BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil
4.1.1 Hasil pengamatan peremajaan jamur
Kultvir mumi hasil isolasi laboratorium Biokimia FMIPA Universitas Riau yaitu jamur Trichoderma asperellum TNC52 dan TNJ63. Kedua jamur tersebut diremajakan pada medium agar miring PDA. Masing-masing jamur selanjutnya diinkubasi selama 5 hari pada temperatur kamar. Pada hari kedua, kedua jamur ini ditumbuhi spora. Spora ini kemudian membentuk konidiofora dewasa pada hari kelima. Masing-masing jamur tumbuh dengan koloni yang berbeda. Jamur T. asperellum TNC52 koloninya berwama hijau muda, sedangkan jamur T. asperellum TNJ63 koloninya berwama hijau tua. Setelah lima hari, kedua jamur ini diinokulasikan pada medium cair produksi enzim laminarinase.
4.1.2 Penentuan kondisi aktivitas laminarinase
Aktivitas enzim laminarinase ditentukan menurut pengukuran yang dilakukan oleh Vazquez-Garciduenas dkk. (1998) yaitu pada suhu 40*'C, pH 5,5 selama 1 jam atau menurut Nugroho dkk. (2003) pada suhu 40°C, pH 5,5 selama 24 jam untuk berbagai kitinase produksi T. asperellum TNJ63. Hasil uji Student-t (Tabel 3) membuktikan adanya perbedaan yang signifikan secara statistik konsentrasi gula pereduksi antara sampel dengan kontrol pada kedua kondisi pengukuran. Konsentrasi gula pereduksi sampel berbeda secara signifikan (p<0,05) lebih tinggi dari kontrol. Hal ini menimjukkan bahwa T. asperellum TNC52 menghasilkan enzim laminarinase, dan aktivitas ini terukur setelah produksi 1 jam dan 24 jam. Perbandingan aktivitas enzim hasil inkubasi substrat dengan sampel ekstrak kasar enzim selama I jam atau 24 jam dengan menggunakan uji Student-t menunjukkan perbedaan yang signifikan (Tabel 4 dan Lampiran 3). Aktivitas enzim laminarinase produksi T. asperellum TNC52 setelah inkubasi 1 jam, lebih tinggi secara signifikan (p<0,05) daripada waktu inkubasi
Tabel 3. Rata-rata konsentrasi gula pereduksi pada penentuan kondisi aktivitas enzim laminarinase T. asperellum TNC52 pada hari ketiga waktu produksi.
Waktu
Rata-rata konsentrasi gula pereduksi (jig/ml)*^ Uji - 1 pada p = 0,05 Kesimpulan Waktu Sampel Kontrol Uji - 1 pada p = 0,05 Kesimpulan
1 jam 29,346 ±1,258 2,945 ± 0,268 t Hitung>t tabel 41,0591>2,4470
Ada perbedaan yang signifikan 24 jam 377 ± 15,9098 6,034 ± 0,435 t Hitung>t tabel
46,6160>2,4470
Ada perbedaan yang signifikan
Rata-rata dari empat kali pengulangan
Tabel 4. Rata-rata aktivitas enzim laminarinase T. asperellum TNC52 pada hari ketiga waktu produksi.
Waktu Rata-rata aktivitas enzim laminarinase (Unit/ml)*^
Uji-t pada p = 0,05 Kesimpulan
1 jam 0,0098 ±0,00000015 t hitung > t tabel 15,3182 >2,4470 Ada perbedaan yang signifikan 24 jam 0,0057 ±0,000000025 t hitung > t tabel 15,3182 >2,4470 Ada perbedaan yang signifikan
Rata-rata dari empat kali pengulangan
4.1.3 Uji aktivitas ekstrak kasar laminarinase T. asperellum TNC52 dan TNJ63
Aktivitas ekstrak kasar enzim laminarinase ditentukan sebagai jumlah gula pereduksi yang dilepaskan oleh kerja enzim per satuan waktu. Kadar gula pereduksi ditentukan dengan metode Nelson-Somogyi (Green I I I dkk., 1989) Besamya aktivitas enzim laminarinase dari T. asperellum TNC52 sebagai ftmgsi dari waktu produksi dapat dilihat pada Gambar 7 dan Tabel 5, sedangkan T. asperellum TNJ63 dapat dilihat pada Gambar 8 dan Tabel 6.
Hasil Anava dan uji Duncan jarak berganda menunjukkan bahwa rata-rata aktivitas enzim laminarinase T. asperellum TNC52 dengan waktu produksi 2 hari, 3 hari dan 7 hari berbeda secara signifikan, sedangkan prodviksi 3 hari dengan 5 hari tidak menunjukkan perbedaan yang signifikan (lihat Lampiran 7 dan 8). Aktivitas ekstrak kasar enzim laminarinase tertinggi adalah pada waktu produksi 3 hari sebesar 0.0098 ± 0,0005 unit/ml ekstrak kasar enzim dan 5 hari sebesar 0,0105 ±0,0005 unit/ml.
Tabel 5. Aktivitas laminarinase berdasarkan variasi waktu produksi enzim dari T. asperellum TNC52.
Waktu (Hari) Aktivitas (Unit/ml)'^
2 (0,0011 ±0,0012)^
3 (0,0098 ±0,0005)"
5 (0,0105* 0,0005)"
7 (0,0059 ± 0,0002)'
Satu unit aktivitas enzim didefinisikan sebagai banyaknya enzim yang melepaskan 1 (imol gula pereduksi per menit. Harga rata-rata dengan pangkat huruf yang berbeda adalah berbeda secara signifikan pada tingkat keterpercayaan 95% ip < 0,05) berdasarkan uji Duncan jarak berganda.
Grafik waktu produksi vs Aktivitas Laminarinase 0,012 T
I
0,01 I ^ 0,008 I 0,006 I B 0,004 ^ 0,002 0 0 2 4 6 8Hasil analisis statistik Anava dan uji Duncan jarak berganda menunjukkan bahwa rata-rata aktivitas enzim laminarinase T. asperellum TNJ63 dengan waktu produksi 3 hari, 5 hari, dan 7 hari berbeda secara signifikan (lihat lampiran 12 dan 13). Aktivitas ekstrak kasar enzim laminarinase tertinggi adalah pada waktu produksi 5 hari sebesar (0.0090 ± 0,0004) unit/ml ekstrak kasar enzim.
Tabel 6. Aktivitas laminarinase berdasarkan variasi waktu produksi enzim dari T. asperellum TNJ63
Waktu (Hari) Aktivitas (Unit/ml)
3 (0 ± 0,000)*
5 (0.0090 ±0,0004)"
7 (0,0076 ±0,0003)'
Satu unit aktivitas enzim didefinisikan sebagai banyaknya enzim yang melepaskan 1 ^.mol gula pereduksi per menit. Harga rata-rata dengan pangkat huruf yang berbeda adalah berbeda nyata pada tingkat keterpercayaan 95% {p < 0,05) berdasarkan uji Duncan jarak berganda.
Grafik Waktu Produksi vs Aktivitas Laminarinase 0,01 T I ^ 0,008 W *i 0,006 *3 0,004 ^ 0,002 0 0 2 4 6 8
Waktu Produksi (Hari)
Gambar 8. Aktivitas enzim laminarinase berdasarkan variasi waktu produksi enzim dari T. asperellum TNJ63.
4.1.4 Perbandingan aktivitas laminarinase oleh T. asperellum lokal Riau pada waktu produksi maksimum.
Hasil uji Student-t (Tabel 7) aktivitas ekstrak kasar enzim laminarinase T. asperellum TNC52 dan TNJ63 pada waktu produksi maksimum, membuktikan aktivitas enzim laminarinase T. asperellum TNC52 secara nyata (p<0,05) lebih tinggi dari T. asperellum TNJ63.
Tabel 7. Rata-rata aktivitas ekstrak kasar enzim laminarinase T. asperellum TNC52 dan TNJ63 pada waktu produksi maksimum
Sampel jamur Rata-rata aktivitas enzim laminarinase (Unit/ml)*^ Uji-t pada p = 0,05 Kesimpulan T. asperellum TNC52 0,0102 ±0,0005 t hitung> t tabel 4,54294>2,447 Ada perbedaan yang signifikan T. asperellum TNJ63 0,0090 ± 0,0004 t hitung> t tabel 4,54294>2,447 Ada perbedaan yang signifikan
Rata-rata dari empat kali pengulangan
4.1.5 Kadar proteia ekstrak kasar enzim laminarinase dari jamur T. asperellum TNC52» T. asperellum TNJ63 dan laminarinase komersial dari Trichoderma sp.
Kadar protein ekstrak kasar enzim ditentukan dengan metode Lowrey pada panjang gelombang 750 nm. Ekstrak kasar enzim yang di ukur adalah ekstrak kasar yang didapat pada waktu produksi tertinggi untuk kedua jamiu*. Sedangkan enzim komersial dari Trichoderma sp. yang di ukur adalah sebanyak (0.0025 ± 0,0008) mg/ml. Kadar protein yang didapat ditunjukkan pada Tabel 8.
Tabel 8. Kadar protein ekstrak kasar enzim laminarinase T. asperellum TNC52, T, asperellum TNJ63 dan enzim laminarinase komersial dari Trichoderma sp.
Sampel jamur Rata-rata kadar protein (mg/ml)*> T. asperellum TNC52 (0,0110 ±0,0015)^ T. asperellum TNJ63 (0,0121 ±0,0011)* Trichoderma sp. (komersial) (0,0025 ± 0,0008)"
Rata-rata dari empat kali pengulangan. Harga rata-rata dengan pangkat huruf yang berbeda adalah berbeda nyata pada tingkat keterpercayaan 95% ip < 0,05) berdasarkan uji Duncan jarak berganda.
4.1.6 Aktivitas spesifik ekstrak kasar enzim laminarinase dari jamur T. asperellum TNC52, T. asperellum TNJ63 dan laminarinase komersial dari Trichoderma sp.
Aktivitas spesifik ditentukan dengan cara membagi rata-rata aktivitas enzim dengan kadar proteinnya. Dari perhitvmgan diperoleh aktivitas spesifik dari masing-masing jamur adalah seperti yang ditunjukkan pada Tabel 9. Rata-rata aktivitas spesifik paling tinggi adalah enzim komersial dari Trichoderma sp.
Tabel 9. Rata-rata aktivitas spesifik enzim laminarinase dari jamur T. asperellum TNC52, T. asperellum TNJ63 dan laminarinase komersial dari Trichoderma sp.
Sampel jamur Rata-rata aktivitas spesifik enzim (Unit/mg protein)*^
T. asperellum TNC52 (0,9046 ±0,1257)' T. asperellum TNJ63 (0,7480 ±0,0616)* Trichoderma sp. (komersial) (3,6302 ± 0,SS76f
Satu unit aktivitas spesifik enzim didefinisikan sebagai banyaknya enzim yang melepaskan I ^mol gula pereduksi per menit per mg protein. Harga rata-rata dengan pangkat huruf yang berbeda adalah berbeda nyata pada tingkat keterpercayaan 95% (p < 0,05) berdasarkan uji Duncan jarak berganda.
Data aktivitas spesifik dari masing-masing ekstrak kasar enzim laminarinase pada masing-masing jamur dianalisis dengan menggunakan metode Anava dan Duncan jarak berganda (lihat lampiran 22 dan 23 untuk pengamatan lebih lengkap). Hasil analisis Anava dari ketiga jamur tersebut diperoleh aktivitas
spesifik yang berbeda nyata (/K0,05). Tabel 9 menunjukkan bahwa dari analisis statistik Duncan jarak berganda, temyata rata-rata aktivitas spesifik pada jamur T. asperellum TNC52 dan TNJ63 tidak ada perbedaan yang signifikan. Sedangkan rata-rata aktivitas spesifik Trichoderma sp. komersial secara nyata (p<0,05), lebih tinggi dari kedua Trichoderma sp. lokal Riau.
4.2 Pembahasan
4.2.1 Penentuan kondisi aktivitas enzim laminarinase
Penentuan kondisi aktivitas enzim laminarinase bertujuan agar ditemukaimya kondisi terbaik untuk mendapatkan aktivitas enzim tertmggi. Dari hasil penelitian ini, aktivitas enzim inkubasi 1 jam lebih baik dari pada 24 jam pada suhu 40"C, pH 5,5 bufer Na-asetat 0,05 M . Terjadinya perbedaan yang signifikan antara inkubasi sampel dengan substrat selama 1 jam dan 24 jam, disebabkan terjadinya denaturasi enzim akibat inkubasi 24 jam pada suhu 40"C. Denaturasi enzim akan menyebabkan hilangnya aktivitas enzim.
4.2.2 Produksi enzim laminarinase
Trichoderma sp. lokal Riau terbukti dapat menghasilkan enzim laminarinase, yang diproduksi secara ekstemal. Hal ini dibuktikan adanya aktivitas enzim laminarinase pada media pertumbuhannya. Isolasi enzim ekstraseluler ini dilakukan dengan cara sentrifiiga dingin untuk memisahkan sel jamur dengan media pertumbuhannya sehingga diperoleh ekstrak kasar enzim ekstraseluler (Darwis dan Sukara, 1990). Media cair pada penelitian ini menggunakan laminarin yang berfungsi sebagai sumber karbon dan merangsang produksi enzim laminarinase berdasarkan prinsip induksi gen (Whatson dkk,
1992). Penstabil enzim dan untuk mencegah berkurangnya aktivitas enzim selama proses fermentasi berlangsung, maka pada media cair ditambahkan 1% polivinilpirolidon. Apabila ekstrak kasar enzim yang didapat akan disimpan, terlebih dahulu disterilisasi dengan Corning sterile syringe filter 0,45 pm agar ekstrak kasar enzim bebas dari miselia-miselia dan spora jamur yang dapat
mencegah rusaknya enzim karena adanya bakteri atau mikroba lairmya jika terjadi kontaminasi.
Enzim laminarinase yang diekstrak dari Trichoderma sp. lokal Riau merupakan enzim induktif, dimana produk induktif sangat dipengaruhi oleh senyawa yang mampu menginduksi pembentukan enzim tersebut. Laminarin (substrat) sebagai induser mampu mendeaktifasi protein represor pada kondisi tidak adanya glukosa, maka RNA-polimerase dapat berikatan dengan promotor sehingga transkripsi dapat berlangsimg imtuk menghasilkan enzim laminarinase
Produksi laminarinase Trichoderma sp. lokal Riau mengalami penimman aktivitas setelah hari kelima untuk T. asperellum TNC52 dan T. asperellum TNJ63, sesuai dengan adanya gen ere I yang diinduksi oleh glukosa. CREl adalah protein represor gen penghasil karbohidrase (Ilmen dkk., 1996). Dalam hal ini glukosa akan merepresi gen laminarinase, secara tidak langsvmg melalui induksi gen ere I. Apabila jumlah laminarinase dalam media sudah cukup banyak imtuk menghidrolisis laminarin menjadi glukosa, dan konsentrasi glukosa sudah melebihi kebutuhan, maka glukosa berlebih akan merepresi gen laminarinase secara tak langsung. Glukosa dapat merepresi gen laminarinase, yaitu dengan menginduksi gen represor ere I imtuk menghasilkan lebih banyak represor dari gen laminarinase. Menurunnya aktivitas laminarinase di atas hari kelima dan ketujuh, menunjukkan produksi laminarinase yang berkurang, disebabkan konsentrasi glukosa sudah cukup dalam media pertumbuhan jamur (Ilmen dkk., 1996).
Aktivitas laminarinase T. asperellum TNC52 dan TNJ63 terdapat dalam ekstrak kasar enzim pada berbagai variasi waktu produksi enzim. Aktivitas tertinggi untuk T. asperellum TNC52 diperoleh pada hari ketiga hingga kelima fermentasi, dengan nilai rata-rata sebesar (0.0102 ± 0,0005) unit/ml ekstrak kasar enzim. Aktivitas tertinggi laminarinase dari T. asperellum TNJ63 terdapat pada hari kelima fermentasi, yakni sebesar (0,0090 ± 0,0004) unit/ml ekstrak kasar enzim. Kondisi ini menunjukkan bahwa T. asperellum TNC52 maupun TNJ63 terinduksi untuk memproduksi laminarinase bila ada laminarin, dan konsentrasi glukosa sedikit.
Waktu untuk mencapai produksi maksimum laminarinase Trichoderma sp. lokal Riau lebih lambat jika dibandingkan Trichoderma harzianum IMI206040 galur Meksiko dan Trichoderma viride U-1 galur Jepang. T. harzianum IMI206040 dan T. viride U-1 menghasilkan aktivitas laminarinase maksimum pada hari kedua fermentasi (Vasquez-Garciduenas dkk, 1998 dan Nobe dkk, 2003). Kemungkinan T. harzianum IMI206040 dan T. viride U-1 memiliki respon yang lebih cepat terhadap laminarin di lingkungaimya, dibanding Trichoderma sp. Lokal Riau. T. harzianum IMI206040 pada hari kedua waktu produksi memiliki aktivitas spesifik laminarinase ekstrak kasar sebesar 40.000 unit/mg protein (Vasquez-Garciduenas dkk, 1998). T. viride U-1 memiliki aktivitas spesifik ekstrak kasar sebesar 2,34 unit/mg protein (Nobe dkk, 2003). Nilai-nilai ini lebih tinggi dari aktivitas enzim spesifik laminarinase ekstrak kasar T asperellum TNC52 dan TNJ63 masing-masing sebesar (0,9046 ± 0,1257) unit/mg protein dan (0,7480 ± 0,0616) unit/mg protein. Hal ini menimjukkan keunggulan T. harzianum IMI206040 dan T. viride U-1 dalam menghasilkan laminarinase.
4.2.3 Kadar protein ekstrak kasar enzim laminarinase T. asperellum TNC52, T. asperellum TNJ63 dan enzim laminarinase komersial dari Trichoderma sp.
Kadar protein dari ekstrak kasar enzim laminarinase ditentukan dengan metode Lowrey. Pada pengukuran kadar protein dilakukan pengendapan larutan ekstrak kasar enzim dengan penambahan aseton dingin (-20°C) yang bertujuan untuk memisahkan protein dari gula pereduksi terlarut yang dapat mengganggu penentuan protein dengan metoda Lowrey, karena gula pereduksi dalam ekstrak kasar dapat mereduksi Cu^^ yang ada pada reagen Lowrey.
4.2.4 Aktivitas spesifik ekstrak kasar enzim laminarinase
Aktivitas spesifik enzim menunjukkan suatu ukuran kemumian enzim. Semakin tinggi aktivitas spesifik enzim maka semakin tinggi juga tingkat
rendah secara signifikan (p<0,05) dengan aktivitas spesifik laminarinase komersial (Tabel 9). Hal ini menimjukkan bahwa enzim laminarinase komersial lebih mumi dari enzim laminarinase Trichoderma sp. lokal Riau.
