduk
7. J1 Jari Tangan
8. J2 Jari Tangan
2. Alat
Peralatan yang digunakan meliputi waterbath shaker (penangas air), erlenmeyer (pyrex), termometer, inkubator 35°C, refrigerator, vorteks, neraca analitik, keranjang alat, tabung reaksi bertutup, rak tabung, mikropipet, magnetik stirer, botol semprot, bunsen, gelas piala, labu takar, cawan, jarum ose, sendok, sudip, pengaduk gelas, aluminium foil, dan sarung tangan.
18 B. TAHAPAN PENELITIAN
Penelitian ini terbagi menjadi tiga tahap yaitu tahap pemilahan cepat isolat Staphylococcus aureus, studi ketahanan panas isolat Staphylococcus aureus hasil pemilahan cepat isolat, dan tahap evaluasi kecukupan termal proses pemasakan pada warung siap santap di Desa Babakan Raya. Tahapan pemilahan cepat bertujuan menyeleksi isolat lokal Staphylococcus aureus yang mengalami penurunan jumlah koloni mendekati 2 siklus log setelah pemanasan pada suhu 540C selama 35 menit. Pada tahap ini akan dipilih maksimal satu isolat untuk masing-masing isolat dari sumber yang sama. Studi ketahanan panas isolat Staphylococcus aureus hasil pemilahan cepat dilakukan untuk menentukan parameter ketahanan panas yaitu nilai D dan nilai Z. Tahap evaluasi kecukupan proses termal bertujuan untuk menilai keefektifan proses pemasakan dalam mereduksi jumlah mikroba. Secara garis besar, skema penelitian ketahanan panas Staphylococcus aureus disajikan dalam (Gambar 5).
Gambar 5. Skema penelitian ketahanan panas isolat lokal Staphylococcus aureus
1. Pemilahan Cepat Isolat Lokal Staphylococcus aureus
Pemilahan cepat isolat lokal Staphylococcus aureus bertujuan menyeleksi isolat Staphylococcus aureus yang paling tahan panas yang selanjutnya digunakan dalam uji ketahanan panas. Pemilahan galur cepat dilakukan berdasarkan prisnsip pengujian ketahanan panas Stumbo Murphy, yaitu pencawanan bakteri sebelum dan setelah pemanasan pada interval waktu tertentu. Suhu pemanasan 54 °C selama 35 menit dipilih dalam tahapan ini. Pemilihan suhu ini berdasarkan percobaan ketahanan panas isolat S-18 (Walker dan Harmon,1966). Penelitian tersebut menghasilkan persamaan kurva nilai Z, Y= 14,90-0,253X dengan nilai Z sebesar 3,95. Staphylococcus aureus pada medium TSB memiliki nilai D sebesar 17,5 menit pada suhu 54 °C, sehingga jika dilakukan pemanasan
Pemilahan Cepat Isolat Staphylococcus aureus 1. Persiapan inokulum
2. Persiapan heating menstruum
3. Uji Ketahanan Panas untuk Pemilahan Cepat Isolat Staphylococcus aureus
Studi Ketahanan Panas Isolat Staphylococcus aureus Hasil Pemilahan Cepat Isolat
1. Persiapan inokulum
2. Persiapan heating menstruum
3. Uji Ketahanan Panas Hasil Pemilahan Cepat Isolat Staphylococcus aureus pada 53, 54, 55, dan 56°C
Evaluasi Kecukupan Termal Proses Pemasakan pada Warung Siap Santap di Desa Babakan Raya
1. Survei suhu dan waktu pemasakan pada warung siap santap
2. Penentuan kecukupan termal proses pemasakan pada warung siap santap di Desa Babakan Raya
19
selama 35 menit diharapkan telah terjadi penurunan jumlah koloni sebesar dua siklus log, penurunan ini terjadi pada waktu yang tidak terlalu singkat jika dibandingkan dengan suhu percobaan lainnya dan telah mampu menurunkan jumlah mikroba secara signifikan, sehingga suhu inilah yang dipilih untuk tahapan pemilahan cepat isolat.
a. Persiapan Inokulum
Bakteri uji yang akan diinokulasikan ke dalam sampel harus dalam kondisi fase log akhir. Inokulasi dilakukan pada kultur yang telah mencapai fase log akhir (stasioner) sebab menurut Jay (2006); Fardiaz (1992); dan Ray dan Bhunia (2008) sel yang berada pada fase log akhir (stasioner) lebih resisten terhadap berbagai jenis stress. Berdasarkan kurva pertumbuhan Dwintasari (2010) fase log akhir Staphylococcus aureus diperoleh dengan cara memindahkan kultur dari agar miring TSA dengan ose ke dalam 9 ml TSB kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu 35°C. Pada fase log akhir ini jumlah bakteri Staphylococcus aureus diperkirakan (ca) 1,0x108 -1,0x109 CFU/ml (Dwintasari, 2010). Jika akan digunakan kembali, kultur awetan pada TSA dipindahkan dengan ose ke dalam 9 ml TSB lalu diinkubasi selama 24 jam pada suhu 35°C. Suspensi kultur ini juga digoreskan pada agar miring TSA sebagai stok. Setelah diinkubasi, suspensi yang dihasilkan diencerkan dengan mengambil 1 ml susupensi kultur kemudian dimasukkan ke dalam 9 ml Trypticase Soya Broth (TSB) yang telah dipanaskan dalam waterbath sesuai dengan perlakuan.
b. Persiapan Heating Menstruum (Tryptose Soy Broth)
Pembuatan heating menstruum (Tryptose Soy Broth) sesuai dengan petunjuk yang tertera pada wadah bahan. Sebanyak 9 ml media TSB selanjutnya dimasukkan ke dalam erlenmeyer 50 ml. TSB yang telah dibuat kemudian disterilisasi pada suhu 121°C selama 15 menit.
c. Uji Ketahanan Panas untuk Pemilahan Cepat Galur Isolat Staphylococcus aureus
Waterbath shaker diatur sampai suhu dalam heating menstruum TSB mencapai 54°C. Untuk mengetahui suhu heating menstruum digunakan termometer yang ditempatkan pada medium pemanas kontrol. Suspensi kultur yang telah mencapai fase log akhir kemudian dimasukkan ke dalam 9 ml heating menstruum TSB. Pada fase log akhir ini jumlah bakteri Staphylococcus aureus diperkirakan (ca) 1,0x108-1,0x109 CFU/ml. Mikroba awal yang digunakan untuk pemanasan adalah diperkirakan (ca) 1,0x107-1,0x108 CFU/ml. Suhu ini dipertahankan sampai 35 menit. Setelah pemanasan selesai dilakukan pendinginan pada air mengalir untuk mencegah terjadinya pemanasan lanjutan. Selanjutnya dilakukan pengenceran dari 10-2-10-4 kemudian dilakukan pencawanan pada media agar TSA (Tryptose Soy Agar). Inkubasi dilakukan selama 48 jam pada suhu 35 °C. Pengenceran dan pencawanan juga dilakukan untuk suspensi pada fase log akhir untuk menentukan jumlah awal mikroba. Perhitungan jumlah koloni dilakukan untuk melihat beberapa isolat yang dapat bertahan dalam jumlah paling signifikan setelah perlakuan pemanasan. Isolat Staphylococcus aureus terpilih akan digunakan dalam uji utama ketahanan panas.
20
2. Studi ketahanan Panas Isolat Staphylococcus aureus Hasil Pemilahan Cepat Isolat a. Uji Ketahanan Panas
Erlenmeyer yang digunakan berjumlah enam buah untuk uji ketahanan panas. Satu erlenmeyer digunakan sebagai kontrol yang didalamnya ditempatkan sebuah termometer 1000C, dan lima erlenmeyer lainnya untuk uji ketahanan panas.
Suhu 53, 54, 55, dan 56°C akan diujikan pada ketiga isolat Staphylococcus aureus yang telah lolos tahap pemilahan cepat isolat. Masing-masing erlenmeyer berisi 9 ml Trypticase Soya Broth (TSB) dipanaskan dalam waterbath shaker sesuai dengan suhu perlakuan. Setelah suhu perlakuan tercapai diinokulasikan 1 ml suspensi Staphylococcus aureus, kecuali satu erlenmeyer yang dijadikan sebagai kontrol suhu waterbath shaker. Tercapainya suhu perlakuan dapat dilihat dari erlenmeyer kontrol.
Suspensi awal dalam heating menstruum diperkirakan (ca) 1,0x107 -1,0x108 CFU/ml.
Selanjutnya keenam erlenmeyer dipanaskan kembali dalam waterbath shaker kemudian dilakukan holding pada suhu tersebut hingga interval waktu pencawanan 5, 7, 10, dan 15 menit. Setelah pemanasan mencapai waktu tersebut dilakukan pengenceran dari 10-2-10-6 kemudian dilakukan pencawanan pada media agar BPA (Baird-Parker Agar) + egg yolk tellurit. Inkubasi dilakukan selama 48 jam pada suhu 35°C. Pengenceran dan pencawanan juga dilakukan untuk suspensi kultur pada fase log akhir untuk menentukan jumlah awal mikroba
b. Pengamatan dan Hitungan Cawan
Menurut (Tatini et al., 1984) dan Bennett (1984b), koloni Staphylococcus aureus pada media Baird Parker Agar (BPA) yang ditambahkan dengan egg yolk tellurite berbentuk bulat, licin dan halus, cembung, lembab, berdiameter 2-3 mm, berwarna abu-abu hingga hitam pekat, dikelilingi batas berwarna terang, serta dikelilingi zona keruh dengan batas luar berupa zona jernih (Gambar 6.). Konsistensi koloni seperti mentega jika disentuh dengan ose. Cawan yang mengandung 25-250 koloni dipilih untuk perhitungan.
Gambar 6. Koloni Staphylococcus aureus pada media BPA(Atlas, 2010)
Koloni Staphylococcus aureus yang tumbuh pada BPA+ egg yolk tellurite dihitung dan dikalkulasikan dengan rumus Standard Plate Count:
21
N = E C
[(1*n1) + (0,1* n1) + ...] * (d)
Dimana N = Jumlah koloni per ml atau per gr produk E C = Jumlah semua koloni yang dihitung n1 = Jumlah cawan pada pengenceran pertama n2 = Jumlah cawan pada pengenceran kedua d = Pengenceran pertama yang dihitung c. Penghitungan
Penghitungan jumlah bakteri dilakukan setelah inkubasi bakteri selama 48 jam pada suhu 350 C. Jumlah bakteri dinyatakan dalam CFU/ml. Penghitungan Nilai D dilakukan dengan memplotkan grafik pertumbuhan bakteri dimana kurva Y menyatakan jumlah koloni yang hidup (log CFU) dan kurva X menyatakan selang waktu setelah pemanasan. Dari kedua data ini dibuat kurva kecepatan kematian Staphylococcus aureus pada empat suhu berbeda (53, 54, 55, dan 56°C) lalu dilakukan perhitungan nilai D atau waktu reduksi desimal, yaitu waktu pemanasan pada suhu tertentu yang menyebabkan kematian sel sebanyak 90 persen (Fardiaz , 1992). Nilai D untuk masing-masing suhu diperoleh dari persamaan D = -1/slope.
Berdasarkan nilai D pada suhu percobaan dibuat kurva thermal death time (TDT) yang menunjukkan hubungan antara nilai D (dalam menit) pada skala logaritmik dengan suhu (°C). Penentuan nilai Z diperoleh dari kurva ini, yaitu interval suhu dalam °C yang dibutuhkan oleh kurva TDT untuk melewati satu siklus log atau sebesar sepersepuluh kalinya (Fardiaz , 1992).
3. Evaluasi Kecukupan Termal Proses Pemasakan pada Warung Siap Santap di Desa Babakan Raya
a. Survei Suhu dan Waktu Pemasakan pada Warung Siap Santap
Survei dilakukan di Desa Babakan Raya, Darmaga, Bogor. Survei ini mencakup responden sebanyak 16. Responden merupakan penjual makanan siap santap pada warung pangan siap saji. Jenis makanan yang diukur suhunya ditentukan berdasarkan makanan yang dimasak pada saat dilakukan suvei. Survei dilakukan dengan cara mengukur suhu pemasakan selama kurang lebih 8 menit dengan menggunkan termometer 1100C dan termometer 2100C. Termometer dimasukkan ke dalam bahan pangan yang dimasak sampai kedalaman 0,5-1 cm. Survei juga dilakukan pada penjual/pemilik warung untuk mengkonfirmasi lama pemasakan.
Data kombinasi waktu dan lama pemasakan ini akan digunakan untuk mengevaluasi kecukupan termal proses pemasakan
b. Penentuan kecukupan termal proses pemasakan pada warung siap santap di Desa Babakan Raya
Keefektifan proses pemanasan diperoleh dengan cara mengekstrapolasi persamaan nilai Z yang didapatkan dari uji ketahanan panas isolat Staphylococcus aureus untuk mendapatkan nilai DT (nilai D pada suhu pemasakan) yang diperoleh
22
dari hasil survei. Persamaan nilai Z, Y = aX + b, dimana sumbu Y menyatakan log nilai D dan sumbu X menyatakan suhu pemanasan. Penurunan jumlah log Staphylococcus aureus setelah pemasakan dihitung dengan menggunakan rumus (log N0/Nt)= tT/DT. Simbol tT menunjukkan lama pemasakan dan DT menunjukkan nilai D mikroba pada suhu pemasakan. Penghitungan kecukupan termal proses pemasakan yang diperoleh dari hasil survei dilakukan dengan mengasumsikan bahwa jumlah awal Staphylococcus aureus pada bahan pangan sebesar 103 CFU/gr. Peluang kontaminasi Staphylococcus aureus pada bahan pangan diketahui dari jumlah Staphylococcus aureus setelah pemasakan (Nt). Menurut BPOM (2004) batas maksimum cemaran mikroba dalam produk pangan adalah sebesar 0-5x103 CFU/gr.
Proses pemasakan dianggap cukup efektif jika setelah pemasakan jumlah Staphylococcus aureus (Nt) mampu direduksi sampai level 0-5x103 CFU/gr.
