UJI ENDOTOKSIN
Marlia Singgih Wibowo
Pendahuluan
Produk alat kesehatan
Kontaminasi bakteri
Bakteri gram negatif
Kualitas produk farmasi dari aspek
Pendahuluan
Produk farmasi parenteral
Produk-produk farmasi parenteral harus steril karena pemberian langsung ke sistem sirkulasi pembuluh darah.
Salah satu tahap : Sterilisasi
Bagaimana produk parenteral
dapat terkontaminasi endotoksin?
Pada proses sterilisasi produk parenteral
(menggunakan panas), bakteri gram negatif
yang mungkin ada dalam produk, akan mati
dan lisis terjadi, endotoksin akan terlepas
dan tetap tinggal di dalam produk
Endotoksin dan Pirogen
Endotoksin adalah toksin yang dihasilkan oleh
bakteri gram negatif
Pirogen adalah senyawa yang menyebabkan
kenaikan suhu tubuh akibat penggunaan produk farmasi yang diberikan secara intravena
Semua endotoksin bersifat pirogen, tetapi tidak
semua senyawa pirogen itu merupakan endotoksin
Endotoksin bakteri terdiri dari Lipopolisakarida
(LPS), umumnya terikat pada protein dan fosfolipid. LPS ini menyusun membran luar bakteri gram
Struktur LPS
Contoh : LPS dari
Salmonella
terdiri
dari bagian Lipid A yang hidrofob yang
terikat pada suatu daerah inti yang
mengandung molekul KDO
(2-keto-3-deoksioktonat)
Struktur LPS Salmonella
Mannose-Abequose Rhamnose Galactose Glucose-N-acetylglucosamine Galactose Glucose-Galactose Heptulose-P-P-Ethanolamine KDO P-GlcN-GlcN-P Heptulose KDO-KDO-P-Ethanolamine n Lipid A Inti polisakarida Rantai sampingEfek endotoksin bagi tubuh
• demam
• aktivasi sistem sitokin
• rusaknya sel-sel endotelial
• permeabilitas pembuluh darah
berubah sehingga menyebabkan
turunnya tekanan darah
Perkembangan regulasi
tentang uji pirogen
Bacterial endotoxin test
(BET) merupakan
salah satu uji yang penting terhadap produk
parenteral dan alat kesehatan
1912 : uji pirogen dilakukan dengan metode
kelinci (Rabbit test)
Digunakan dalam USP XII pada tahun 1942
sampai 40 tahun kemudian
1980 : metode baru diterapkan yaitu
Limulus amoebocyte lysate (LAL) test
LAL-test
The
Limulus amebocyte lysate
(LAL)
test adalah uji in vitro untuk deteksi
dan analisis kuantitatif endotoksin
bakteri.
Metode analisis LAL yang dilakukan
mencakup teknik gel-clot dan
turbidimetri kinetik dan kromogenik
(kolorimetri)
Mengapa LAL test?
Limulus amebocyte lysate (LAL) test
adalah metode alternatif terhadap
rabbit pyrogen test
yang difokuskan
pada deteksi senyawa pirogen dalam
produk, untuk menghindari
penggunaan hewan/binatang dalam
percobaan
Limulus amebocyte lysate
Lisat diperoleh dari amubosit kepiting landam kuda
(Limulus polyphemus)
Penggunaan LAL untuk deteksi endotoksin berawal
dari pengamatan Bang (1956) bahwa infeksi bakteri gram negatif pada Limulus polyphemus
menyebabkan koagulasi intravaskular yang parah.
Th 1964, Levin and Bang kemudian menunjukkan
bahwa penggumpalan itu merupakan hasil reaksi antara endotoksin dan protein yang dapat
Solum (1970, 1973) dan Young (1972),
melakukan pemurnian dan karaterisasi
protein yang dapat bergumpal dari reaksi
LAL dan menunjukkan bahwa reaksi
dengan endotoksin merupakan reaksi
enzimatik.
Limulus polyphemus
(horseshoe crab)
African Wolf Spider Horseshoe crab
Cara memperoleh lysate
Untuk memperoleh LAL, horseshoe crabs yang
berukuran besar ditangkap, cek kesehatannya, lalu darahnya diambil dengan menggunakan jarum
suntik. Darah kepiting ini lalu disentrifuga untuk memisahkan amoebocytes dari plasma cairnya.
Amoebocyte lalu di freeze-dried dan diproses untuk
digunakan. Harganya : One quart of LAL is worth $15,000!
Tiga perusahaan USA :
{ Associates of Cape Cod: http://www.acciusa.com { Cambrex: http://www.cambrex.com/default.asp { Charles River Endosafe:
Metode LAL yang direkomendasi
oleh FDA – USA
Metode Gel-Clot : prinsip bahwa LAL
menggumpal dengan adanya endotoksin
Metode kinetik turbidimetri : menggunakan
kecepatan pembentukan gel untuk
menentukan kandungan endotoksin
Metode Kromogenik : menggunakan
substrat kromogenik sintetik, dengan
adanya LAL dan endotoksin, menghasilkan
warna kuning dan secara linier ekuivalen
dengan konsentrasi endotoksin yang ada
LAL Chromogenic endotoxin assay utilizes a
modified Limulus Amoebocyte Lysate and a synthetic color-producing substrate to detect endotoxin presence.
This assay is quantitative and the color intensity
developed upon addition of the sample to the LAL supplied with the kit is proportional to the amount of endotoxin present in the sample and can be
calculated from a standard curve.
The kinetic chromogenic quantitative assay for
bacterial endotoxin can be performed at the low assay range (0-5 EU/ml) or the higher range (5-50 EU/ml)
Metode kromogenik ada 2 :
End point chromogenic
Kinetic chromogenic
Pemilihan metode tergantung pada
penggunaan, volume uji, dan tipe
produk
Prinsip LAL test
• Uji LAL memanfaatkan dasar respon imun dari
kepiting landam kuda terhadap invasi bakteri gram negatif.
• Bahan-bahan yang terkandung dalam amubosit kepiting landam kuda terdiri dari berbagai protein, faktor, kofaktor dan ion-ion yang berinteraksi
menyebabkan koagulasi
• Endotoksin Gram negatif mengkatalisis aktivasi
proenzim dalam lisat amubosit Limulus. Kecepatan awal aktivasi ditentukan oleh konsentrasi
Selanjutnya enzim yang diaktivasi (enzim
koagulase) menghidrolisis ikatan spesifik dalam suatu protein penggumpal (koagulogen) yang juga terdapat pada lisat amubosit Limulus menghasilkan koagulin.
Sekali terhidrolisis, koagulin yang dihasilkan
bergabung dengan sendirinya dan membentuk suatu gumpalan/bekuan seperti gel
Skema reaksi enzimatik pada
penggumpalan LAL
ENDOTOKSIN
FAKTOR C FAKTOR C YG DIAKTIVASI
FAKTOR B FAKTOR B YG DIAKTIVASI
PROCLOTTING ENZYME CLOTTING ENZYME KOAGULOGEN
KOAGULIN (GEL) ANTI FAKTOR G
FAKTOR G FAKTOR G YG DIAKTIVASI
Penetapan batas endotoksin
1983 : FDA menentukan batas
endotoksin berdasarkan dosis
maksimum sediaan obat untuk
manusia atau kelinci
dan penyesuaian batas endotoksin
untuk semua obat (kecuali intratekal)
dari 2,5 EU kg
-1sampai 5,0 EU kg
-1
Batas deteksi untuk beberapa produk
diperoleh dari monografi USP atau EP.
Kalau tidak dinyatakan dalam
farmakope, batas endotoksin harus
Beberapa istilah lain untuk
batas deteksi endotoksin
EL: Endotoksin Limit
MAEC (maximum allowable endotoxin
concentration)
ERL (endotoxin release limit)
EL = K/M
K = konstanta = 5 EU atau IU per kg berat
badan, M = dosis maksimum untuk manusia
per kg per jam.
Umumnya dinyatakan sbb :
Batas endotoksin untuk berat badan rata2
70 kg = 350 EU per jam (5 EU kg-1)
Batas endotoksin vs volume
sediaan per jam
Harus diperhatikan bahwa batas endotoksin
dinyatakan per jam. Oleh karena itu konsentrasi yang dibolehkan untuk endotoksin per mililiter injeksi beragam tergantung pada volume
pemberian dalam satu jam.
Suatu dosis tunggal injeksi 1 ml secara teoritis
mengandung 349 EU per ml dan masih diijinkan pada uji endotoksin bakteri, sedangkan infus
dengan volume 1 L harus mengandung kurang dari 0,349 EU per ml
Perhitungan MVD dan MVC
MVD = Maximum Valid Dilution (pengenceran
maksimum)
MVC = Minimum Valid Concentration (konsentrasi
minimum)
MVD dan MVC adalah perhitungan yang
menunjukkan seberapa banyak pengenceran yang harus dilakukan untuk mengatasi kemungkinan
interferensi, sebelum efek pengenceran melampaui kemampuan uji LAL yang digunakan untuk
Kapan digunakan istilah MVD?
MVD biasanya digunakan untuk
sediaan yang berbentuk cairan dimana
pemberian dinyatakan dalam per
mililiter, contoh: dosis tunggal injeksi 2
ml dan batas endotoksin dinyatakan
Kapan digunakan istilah MVC?
MVC biasanya digunakan untuk
sediaan dengan batas endotoksin
dinyatakan dengan EU mg-1 dan dosis
dinyatakan dengan mg/ kg bb.
Penentuan MVD dan MVC tergantung
pada sensitivitas lisat yang digunakan
(
λ).
Semakin sensitif lisat atau metoda,
semakin tinggi MVD atau semakin
rendah MVC
Perhitungan MVC
MVC =
λ M
K
λ = sensitifitas dari lisat yaitu nilai
terkecil dari standar untuk pengujian
kuantitatif
K= konstanta = 0,5 EU kg-1
Perhitungan MVD
MVD = C x K
λ x M
C = konsentrasi obat
K = konstanta = 0,5 EU kg-1
Contoh
Potensi injeksi insulin 100 unit per ml, dosis
maksimum 2 unit per kg dan sensitivitas lisat 0,125 unit/ml, maka
MVD = 100x 5 = 1: 2000
0,125 x 2
Nilai MVD dapat diperoleh dari MVC
LAL test untuk alat kesehatan
Kadar endotoksin pada alat kesehatan diperoleh
dengan prosedur ekstraksi, yaitu dengan cara
merendam sejumlah alat pada cairan pengekstraksi biasanya pereaksi air LAL. Nilai batas 20 EU per alat dinyatakan dalam addendum USP 1997, jadi batas maksimum konsentrasi endotoksin yang
diijinkan dalam cairan hasil ekstraksi (ERL) dihitung dengan rumus:
ERL = K x N/V
K = 20 EU, N = jumlah alat dan V = total volume
Metode Gel-Clot
Pada metode ini, hasil akhir dapat
dideteksi berupa spot pada slide, atau
microplate
Perlu pembanding, berupa Control
Standard Endotoxin (CSE)
Peralatan gelas yang digunakan harus
Prinsip uji dan prosedur
100 ul CSE dimasukkan ke dalam tabung
gelas depirogen (positive control)
LAL reagent water (negative control)
Sampel jumlah sama
+ 100 ul lysate
Inkubasi 37°C di atas penangas air selama
1 jam
Tabung lalu dibalik perlahan (180° ) untuk
melihat solid clot yang terjadi
Hal yang harus diperhatikan
dalam metode gel-clot
Untuk membuat alat-alat depirogen :
pemanasan pada 180°C, selama 4 jam atau
250°C selama 30 menit
Teknik pengerjaan pada saat membalik
tabung kira-kira selama 2 detik
pH sampel 7,0 – 8,0. Jika diperlukan pH
diatur menggunakan asam atau basa
Sensitivitas Lisat pada Gel-Clot
Diperlukan untuk menentukan konsentrasi
minimum endotoksin yang menyebabkan
terjadinya gel
Satuan dinyatakan dalam EU atau IU
Dibuat 1 seri pengenceran endotoksin
(dalam EU/mL) dan percobaan dilakukan
rangkap 4 (quadruplicate)
Titik akhir pengenceran (end-point dilution)
ditentukan pada pengenceran terakhir yang
masih memberikan reaksi positif
Metode kromogenik
Metode kromogenik merupakan metode
LAL test yang paling banyak digunakan saat
ini karena lebih mudah dan murah
Sesuai untuk jumlah produk yang diuji tidak
banyak dan tidak sering (infrequent)
Digunakan untuk uji sampel serum pada uji
klinis
Prinsip uji dan prosedur
Endotoksin akan mengkatalisis aktivasi
suatu proenzim
Enzim yang teraktivasi akan mengkatalisis
terpecahnya PNA dari substrat
Ac-Ile-Glu-Ala-Arg-PNA
PNA yang dilepaskan diukur secara
spektrofotometri pada 405 nm
Nilai absorbans sebanding dengan jumlah
endotoksin , dibandingkan terhadap
endotoksin standard menggunakan kurva
standard
New Discoveries
Alternatif thp LAL saat ini telah berhasil diteliti di
India dan China, yaitu pereaksiTAL, or Tachypleus amoebocyte lysate, fungsinya mirip dengan LAL, juga untuk deteksi gram-negative bacteria.
Scientists di Singapore tengah meneliti cloning
gene pendeteksi toxin dalam darah horseshoe crab. Jika gen tsb dapat di klon derivat LAL dapat dibuat tanpa harus menggunakan horseshoe crabs untuk ekstraksi darahnya.
