Prosiding Pertemuan Ilmiah Nasional Penelitian & Pengabdian Masyarakat (PINLITAMAS 1) Dies Natalis ke-16 STIKES Jenderal Achmad Yani Cimahi PINLITAMAS 1 | Vol 1, No.1 | Oktober 2018 | ISSN 2654-5411
PERBANDINGAN EFEKTIVITAS METODE ISOLASI DNA
(BOILLING WATER DAN CTAB) PADA BAKTERI Klebsiella pneumoniae
Sitti Romlah, Patricia Gita Naully, Siti NurasyiahProgram Studi Analis Kesehatan Stikes Jenderal Achmad Yani Cimahi ABSTRAK
Pneumonia adalah peradangan akut pada parenkim paru yang disebabkan oleh bakteri Klebsiella pneumoniae yang dapat mengganggu pertukaran oksigen dan karbon dioksida di paru-paru. Bakteri ini memiliki kapsul polisakarida yang besar dan motil. Polisakarida mengganggu isolasi dan karakteristik polisakarida berinteraksi dengan DNA membentuk larutan yang sangat kental atau slime. Pneumonia dapat dideteksi menggunakan teknik biologi molekuler, dimana salah satu keberhasilan dalam teknik ini adalah isolasi DNA. Berdasarkan karakteristik bakteri ini maka penelitian ini dilakukan untuk menentukan metode yang tepat dalam isolasi DNA dengan menggunakan teknik boilling water dan CTAB. Boilling water menggunakan pemanasan tinggi selama beberapa menit sedangkan CTAB merupakan sejenis deterjen yang dapat mendegradasi dinding sel, denaturasi protein, memisahkan karbohidrat. Hasil penelitian menunjukkan kedua metode tersebut menghasilkan pita genom berukuran 10000 bp. Konsentrasi dan kemurnian hasil isolasi dari Boilling water 1,3 dengan konsentrasi 97,1 ng/mL sedangkan CTAB memiliki kemurnian 1,2 dengan konsentrasi 471,2 ng/mL. Dari kedua metode yang digunakan, metode yang baik untuk mengisolasi DNA genom bakteri K.pneumoniae yang berkapsul dengan konsentrasi 471,2 ng/mL dan kemurniaan 1,2.
Kata kunci: Isolasi DNA, Boilling Water, CTAB
ABSTRACT
Pneumonia is an acute inflammation of the lung parenchyma caused by the bacterium Klebsiella pneumoniae which can interfere with the exchange of oxygen and carbon dioxide in the lungs. This bacterium has a large and motile polysaccharide capsule. Polysaccharides interfere with the isolation and characteristics of polysaccharides interacting with DNA to form a very thick or slime solution. Pneumonia can be detected using molecular biology techniques, where one of the successes in this technique is DNA isolation. Based on the characteristics of these bacteria, this study was conducted to determine the appropriate method in DNA isolation using boilling water and CTAB techniques. Boilling water uses high heating for several minutes while CTAB is a type of detergent that can degrade cell walls, denaturate proteins, separate carbohydrates. The results showed that the two methods produced 10000 bp genome band. The concentration and purity of the isolation results from Boilling water 1.3 with a concentration of 97.1 ng / mL while CTAB has a purity of 1.2 with a concentration of 471.2 ng / mL. Of the two methods used, a good method to isolate encapsulated K. pneumoniae bacterial genome DNA with a concentration of 471.2 ng / mL and purity of 1.2.
Keywords: DNA Isolation, Boilling Water, CTAB
PENDAHULUAN
Pneumonia merupakan sepuluh besar penyakit menular di Indonesia dengan jumlah kasus sebesar 46.250 pasien yang terdiagnosa pneumonia. Pneumonia adalah peradangan akut pada parenkim paru, bronkiolus respiratorius dan alveoli, menimbulkan konsolidasi jaringan paru sehingga dapat mengganggu pertukaran oksigen dan karbon dioksida di paru-paru (Walker R & Whittlesea C, 2012). Penyakit ini disebabkan oleh bakteri Klebsiella pneumoniae. Bakteri ini
memiliki kapsul, tetapi tidak membentuk spora. Spesies K.pneumoniae menunjukkan pertumbuhan mucoid, kapsul polisakasida yang besar dan motil(Anderson, Lonsway, & Rasheed, 2007). Tiga faktor yang yang dapat bertindak sebagai virulensi Klebsiella sp.yaitu reseptor dinding sel, eksopolisakarida dan endotoksin.(Leach AJ, Shelby-James TM, & Mayo M, 1997). Material kapsul membentuk bundel tebal struktur fibril yang menutupi permukaan bakteri. Struktur tersebut Sekolah Tinggi Ilmu Kesehatan Jenderal Achmad Yani Cimahi Halaman 627 Jl.Terusan Jenderal Sudirman – Cimahi 40533
melindungi bakteri dari fagositosis oleh granulosit, polimorfonuklear, dan mencegah kematian bakteri oleh serum bakterisidal.(Casewell M & Phillips I, 1978). Penyakit pneumonia dapat dideteksi dengan teknik biologi molekuler. Langkah pertama yang perlu dilakukan untuk pemeriksaan tersebut adalah isolasi DNA.
Isolasi DNA adalah prosedur rutin untuk mengumpulkan DNA untuk analisis molekuler atau forensik berikutnya(Doyle, E, Widyarti, & Rahayu, 2011). Isolasi DNA merupakan salah satu teknik yang paling dasar
dan penting dalam studi DNA. Isolasi/ekstraksi DNA diperoleh dengan cara merusak atau memecahkan dinding sel sehingga DNA keluar dari dalam sel.Derajat kemurnian dan kualitas dalam isolasi DNA sangat mempengaruhi hasil yangakan diperoleh. Secara umum, prosedur ekstraksi yang baik untuk isolasi DNA mencakup tiga hal penting, yaitu harus bisa dihasilkan DNA dengan kemurnian yang tinggi, DNAharus utuh, dan konsentrasi yang tinggi(Clark, M.S, 1997).Konsentrasi dan kemurniaan DNA ditentukan dengan spektrofotometer pada λ 260 nm dan 280 nm. Molekul DNA dikatakan murni jika rasio absorbansinya berkisar antara 1,8 – 2,0.(Darmo TW, 2011)
Polisakarida mengganggu isolasi dan karakterisasi DNA karena pada metode phenol-chloroformpolisakarida berinteraksi dengan DNA membentuk larutan yang sangat kental atau slime.Pada metode
Methoxyethanolsampel DNA yang terkontaminasi polisakarida sering terjadi ketidaksesuaian untuk restriksi danpenyimpanan jangka panjang(Crowley et al., 2003a; Crowley et al., 2003b; Lee et al., 2003; Sharma et al., 2002). Dari penelitian yang telah lakukan oleh Xiao Xiaodkk (2011) dengan hasil penelitian menunjukkan bahwa 3 metode tersebut bekerja dengan baik pada
banyak non-mucoid Gram-negatif bakteri termasuk JM109 yang diuji, tapi ternyata tidakbekerja dengan baik pada dua bakteri mukoid, V.parahaemolyticus dan K. pneumoniae. Oleh sebab itu, diperlukan metode lain yang dapat mengisolasi DNA K.pneumoniae secara optimal.
Pada beberapa rumah sakit metode yang sering digunakan adalah metode boilling water. Pada metode boilling, pemanasan tinggi selama beberapa menit akan menyebabkan peningkatan permeabilitas dinding sel yang berakibat pada masuknya cairan dan materi lain di sekitar sel dan keluarnya materi-materi dari dalam sel. Suhu tinggi juga bermanfaat untuk inaktivasi enzim, terutama DNase yang dapat merusak DNA.(Sharbatkhori, Kia EB, Harandi MF, Jalalizan N, & Mirhendi H, 2009). Ekstraksi DNA menggunakan metode boilling sangat mudah dilakukan dan hanya membutuhkan waktu beberapa menit.(Sunarno, Muna, Fitri, Malik, Karuniawati, & Soebandrio, 2014)
Metode Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide (CTAB) ini biasa di gunakan untuk isolasi DNA tanaman(Donata, 2007). Metode isolasi DNA ini menggunakan nitrogen cair pada tahap awal ekstraksi untuk menghasilkan kualitas DNA terbaik.(Pharmawati, M, 2009). CTAB merupakan sejenis deterjen yang dapat mendegradasi dinding sel, denaturasi protein, memisahkan karbohidrat (Suprapto, 2003). Metode ekstraksi DNA dengan CTAB akan menghasilkan pita DNA yang berukuran tebal dan dapat memisahkan DNA dari polisakarida karena adanya perbedaan karakteristik kelarutan (differensial of solubility). Metode ini tidak membutuhkan biaya yang lebih mahal dibandingkan dengan menggunakan kit. (Miligan, 1992).
Perbandingan Efektivitas Metode Isolasi Dna (Boilling Water Dan Ctab) Pada Bakteri Klebsiella pneumoniae
METODE PENELITIAN Alat dan Bahan
Tabel: Alat yang digunakan dalam penelitian
No. Nama Alat Spesifikasi Jumlah
1. Timbangan Metler Toledo 1 unit
2. Gelas kimia 100mL 2 unit
3. Ose Bulat dan Tusuk 2 unit
4. Bunsen 150mL 1 unit
5. Autoclave Hyrayama 1 unit
6. Cawan petri Pyrex 2 unit
7. Batang pengaduk P = 25 cm 1 unit
8. Objek glass 25,4 x 75,5 1 unit
9. Mikroskop Olympus CX21LED 1 unit
10. Mikrotube 1,5mL
11. Vortex AccuBioTech.Co.,Ltd 1 unit
12. Mikropipet 100-1000μL 2 unit
13. Waterbath Memmert 1 unit
14. Sentrifuge Eppendorf 1 unit
15. Rak mikrotube 1 unit
16. Alat Elektroforesis Mupid ex 1 set
17. Spektrofotometer atau Thermo 1 unit
Nanodrop
18. Tip putih Neptune, 1-10μL Secukupnya
19. Tip biru Nesco, 100-1000μL Secukupnya
Bahan yang akan digunakan dalam penelitian ini seperti pada tabel berikut :
Tabel : Bahan yang digunakan dalam penelitian
No. Nama Bahan Spesifikasi Jumlah
1. Kultur murni K.pneumoniae ATCC 700603, Secukupnya CT1538, S941
2. Bubuk media Mac Conkey OXOID 51,5g/1L 2,575g
agar
3. Aquadest 1000mL
4. Tinta Cina Yamura(231) 1 tetes
Lar. Krystal violet
5. Pewarnaan Gram Lar. Lugol Alkohol 95% Lar. Safranin 6. Nitrogen cair 7. Isopropanol 600 mL 8. Etanol Absolute 400 μL
9. Buffer CTAB VWR amResw 600 μL
10. Polyvinilpurrolidone(PVP) 600 μL
11. CIA 600 μL
12. NaCl 0,5 M 600 μL
13. Buffer TE 50 μL
14. Larutan Etidium Bromide Merck (ETBR)
15. Loading dye Nutrilab
Jalannya Penelitian
Penelitian ini dilakukan dalam beberapa tahapan sebagai berikut : 1. Sterilisasi alat dan bahan
menggunakan autoklaf dengan suhu 121 ⁰C selama 15 menit
Penanaman kultur bakteri, pewarnaan gram dan kapsul.
Bakteri diambil dari kultur bakteri ATCC 700603 di lakukan subkultur pada media MC dan AN miring, kemudian setelah tumbuh dilakukan pewarnaan gram dan kapsul untuk keperluan identifikasi awal.
Uji Biokimia bakteri Klebsiella pneumonia
Langkah identifikasi selanjutnya uji biokimia menggunakan uji gula-gula , kemudian hasilnya dibandingkan dengan tabel Koneman.
Isolasi DNA
Isolasi DNA dilakukan dua metode yang berbeda, yang pertama menggunakan metode Boilling Water dimana dilakukan pemanasan pada sampel
kultur bakteri 95 ⁰C selama 15 menit, kemudian di sentrifugasi untuk memisahkan DNA dan selain DNA. Metode yang kedua adalah CTAB dengan tahapan pelisisan sel, pengendapan DNA, pencucian DNA dan pelarutan DNA. Pengukuran Konsentrasi DNA dan Kemurnian DNA
Pengukuran dan Kemurnian DNA dilakukan menggunakan alat Nanodrop, untuk DNA diukur pada ʎ 260 dan untuk protein pada ʎ 280. Akan didapatkan absorban dan konsentrasi dan kemurnian DNA nya.
Elektroforesis
Pada tahapan ini dilakukan pemisahan DNA berdasarkan ukuran menggunakan agar agarose 1 %.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Penelitian ini diawali dengan identifikasi bakteri klebsiella pneumonia dengan uji biokimia, pewarnaan gran dan kapsul. Berdasarkan uji biokimia didapatkan hasil sebagai berikut :
Tabel: Keterangan hasil pada media Mac Conkey No Karakteristik Hasil
1. Warna Pink (Laktosa fermenter) 2. Ukuran 0,5 – 0,7 cm
3. Elevasi Cembung 4. Ciri lainnya Mucoid, smooth
Tahapan selanjutnya dilakukan pewarnaan Gram dan kapsula (Burry Gins) pada koloni yang diduga Klebsiella pneumoniae. Kemudian didapatkan hasil sebagai berikut :
Tabel : Hasil Pewarnaan Gram dan kapsula
No Media Keterangan
Media Mac Conkey Agar Media TSB
Bentuk:Basil Susunan: Mono 1. Sifat: Gram negatif Ciri bakteri: K.pneumoniae
Pewarnaan Gram dengan
Pewarnaan Gram dengan perbesaran 1000x perbesaran 1000x
Perbandingan Efektivitas Metode Isolasi Dna (Boilling Water Dan Ctab) Pada Bakteri Klebsiella pneumoniae Bentuk:Basil Susunan: Mono Sifat: Gram negatif 2. Terdapat kapsul (Bening) dan badan bakteri (merah) Pewarnaan Gram dengan Pewarnaan Gram dengan perbesaran 1000x K.pneumoniae Ciri bakteri:
perbesaran 1000x
Tahapan selanjutnya dilakukan penanaman pada media uji biokimia diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam, dengan hasil dapat dilihat dibawah ini :
Tabel: Hasil Uji Biokimia No Nama Uji Pengamatan Hasil (+/-)
1. Laktosa Ungu Kuning (+/Gas+)
2. Sukrosa Ungu Kuning (+/Gas+)
3. Glukosa Ungu Kuning (+/Gas+)
4. Manitol Ungu Kuning (+/Gas+)
5. TSIA Orange L/D : Asam/Asam
H2S : Negatif
Gas : Positif
6. Methyl Red Negatif (Tidak terbentuk cincin merah)
7. Voges Proskauer Positif (Terbentuk cincin)
8. SIM Sulfur : Negatif
Indol : Negatif Motility : Negatif 9. Simon Citrate Hijau (Biru) Positif
10. Urease Orange (Biru) Positif
11. AN Ada pertumbuhan
12. TSB Ada pertumbuhan
Keterangan : L : Lereng D: Dasar
Dari hasil perhitungan didapatkan kesesuaian sebesar 100% bakteri Klebsiella pneumoniae. Koloni tersangka Klebsiella pneumonia dibuat kultur bakteri selama 24
jam . Isolasi menggunakan dua metode, Boilling water dan CTAB, dan dilakukan pengukuran konsentrasi dan kemurnian DNA. Hasil dapat dilihat pada tabel berikut :
Tabel: Hasil Uji Konsentrasi dan Kemurnian DNA
No Metode Isolasi 260nm 280nm Kemurnian Konsentrasi
DNA DNA
1. Boilling Water 1.820 1.364 1.3 97,1 ng/ml
2. CTAB 0.490 0.394 1.2 471,2 ng/ml
Tahapan terakhir adalah elektroforesis menggunakan konsentrasi agarose 1% dengna waktu 60 menit, 70 volt. Hasil dapat dilihat sebagai berikut :
Gambar Hasil visualisasi proses elektroforesis DNA genom bakteri uji. Lajur 1 : Marker (1kb). Lajur 2 : Kontrol Negatif. Lajur 3 : Hasil isolasi DNA menggunakan metode boilling
water. Lajur 4 : Hasil isolasi DNA menggunakan metode CTAB Pada penelitian ini dilakukan uji biokimia
terhadap sampel uji bakteri dengan hasil persentase 100% bakteri K.pneumonia. Menurut (Koneman, Willet, Amos, & Wilfert, 1988) Salah satu kunci penting identifikasi Klebsiella pneumonia adalah KIA As/As, Gas ++, H2S (-), Ind (-), MR (-), VP (+), Citrate
(+), Motility (-), dan Urease (+). Dari hasil isolasi DNA menggunakan metode Boilling water dan CTAB didapatkan kemurnian DNA yang rendah sedangkan untuk konsentrasi DNA tertinggi didapatkan dari metode CTAB. Pengukuran kuantitas kemurnianDNAdapat diihat pada (tabel IV). Kemurnian DNA diperoleh dari perbandingan absorban A260/280 pada sampel DNA. Nilai 260nm merupakan nilai maksimal DNA dapat menyerap cahaya, nilai tersebut dapat digunakan untuk memperkirakan konsentrasi DNA, sedangkan nilai 280 merupakan nilai maksimal residu protein dapat menyerap cahaya (Sambrook, 1989). Menurut Komala (2009) menyatakan bahwa konsentrasi hasil ekstraksi pada waktu ekstraksi dan komposisi penambahan lisis buffer merupakan faktor yang mempengaruhi banyak sedikitnya DNA.Pada penelitian (Habibah, 2017) menggunakanmetode CTAB untuk isolasi DNA chlorella sp. menghasilkan kemurnian dan kualitas DNA yang tinggi. Karena menurut (Kaidah dan Suprapto, 2003; Ardiana, 2009) metode CTAB merupakan
metode yang umum digunakan dalam ekstraksi DNA genom tanaman yang banyak mengandung polisakarida dan senyawa polifenol. Senyawa CTAB termasuk jenis surfaktan kationik yang digunakan untuk proses lisis sel tanaman.
Sampel DNA tersebut kemudian divisualisasi melalui proses elektroforesis gel agarosa 1%. Visualisasi gel agarosa dilakukan menggunakan UV-
transillluminator. Visualisasi sampel DNA dapat dilihat pada Gambar A. Hasil kuantitas DNA menunjukkan bahwa nilai kemurnian masing masing metode berbeda dan tingkat konsentrasi yang diperoleh berbeda beda pula, hal ini mengakibatkan ketebalan pita yang beragam. Perbedaan konsentrasi DNA yang diperoleh pada masing masing metode dapat ditentukan oleh perlakuan fisik yang diberikan serta kemampuan buffer ekstraksi dalam memecah sel. Proses perusakan sel secara fisik dengan penggerusan sampel yang sempurna dapat mempermudah buffer ekstraksi dalam memecah sel. Disamping itu buffer ekstraksi yang digunakan dapat menentukan konsentrasi DNA yang dihasilkan(Mulyani, Purwanto, & Nurruhwati, 2003). Hasil visualisasi menunjukkan bahwa sampel DNA hasil isolasi menggunakan metode Boilling water dan CTAB menunjukkan adanya pita. Pada lajur 3 menunjukkan bahwa konsentrasi DNA yang
Perbandingan Efektivitas Metode Isolasi Dna (Boilling Water Dan Ctab) Pada Bakteri Klebsiella pneumoniae
berhasil diisolasi tinggi, ditunjukkan oleh tebalnya pita DNA yang dihasilkan. Pita DNA hasil elektroforesis yang semakin tebal belum tentu berbanding lurus dengan tingginya konsentrasi DNA (Sambrook, 1989). Pita DNA yang terlihat menyebar menunjukkan adanya ikatan molekul DNA yang terputus pada saat proses ekstraksi DNA berlangsung, sehingga genom DNA terpotong menjadi KESIMPULAN
Berdasarkan hasil penelitian diantara dua metode, yaitu Boilling water dan CTAB, metode CTAB merupakan metode yang lebih
DAFTAR PUSTAKA
Anderson, K., Patel, J., & Wong, B. (2009). Characterization of Enterobacteriaceae with a false-positive modified Hodge test, Abstract of the Forty-ninth
Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy. pp.719-41.
Casewell M, & Phillips I. (1978). Food as a source of Klebsiella species for colonisation and infection of intensive care patients. (31:845-9).
Clark, M.S. (1997). Plant Molecular Biologi. Dalam Lab Fox. UK: BIOS Scientific Publisher Limited.
Darmo TW. (2011). Analisis keragaman genetik Ganoderma spp. yang berasosiasi dengan tanaman kakao dan tanaman pelindungnya menggunakan Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD). 79(1):6-14.
Donata. (2007). Ciri-ciri DNA murni dan penyebab keberhasilan serta kegagalan dalam PCR dan elektroforesis. Jakarta: Erlangga.
Leach AJ, Shelby-James TM, & Mayo M. (1997). A prospective study of the impact of community-based azithromycin
bagian bagian yang lebih kecil. Terputusnya ikatan antar molekul tersebut dapat disebabkan oleh adanya gerakan fisik yang berlebihan yang dapat terjadi dalam proses pemipetan, pada saat dibolak-balik dalam ependorf, sentrifus, atau bahkan karena temperature yang terlalu tinggi dan karena aktivitas bahan bahan kimia tertentu (Syahfitri Harahap, 2017).
baik untuk mengisolasi DNA genom bakteri Klebsiella pneumoniae yang berkapsul dengan konsentrasi 471,2 ng/mL dan kemurnian 1,2.
treatment of trachoma on carriage and resistance of streptococcus pneumoniae (Vol. 24(3):356). Clin Infect Dis.
Mulyani, Y., Purwanto, A., & Nurruhwati, I. (2003). Perbandingan Beberapa Metode Isolasi DNA untuk Deteksi Dini KOI HERPES VIRUS (KHV) Pada Ikan Mas (Cyprinus carpio L).
Pharmawati,M. (2009). Optimalisasi ekstraksi DNA dan PCR-RAPD pada greviellea spp. (Proteaceae). 13(1):12-16.
Sharbatkhori, M., Kia EB, Harandi MF, Jalalizan N, & Mirhendi H. (2009). Comparison of Five Simple Methods for DNA Extraction from Echinococcus granulosus Protoscoleces for PCR-Amplification of Ribosomal DNA. 4(2):54-60.
Sunarno, Muna, F., Fitri, N., Malik, A., Karuniawati, A., & Soebandrio, A. (2014). Metode cepat ekstraksi DNA Corynebacterium diphtheriae untuk pemeriksaan PCR. Vol.42, No.2(85-92). Suprapto. (2003). Genetics: Th Continuity of
life. 4th ed. Wadsworth Publishing Company (Vol. xix+ 820 hlm). London.
