SISTEM INDUKSI UNTUK MEMPRODUKSI ENZIM
PROTEOLITIK EKSTRASELULER OLEH SEL E. Coli, SALAH
SATU CARA DALAM PENANGULANGAN LIMBAH TAMBAK
UDANG YANG BERUPA PROTEIN SEDIMEN
Harlinah SPWJurusan Kimia FMIPA Universitas Sumatera Utara
Jl. Bioteknologi No. 1 Kampus USU Medan 20155
Abstrak
Seperti halnya episin yang dapat mendegradasi protein sedimen tambak udang (0,374% kandungan proteinnya) akibat akumulasi sisa pakan udang yang membentuk sedimen, ternyata E. Coli mampu memproduksi enzim proteolitik ekstraseluler melalui sistem induksi oleh protein sedimen.
Setelah dilakukan penelitian untuk menggantikan peranan episin, enzim proteolitik ekstraseluler itu memiliki aktifitas potensial pada kondisi pH optimum = 6,5 (buffer fosfat 0,058 M), suhu optimum = 35oC dengan lama inkubasi optimum = 30 menit dan hasil aktivitas spesifiknya = 0,0416 u/mg protein enzim.
Kandungan protein dalam larutan enzim proteolitik ekstraseluler yang diekstraksi secara sentrifugasi pada 5000 rpm dengan suhu 4oC selama 20 menit 0,35152 mg / ml.
Pengujian aktivitas enzim proteolitik ekstraseluler itu adalah bertahap Bovin, Serum Albumin (BSA) sebagai substrat senyawa protein murni.
Adapun cara penanggulangan limbah protein sedimen tambak udang dilakukan dengan mengencerkan sedimen secara 3 : 2 (v/v) dan juga dilakukan penggantian petakan – petakan tambak guna membersihkan air dari mitoksin dan E. Coli dengan menggunakan air laut plus air kapur.
PENDAHULUAN
Udang merupakan salah satu komoditi di sub sektor yang diharapkan dapat meningkatkan sumber devisa negara.
Peningkatan produksi udang di Indonesia dilakukan dengan cara budidaya udang berpola intensif, dimana pola ini udang dapat dipanen setiap bulan yang hanya dimungkinkan dengan petakan – petakan tambak.
Meskipun sistem budidaya udang itu memiliki keunggulan namun ada juga permasalahan, yaitu: air tambak cepat mengalami kekeruhan yang disebabkan oleh pakan udang yang bersisa membentuk sedimen, dimana pakan mengandung sedimen protein 30 – 40% (Buwono, 1993)
Protein sedimen tersebut merupakan media pertumbuhan mikroorganisme dengan memproduksi mitotoksin yang akan menyebabkan keracunan pada udang. Selama ini protein para pengusaha tambak udang mengundang episin yang diimpor dengan harga yang sangat mahal dan episin ini berperan dalam mengurangi kematian udang yaitu dengan mendegradasi protein sedimen.
Karena itu perlu dilakukan penelitian guna menggantikan peranan episin yaitu menggunakan sel E. coli yang mampu memproduksi enzim proteolitik ekstraseluler dalam sel E. coli terjadi setelah diinduksi oleh protein sedimen sesuai dengan teori induksi enzim yang model penginduksiannya diciptakan oleh Jacob – Monod, dimana sel E. coli tidak dapat mensintesis enzim intraseluler dengan substratnya berupa protein sedimen, tetapi yang disintesis adalah enzim proteolitik ekstraseluler.
Guna pengujian aktivitas enzim proteolitik ekstraseluler tersebut digunakan substrat berupa Bovin Seum Albumin
(BSA) dan 1 unit aktivitas enzim dinyatakan sebagai banyaknya mikro mol hasil degradasi BSA oleh 1 ml larutan enzim/menit pada kondisi optimalnya.
BAHAN DAN METODA
Dalam penelitian ini dilakukan beberapa tahap perlakukan dan masing-masing perlakuan menggunakan metode yang spesifik
Tahap I
Orientasi mengenai mikroba yang dapat menggantikan peranan episin dimana ada 3 macam mikroba yang digunakan yaitu Pseudomonas spp, Necordia spp, dan Eschericia Coli yang disiapkan untuk diinokulasi di dalam LBG padat (Luria-Bertani Glukose) dengan suplimen nutrien.
Tahap II
Setelah ditemukan mikroba yang potensial yaitu E. coli, maka dilakukan orientasi konsentrasi protein sedimen dengan cara pengenceran (v/v) yaitu 1:2; 1:3; 2:2; 2:3; 3:1; 3;2; 3:3.
Tahap III
Orientasi untuk menentukan pH optimum dari buffer fosfat 0,058 M, juga orientasi untuk menentukan suhu optimum dan lama pemprosesan (inkubasi) yang optimum guna menentukan hasil degradasi yang maksimal secara spektrofotometri (metode Lowry) yang memerlukan kurva standar tirosin dan λ maksimumnya, untuk ini perlu dilakukan orientasi λ maksimum.
Tahap IV
Menentukan kandungan protein dalam sedimen secara volumetri dengan metode Kjeldahl, sehingga dapat menentukan konsentrasi substrat yang optimum bagi proses degradasi protein sedimen oleh enzim proteolitik ekstraseluler yang
disintesis dalam sel E. coli secara sistem induksi.
Tahap V
Melakukan sentrifugasi untuk memperoleh supernatan yang mengandung enzim proteolitik ekstraseluler yang disekresikan oleh sel E. coli ke media cair dari LBG
Tahap VI
Mentukan kandungan tirosin hasil degradasi BSA oleh enzim proteolitik ekstraseluler tersebut dengan metode Lowry secara spektrofotometri dengan kurva standar tirosin pada λ maksimumnya (λmaks = 776 nm) juga menentukan
kandungan protein dalam 1 L supernatan yang mengandung enzim proteolitik ekstraseluler tersebut secara spektrofotometri dengan metode Biuret dan kurva standar BSA pada λmaks (540
nm), untuk menghitung besarnya aktivitas spesifik proteolitik ekstraseluler tersebut.
Hasil orientasi mengenai mikroba yang potensial dalam mendegradasi protein sedimen
Untuk ini digunakan 3 macam mikroba yaitu Pseudomonas spp, Necordia spp dan Eschericia coli.
Dalam menentukan mikroba mana yang potensial maka protein sedimen sampel harus disterilkan dahulu pada 121oC selama 15 menit, tetapi pada penerapan di lapangan sampel tidak perlu disterilkan. Karena itu dilakukan juga percobaan pengujian aktivitas mikroba yang potensial itu terhadap sampel yang tidak distrilkan. Ternyata hasilnya menunjukkan bahwa mikroba yang potensial adalah Eschericia coli.
Hasil orientasi mengenai sampel (protein sedimen) yang diencerkan dengan air laut
Untuk ini dilakukan pencampuran antara sampel dengan air laut dengan perbandingan (v/v): 1;1; 1:2 ; 1:3 ; 2:1 ; 2:3 ; 3:1; 3:2 dan 3:3.
Ternyata rasio yang cocok artinya yang memberikan hasil degradasi protein sedimen paling tinggi yaitu rasio dengan perbandingan 3:2 ; ini berarti bahwa kandungan protein dalam substrat yang optimal adalah : 0,2035% (300 cc sampel + 200 cc air laut mengandung protein 300 / 100 x 0,374 gr = 1,016 gr dalam 500 cc jadi 100 cc sampel encer mengandung 100 / 500 x 1,016 = 0,2035 gr = 02335%).
Hasil orientasi kondisi optimum untuk proses degradasi protein sedimen oleh sel Eschericia coli
Kondisi optimum yang diperlukan untuk prosesdegradasi protein sedimen oleh sel Eschercia coli adalah pH optimum, suhu optimum dan lama inkubasi optimum. Buffer fosfat yang dipakai dalam proses tersebut adalah dengan molaritas 0,058 M dan berbagai pH yang diteliti adalah pH 6,2 ; pH 6,5 ; pH 7,2 ; pH 7,5 dan pH 8,2.
Ternyata buffer fosfat 0,058 M yang optimum adalah pH 6,5.
Kondisi otimum untuk suhu divariasikan dari 30oC s/d 70oC ternyata suhu optimum untuk proses degradai protein sedimen oleh sel Eschericia coli adalah suhu 35oC sedangkan lama inkubasi untuk kondisi optimum yaitu lamanya proses degradasi yang memberikan hasil degradasi yang optimal adalah 30 menit (variasi yang digunakan adalah 20 menit sampai 60 menit)
Hasil pengujian aktivitas enzim proteolitik ekstraseluler dengan menggunakan BSA (5 mg/ml)
Untuk pengujian aktivitas enzim proteolitik ekstraseluler yang diproduksi oleh sel Eschericia coli dengan sistem induksi pada kondisi optimum yaitu pH buffer fosfat 0,058 M = 6,5 dengan suhu 35oC dan lama inkubasi 30 menit. Perlu dihentikan prosesnya secara dipanaskan
pada suhu 70oC setelah 30 menit, sehingga enzim proteolitik ekstraseluler dalam pemprosesan tersebut menjadi tidak aktif lagi dan selanjutnya disaring, lalu filtratnya ditampung dalam labu ukur 10 ml dan diencerkan dengan aquadest sampai tanda batas. Guna menentukan kandungan tirosin hasil degradasi protein sedimen dengan metode Lowry secara spektrofotometri memerlukan kurva standar tirosin dan panjang gelombang maksimum yaitu 767 nm, maka diperoleh garis regresi liner ; y= 0,0145 + 0,0102 x, sehingga diperoleh hasil aktivitas enzim proteolitik ekstraaseluler = 0,0146 Uxml-1 supernatan
x menit –1, sedangkan untuk menentuklan besarnya aktivitas speasifik enzim proteolitik ekstraseluler itu diperlukan penentuan kandungan proteinnya spektro-fotometri dengan metode Biuret pada λ maks
= 540 nm dengan kurva standar BSA yang memberikan garis regresi linier: y = 0,0276 + 0,0495 x; maka besarnya aktivitas spesifik 0,0416 U/mg protein enzim.
Hasil penentuan kandungan protein dalam sedimen yang dipakai sebagai sampel.
Sedimen tambak udang yang digunakan sebagai sampel ditentukan kandungan proteinnya dengan metode kjeldahl maka diperoleh hasil sebesar 0,372%, sehingga sampel yang diencerkan dengan rasio 3:2 (v/v) hanya akan mengandung 0,2035% protein yaitu merupakan kandungan protein dalam substrat yang optimum.
KESIMPULAN
Data hasil penelitian membutikan bahwa memang terjadi sistem induksi guna sintesis enzim proteolitik ekstraseluler oleh sel E.coli karena enzim proteolitik ekstraseluler tersebut ternyata berhasil diuji aktivitasnya terhadap BSA. Selain itu dapat disimpulkan bahwa;
1. Kami berhasil menanggulangi limbah tambah udang yang berupa protein sedimen yang kandungan proteinnya = 0,372%
2. Kondisi optimum untuk aktivitas enzim proteolitik ekstraseluler dalam pengujiannya terhadap BSA adalah pH (buffer fosfat 0,058) = 6,5 ; suhu optimum 35oC dan lama proses (inkubasi) = 30 menit dengan menghasilkan tirosin sebanyak 79,491 μg/ml supernatan enzim proteolitik ekstraseluler dengan konsentrasi protein sedimen yang optimum = 223,2 mg%
3. Aktivitas enzim proteolitik ekstraseluler tersebut adalah 0,0146 U/mg protein enzim.
DAFTAR PUSTAKA
Boyer, R.F., Modren Experimental Biochemistry, Second Edition, Cummings Publishing Co, Inc, California, 1993, 54 – 55
Brojonegoro, Kemampuan Cerithidea sp dan Hydrobia sp Dalam Mereduksi Bahan Organik Dari Limbah Tambak Udang, Jurnal Penelitian Sains dan Teknologi, Vol 4, No.2, 1998, 216 – 224
Buwono, I.D, Tambak Udang Windu Sistem Pengelolaan Berpola Intensif, Edisi Pertama Kanisius, Yogyakarta, 1993, 29, 90 – 96, dan 105
Clark,J.M. dan Switzer, R.L., Experimental Biochemistry, Second Edition, W.H., Freeman and Co., New York., 1997, 75 – 76, 78 – 79
DwijosEPUTRA, Mikrobiologi Umum, Edisi Pertama, Djambatan, Jakarta, 1994, 59 – 62 Girindra, A., Biokimia I, gramedia, Jakarta, 1993,
94 – 100
Haroan ,S., Pengaruh Pemberian Hasil Pengolahan Limbah Cair Pabrik Kelapa Sawit Pada Tanaman Tembacau Deli (Nicotiana tabacum), Terhadap Kadar N,P dan K, Daunnya, FMIPA – USU, 1998, 34 – 35. Holme, D.J., Peek, H., Analytical Biochemistry,
Longman, London, 1983
Lehniger, A.L., Dasar-Dasar Biokimia, Alih Bahasa Maggy Thenawijaya, Erlangga, Jakarta, 1988 Mihalyi, T., Application of Proteolytic Enzymes to Protein Structure Studies, Vol I., CRC Press, Inc., Florida, 1978
Mudjiman, Ahmad, Budidaya Udang Galah, Ke Enam, Penebar Swadaya, Jakarta, 1991, 4-5 Nurhasah, Karakterisasi Enzim Proteolitik Dalam
Ekstrak Getah Kambojo (Plumeri accuminata), FMIPA – USU Medan, 1998 Ritzmann, M., Metodelogi Isolasi Enzim dan
Aktivitasnya, Pusat Antar Universitas Bidang Ilmu Hayati, ITB, 1991, 34 – 36 Shahib, M. N., Pemahaman Seluk Beluk Biokimia
dan Penerapan Enzim, Citya Aditya Bakti, Bandung, 1992, 36 – 37
Srikandi, Fardiaz, Analisis Mikrobiologi Pangan, Edisi I, Raja Grafindo Persada, Jakarta, 1993, 120 – 121
Sumeru, S.U., Ir & Anna Suzy, Dra., Pakan Udang Windu (penaeus Monodon), Edisi Pertama, Kanisius, Yogyakarta, 1992, 11 – 14 dan 38 Sutejo, M.M., Mikrobiologi Tanah, PT. Rineka
Cipta, Jakarta, 1991, 285
Tim Penulis PS., Karet, Penebar Swadaya, Jakarta, 1997, 292 – 293
Trevor, P., Understanding Enzymes, Third Edition, Ellis Harwood Limited, 1991, 89 – 90 Wagino, Studi Pemisahan Parsial Enzim Urease
dari Kacang Kedelai Secara Salting Out dan Kromatografi Kolom dengan Gel Hidroksiapatit, FMIPA – USU
Winarno, F.G., Enzim Pangan, Gramedia, Jakarta, 1995, 11-12 dan 38
Wirahadikusumah, M., Biokimia – Protein, Enzim dan asam Nukleat, ITB, Bandung, 1981, 6-9, 40 - 56
