V. MODUL 5 : DASAR-DASAR KROMATOGRAFI
Pembelajaran 5.1 : Prinsip Kromatografi
1. Capaian pembelajaran :
Setelah menyelesaikan proses pembelajaran 5.1 pada modul ini, mahasiswa diharapkan memiliki kemampuan :
a. Menjelaskan prinsip dasar kromatografi dan mekanisme pada distribusi fasa. b. Memahami tentang retensi dan resolusi serta hubungan antara keduanya. c. Menjelaskan tentang jumlah plat teori dan efisiensi kolom pada kromatografi.
Untuk membantu Anda dalam mencapai tujuan-tujuan tersebut, dalam modul ini akan disajikan uraian, latihan (pengayaan) dan rambu-rambu jawaban serta soal evaluasi. Agar anda dapat belajar dengan baik dalam mempelajari modul ini, lakukanlah hal-hal berikut :
a. Pelajarilah dengan cermat semua uraian yang tercantum dalam masing-masing proses pembelajaran.
b. Kerjakanlah soal-soal latihan (pengayaan) yang terdapat dalam setiap proses pembelajaran dengan berusaha tanpa melihat dahulu rambu-rambu jawabannya. Setelah Anda selesai mengerjakan soal-soal tersebut, cocokkanlah pekerjaan anda dengan rambu-rambu jawaban yang tersedia. Bila pekerjaan Anda masih jauh menyimpang dari rambu-rambu jawaban, hendaknya Anda tidak berputus asa untuk mempelajarinya kembali.
c. Dalam setiap proses pembelajaran diakhiri dengan intisari (rangkuman) yang merupakan sari pati dari uraian yang telah disajikan. Bacalah dengan seksama isi rangkuman tersebut sehingga pengalaman belajar Anda benar-benar mantap.
d. Evaluasi (tes formatif) yang disusun setelah rangkuman merupakan tes yang diberikan untuk mengukur penguasaan Anda dalam pokok bahasan yang telah dipaparkan dalam proses pembelajaran. Hasil anda dalam tes formatif tersebut digunakan sebagai dasar penentuan apakah Anda sudah dapat melanjutkan ke proses pembelajaran berikutnya ataukah masih perlu mengulang. Seberapa jauh tingkat penguasaan Anda, dapat Anda hitung sendiri dengan rumus sederhana yang dicantumkan pada setiap akhir tes formatif.
2. Materi
Kromatografi merupakan suatu cara pemisahan fisik dengan unsur-unsur yang akan dipisahkan terdistribusikan antara dua fasa, satu dari fasa-fasa ini membentuk lapisan stasioner dengan luas permukaan yang besar dan yang lainnya merupakan cairan yang merembes lewat atau melalui lapisan yang stasioner.
Dalam banyak hal, kromatografi dapat disamakan dengan proses penyarian Craig. Keduanya menggunakan dua fasa, satu fasa bergerak terhadap lainnya. Pada kromatografi fasa gerak bergerak kontinyu. Pada setiap titik sepanjang kolom, terjadi keseimbangan antara fasa-fasa itu dengan sangat cepat, walaupun tidak pernah tercapai seimbang sempurna. Proses Craig terbatas pada dua pelarut yang tidak bercampur, sedangkan pada kromatografi dapat digunakan macam lain dari fasa-fasa itu. Dibandingkan dengan kerumitan alat Craig, pemisahan kromatografi dapat dilakukan dengan selembar kertas dan gelas kimia, atau sebuah buret yang diisi dengan fasa diam (Sudjadi, 1988).
a. Macam-macam kromatografi
Metode kromatografi sebagian dikelompokkan berdasarkan macam fasa yang digunakan dan sebagian lain berdasarkan pada mekanisme pada distibusi fasa
• Kromatogarfi cairan-padat atau kromatografi serapan • Kromatografi cairan-cairan atau kromatografi partisi • Kromatografi gas-padat
• Kromatografi gas-cairan • Kromatografi kertas • Kromatografi lapis tipis • Kromatografi penukar ion • Penyaringan gel
• Elektroforesis
b. Teori kromatografi
Ciri khas dari pemisahan dengan kromatografi yaitu perbedaan migrasi dari berbagai senyawa dalam cuplikan, dan pentebaran sepanjang kolom dari molekul senyawa tertentu. Perbedaan migrasi merupakan dasar pemisahan kromatografi , tanpa perbedaan dalam kecepatan migrasi dari dua senyawa, tidak mungkin terjadi pemisahan.
• Kesetimbangan distribusi
Perbedaan migrasi merupakan hasil distribusi keseimbangan dari senyawa A, B, dan C di anatar fasa diam dan fasa gerak dan fasa gerak. Distribusi molekul cuplikan antara dua fasa ditentukan oleh tetapan keseimbangan , yang dikenal sebagai koefisien distribusi atau koefisien partisi, K. Keseimbangan adalah proses dinamik, dan molekul itu masuk dan keluar dengan cepat antara dua fasa itu, maka kadarnya mengikuti hukum distribusi : 𝐾 = 𝐶𝑠
𝐶𝑚 di mana Cs dan Cm adalah kadar suatu
senyawa dalam fasa diam dan dalam fasa gerak.
Untuk kesetimbangan dinamik yang sebenarnya, fraksi waktu total molekul rata-rata dalam fasa gerak berbanding langsung dengan fraksi populasi total yang terdapat dalam fasa gerak
Fraksi dalam fasa gerak = 𝑗𝑢𝑚𝑙𝑎ℎ 𝑚𝑜𝑙𝑒𝑘𝑢𝑙 𝑑𝑎𝑙𝑎𝑚 𝑓𝑎𝑠𝑎 𝑔𝑒𝑟𝑎𝑘
𝑗𝑢𝑚𝑙𝑎ℎ 𝑚𝑜𝑙𝑒𝑘𝑢𝑙 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 m m m m s s C V C V C V = + 1 1 KVs/Vm = + ' 1 1 R K = +
Di mana K’ = Kvs/Vm, suatu variabel baru yang dinamakan faktor kapasitas. K’ juga
setara dengan CsVs/CmVm, atau angka banding mol cuplikan dalam fasa diam dibagi
dengan mol dalam fasa gerak. • Retensi
Jika cepat aliran fasa gerak dalam kolom adalah µ (cm/detik), maka kecepatan rata-rata cuplikan x adalah µx. Harga µx ini tergantung pada harga µ dan fraksi R molekul x
dalam fasa gerak.
x R
=
Jika fraksi molekul x dalam fasa gerak adalah nol, berarti tidak ada migrasi dan µx =
nol. Jika fraksi molekul x dalam fasa gerak adalah satu, berarti semua molekul x dalam fasa gerak adalah satu, berarti semua molekul x terdapat dalam fasa gerak, molekul x akan melalui kolom dengan kecepatan sama dengan kecepatan fasa gerak, dan µx = µ. ' 1 x k = +
Harga µx dapat dihubungkan dengan waktu retensi (detik) dan panjang kolom L (cm).
Seperti persamaan umum bahwa waktu yang diperlukan setara dengan panjang yang ditempuh dibagi kecepatan, maka
R
x
L
t =
Serupa untuk retensi fasa gerak to, atau senyawa lain yang tidak tertahan fasa diam,
maka o L t = Dengan menghilangkan L : o o x t t = Sehingga dihasilkan : ' (1 ) R o t =t +k
Kadang-kadang retensi diukur dalam satuan volume. Volume retensi VR adalah
volume total fasa gerak yang diperlukan untuk mengelusi puncak senyawa X. Volume retensi VR (ml) sama dengan waktu retensi tR (det) kali kecepatan alir F (ml/det) dari
fasa gerak yang melalui kolom :
R R
V =t F
Maka volume total fasa gerak yang terdapat yang terdapat dalam kolom adalah
m o
V =t F
Dengan menghilangkan F antara dua persamaan di atas didapatkan
' (1 ) R R m o m t V V t V k = = +
Volume retensi kadang-kadang lebih disenangi daripada waktu retensi, karena waktu retensi berubah dengan berubahnya kecepatan alir F, sedangkan volume retensi tidak tergantung pada F
• Pelebaran puncak
Kolom kromatografi terdiri dari sejumlah lempeng teori. Dalam istilah kromatografi, jumlah lempeng teori N dalam suatu kolom di hitung dari kromatogramnya, dengan persamaan
2 16 tR N W =
di mana W adalah lebar puncak yang diukur pada perpotongan tangen dan garis dasar, karena itu N tanpa dimensi, tR dan W harus diukur dengan satuan yang sama.
Lempeng teori menyatakan jumlah lempeng dalam kolom pada kondisi tertentu, tetapi tidak menyatakan bagaimana menaikkan jumlahnya. Pengukuran efesiensi kolom persatuan panjang dapat dilakukan dengan persamaan
2 16 a R L L W H N t = = • Resolusi
Tujuan umum pada kromatografi adalah pemisahan yang cukup dari campuran yang dipisahkan. Pada pendekatan tujuan ini harus punya ukuran kuantitatif dari pemisahan relatif atau resolusi. Hubungan resolusi R dan dua puncak yang berdekatan adalah
(
2 1)
1 2 2 tR tR R W W − = +• Pengaruh jumlah cuplikan
Pengaruh perubahan jumlah cuplikan ditunjukan : untuk cuplikan sedikit (a), tinggi puncak naik dengan bertambahnya jumah cuplikan, waktu retensi tidak dipengaruhi dan resolusinya tetap. Pada jumlah cuplikan kritik (b) terlihat waktu retensi menurun dan penambahan jumlah cuplikan lebih lanjut (c dan d) terjadi penurunan nyata pada pemisahan waktu retensi.
• Puncak berekor
Ada 4 macam puncak berekor. Berekor kimia (A) terjadi karena ketidakcocokan antara cuplikan dengan fasa diam atau fasa bergerak. Berekor pelarut (B) merupakan hasil dari percobaan pemisahan puncak kecil terhadap munculnya lain yang lebih besar. Berekor poisson (C) disebabkan kolom kurang efisien. Berekor eksponensial atau berekor normal (D) ditandai dengan puncak sedikit kurang simetris.
• Analisis kuantitatif
Ada beberapa kemungkinan sumber kesalahan pada analisis kuantitatif diantaranya, pemisahan kromatogarfi, respon detektor, tehnik kalibrasi dan pengukuran.
Kesalahan dari pemasukan cuplikan terutama disebabkan oleh volume injeksi tidak tepat dan oleh pelebaran puncak. Ketidaktelitian dapat disebabkan oleh proses kromatografi itu sendiri. Kesalahan yang disebabkan oleh tumpangsih dan puncak berekor dapat dikurangi dengan memilih kolom dan proses pemisahan yang sesuai. Variasi pada respon detektor juga dapat menyebabkan kesalahan. Kepekaan detektor, bisingan, dan kelinieran merupakan perincian penting, terutama untuk analisis kuantitatif.
3. Inti Sari
Ciri khas dari pemisahan dengan kromatografi yaitu perbedaan migrasi dari berbagai senyawa dalam cuplikan, dan pentebaran sepanjang kolom dari molekul senyawa tertentu. Perbedaan migrasi merupakan dasar pemisahan kromatografi , tanpa perbedaan dalam kecepatan migrasi dari dua senyawa, tidak mungkin terjadi pemisahan.
Kolom kromatografi terdiri dari sejumlah lempeng teori. Dalam istilah kromatografi, jumlah lempeng teori N dalam suatu kolom di hitung dari kromatogramnya, dengan persamaan
N = 16[tR/W]2
di mana W adalah lebar puncak yang diukur pada perpotongan tangen dan garis dasar, karena itu N tanpa dimensi, tR dan W harus diukur dengan satuan yang sama.
Hubungan resolusi R dan dua puncak yang berdekatan adalah
(
2 1)
1 2 2 tR tR R W W − = + 1. Latihan1. Sebutkan macam-macam kromatografi berdasarkan mekanisme pada distribusi fasa 2. Apakah yang dimaksud dengan retensi dan resolusi dan hubungan antara keduanya
dalam rumus.
2. Evaluasi
1. Retensi dalam kromatografi selain dapat dinyatakan sebagai waktu retensi, juga dapat dinyatakan sebagai :
a. Suhu retensi b. Tekanan retensi c. Volume retensi d. Konsentrasi retensi e. Fasa retensi
2. Pengukuran efesiensi kolom persatuan panjang dapat dilakukan dengan persamaan 2 16 a R L L W H N t = = Dimana :
a. H adalah sama dengan HETP b. L adalah luas puncak
c. N adalah bilangan Avogadro d. tR adalah volume retensi
3. Beberapa puncak kromatogram dapat menghasilkan puncak berekor. Yang bukan merupakan puncak berekor adalah :
a. berekor ikutan b. berekor kimia c. berekor pelarut d. berekor poisson e. berekor eksponensial
4. Perubahan jumlah cuplikan dapat berpengaruh pada kromatogram. Untuk cuplikan sedikit maka
a. Tinggi puncak naik dengan bertambahnya jumah cuplikan, waktu retensi tidak dipengaruhi dan resolusinya tetap.
b. Terlihat waktu retensi menurun
c. Terjadi penurunan nyata pada pemisahan waktu retensi. d. Terlihat volume retensi meningkat
e. Tinggi puncak menurun dengan bertambahnya jumlah cuplikan 5. Derajad pemisahan dua puncak (resolusi) :
a. Berbanding terbalik dengan selisih waktu retensi (tR2 – tR1)
b. Berbanding lurus dengan jumlah luas kedua puncak c. Berbanding terbalik dengan jumlah luas kedua puncak
d. Berbanding lurus dengan jumlah volume retensi kedua puncak e. Berbanding terbalik dengan suhu kolom
Cocokkanlah jawaban Anda dengan Kunci Jawaban Tes Formatif yang terdapat di bagian akhir modul ini. Hitunglah jawaban yang benar. Kemudian, gunakan rumus berikut untuk mengetahui tingkat penguasaan Anda terhadap materi Kegiatan Belajar 2.
Tingkat penguasaan: (Jumlah Jawaban Ynag Benar)/(Jumlah Soal) x 100% Arti tingkat penguasaan:
90 - 100% = baik sekali 80 - 89% = baik 70 - 79% = cukup < 70% = kurang
