vi DAFTAR ISI
Halaman
ABSTRAK ... i
ABSTRACT ... ii
KATA PENGANTAR ... iii
DAFTAR ISI ... vi
DAFTAR GAMBAR ... ix
DAFTAR TABEL ... xi
DAFTAR LAMPIRAN ... xii
BAB I PENDAHULUAN ... 1
A. Latar Belakang ... 1
B. Rumusan Masalah ... 4
C. Pertanyaan Penelitian ... 4
D. Batasan Masalah ... 5
E. Tujuan Penelitian ... 5
F. Manfaat Penelitian ... 5
BAB II AMPLIFIKASI DNA GEN MC1R IKAN GURAME (Osphronemus gouramy)... 6
A. Ikan Gurame (Osphronemus gouramy) ... 6
B. Sel Melanosit dan Melanogenesis ... 7
C. Gen Melanocortin – 1 Receptor MC1R ... 8
D. Isolasi DNA Genome ... 10
E. Polymerase Chain Reaction (PCR) ... 12
F. Primer Degenerate Nested dan Non Nested ... 15
G. Karakterisasi Gen ... 17
1. Analisis Sequence DNA ... 17
2. Analisis Protein ... 18
3. Pohon Filogenetik ... 19
BAB III METODE PENELITIAN ... 20
A. Jenis Penelitian ... 20
vii
C. Waktu dan Lokasi Penelitian... 20
D. Alat dan Bahan ... 20
E. Alur Penelitian dan Langkah Kerja ... 20
1. Tahap Persiapan ... 20
2. Tahap Penelitian ... 21
a. Mengumpulkan sequence gen MC1R dari berbagai jenis ikan Infraclassis Teleostei ... 21
b. Desain Pasangan Primer Degenerate Gen MC1R ... 22
c. Isolasi DNA Genome Ikan Gurame (Osphronemus gouramy) ... 22
1. Isolasi DNA Kromosom ... 22
2. Pengukuran Konsentrasi DNA ... 23
d. Amplifikasi dengan Metode PCR dan Elektroforesis ... 23
e. Sequenccing DNA dan Analisis Urutan Gen MC1R ... 25
f. Perancangan Primer Spesifik dari Sequence Gen MC1R ... 26
g. Uji Validasi Primer Spesifik Stok DNA Genome Ikan Gurame (Osphronemus gouramy) dan Stok Sampel cDNA Ikan Gurame (Osphronemus gouramy) ... 26
h. Analisis Data Bioinformatika dan Karakterisasi Pohon Filogenetik ... 26
F. Alur Penelitian ... 27
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ... 28
A. Primer DegenerateNonNested dan Nested Gen MC1R ... 28
B. Isolasi DNA Genome Ikan Gurame (Osphronemus gouramy) ... 32
C. Isolasi DNA MC1R Ikan Gurame (Osphronemus gouramy) dengan Primer DegenerateNested dan NonNested ... 34
1. AmplifikasiDNA MC1R Primer Degenerate Non Nested ... 34
2. AmplifikasiDNA MC1R Primer Degenerate Nested ... 38
D. Karakterisasi Gen MC1R Osphronemus gourami ... 39
1. Pensejajaran Sequence Nukleotida Gen MC1R Osphronemus gouramy ... 39
2. Pensejajaran Sequence AsamAmino Gen MC1R Osphronemus gouramy ... 50
3. Analisis Pohon Filogenetik MC1R Osphronemus gouramy ... 56
viii
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ... 62
A. Kesimpulan ... 62
B. Saran ... 62
DAFTAR PUSTAKA ... 63
ix
DAFTAR GAMBAR
Gambar
2.1 Osphronemus gouramy ... 6
2.2 Jalur Melanogenesis ... 8
2.3 Lokasi Gen MC1R ... 9
2.4 Struktur Domain Analisis SMART ... 18
3.1 Program PCR Primer Degenerate Non Nested ... 24
3.2 Program PCR Primer Degenerate Nested ... 24
3.3 Diagram Alur Penelitian... 26
4.1 Hasil Kandidat Primer Degenerate ... 27
4.2 Elektroforesis DNA Genome gurame sampel isolasi DNA terbentuk pita berukuran lebih dari 10.000 bp dengan smear potongan fragmen DNA genome ... 32
4.3 Elektrogram primer MC1R_F1 dan MC1R_R1, produk PCR sampel menunjukan smear tidak terbentuk pita DNA target ... 34
4.4 Elektrogram primer non nested dengan hasil pita DNA tunggal ukuran 600 bp dan primer nested dengan hasil pita DNA tunggal ukuran 400 bp ... 35
4.5 Posisi urutan primer pada sequence MC1R Takifugurubripes... 37
4.6 Contig sequence gen MC1R menggunakan aplikasi DNA Baser ... 39
4.7 Hasil analisis BLASTn sequence MC1R pita berwarna merah menandakan tingkat kesamaan sequence sampel dengan sequence data di GenBank. ... 41
4.8 Hasil analisis BLASTn sequence MC1R berdasarkan kesamaan sequence terhadap sequence DNA Osphronemus gouramy (sampel) dengan data di GenBank NCBI terdapat 100 spesies ikan kesaamaan gen MC1R ... 42 4.9 Hasil alignment sequence basa nukleotida gen MC1R, Basa dengan
highlight berwarna kuning menyatakan kesamaan basa dari setiap spesies sedangkan basa dengan highlight abu-abu menyatakan
x
kesamaan yang dimiliki oleh Osphronemus gouramy dengan beberapa spesies. ... 49 4.10 Hasil analisis BLASTp sequence asam amino gen MC1R
Osphronemus gouramy terdapat 100 spesies dengan total jumlah 200 asam amino didapatkan 100 spesies yang memiliki kesaamaan dengan
sequence DNA Osphronemus gouramy terdapat 12 spesies yang memiliki kesamaan pada posisi awal asam amino berkisar 1-40 ... 50 4.11 Hasil alignment sequence asam amino Gen MC1R, sequence dengan
highlight berwarna kuning menyatakan kesamaan basa dari setiap spesies sedangkan basa dengan highlight hijau menyatakan pernbedaan yang hanya dimiliki oleh Osphronemus gouramy dan kode dengan diberi highlight merah menandakan start codon ... 52 4.12 Struktur domain protein Osphronemus gouramy (a), hasil analisis
SMART didapatkan daerah domain transmembran MC1R, terdapat pada sequence asam amino 1-100 terdapat 2 daerah transmembran dan 3 domain transmembran, struktur domain protein dari Takifugu sp (b) memiliki 7 domain Transmembran ... 54 4.13 Pohon filogenetik Infraclassis Teleostei berdasarkan sequence
nukleotida gen MC1R metode Neighbour-Joining, Osphronemus gouramy berada pada kelompok besar Infraclassis Teleostei dan berada pada kelompok 1 Ordo Perciformes ... 55 4.14 Pohon filogenetik Infraclassis Teleostei berdasarkan sequence asam
amino gen MC1R metode Neighbour-Joining, Osphronemus gouramy
berada pada kelompok besar Infraclassis Teleostei ... 55 4.15 Elektrogram hasil PCR primer spesifik validasi cDNA (a) dan Hasil
PCR Mix DNA (b), keduanya mengamplifikasi DNA dengan ukuran 110 bp ... 58 4.16 Hasil alignment sequence validasi cDNA menggunakan primer
xi
DAFTAR TABEL
Tabel
3.1 Daftar species ikan Ordo Perciformes untuk desain Primer
Degenerate ... 20
3.2 Komposisi reaksi PCR DreamTaq Green PCR MasterMix 2x ... 23
4.1 Kandidat sequence primer nonnested dan nested Primaclade ... 28
4.2 Skala analisis primer PremierBiosoft ... 29
4.3 Nilai kemurnian dan konsentrasi isolasi DNA genome ... 33
4.4 Uji kuantitatif hasil PCR primer nested dan nonnested ... 36
4.5 Hasil BLASTn sequence nukleotida gen MC1R... 40
4.6 Hasil BLASTp sequence asam amino Osphronrmus gouramy ... 51
xii
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran
1 Daftar alat dan bahan penelitian ... 68 2 Protokol pembuatan larutan stok ... 70
