ISOLASI DAN KARAKTERISASI EKSTRAK KASAR

ISOLASI DAN KARAKTERISASI EKSTRAK KASAR

ENZIM XILANASE DARI

Aspergillus niger

Sutrisno

Jurusan Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Brawijaya, Malang, Indonesia

Email : tris_mc@brawijaya.ac.id

Abstrak. Penelitian ini bertujuan untuk mengkarakterisasi ekstrak kasar enzim xilanase, hasil isolasi dari Aspergillus niger dengan induser jerami padi, menggunakan substrat xilan. Karakterisasi enzim xilanase meliputi kondisi optimum aktivitas enzim dan parameter kinetika reaksi enzimatis. Produksi ekstrak kasar enzim dilakukan dengan cara menginokulasikan Aspergillus niger dalam media cair, kemudian diinkubasi pada shaker dengan kecepatan 150 rpm pada temperatur kamar dan diisolasi pada jam ke-98. Isolasi ekstrak kasar enzim menggunakan metode sentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm selama 30 menit pada pH 5, temperatur 4 oC. Ekstrak kasar enzim yang dihasilkan sebesar 400 mL. Aktivitas xilanase diukur pada variasi pH (5,0; 6,0; 7,0; 8,0; 9,0), temperatur (40, 45, 50, 55, 60) oC dan waktu inkubasi (40, 45, 50, 55, 60) menit. Gula pereduksi yang terbentuk ditentukan secara spektrofotometri dengan reagen Nelson-Somogyi. Hasil penelitian menunjukkan bahwa kondisi optimum aktivitas ekstrak kasar enzim xilanase dalam menghidrolisis xilan menjadi gula pereduksi terjadi pada pH 8,0, temperatur 55 o

C dan waktu inkubasi selama 55 menit dengan aktivitas sebesar (25,7331 ± 0,4268) unit, sedangkan Vm dan KM yang dihasilkan masing-masing sebesar 27,25 unit dan KM 0,4251 %.

Kata kunci : Aspergillus niger, Xilanase, kondisi optimum, reagen Nelson-Somogyi

1.

Pendahuluan

Enzim xilanase merupakan biokatalis reaksi hidrolisis xilan (hemiselulosa) menjadi gula pereduksi. Xilan merupakan polimer xilosa yang berikatan β-1,4 dengan jumlah monomer 30-100 unit (Schlegel dan Schmidt, 1994). Pemanfaatan enzim xilanase dalam dunia industri memiliki peranan yang sangat penting, misalnya pada pembuatan kertas, pembuatan gula xilosa, produksi makanan dan minuman, produksi pakan ternak, peningkatan kualitas roti, penyerap air dan produksi biofuel (Dashek, 1997).

Enzim xilanase dapat dihasilkan oleh sejumlah mikroorganisme seperti: A. niger, Bacillus, Cryptococcus, Penicillium, Aureo-basidium, Fusarium, Rhizomucor, Humicola (Haltrich et al., 1996). Semua mikroorganisme memerlukan media yang mengandung sumber karbon untuk pertumbuhannya. Mikroorganisme penghasil xilanase memerlukan xilan sebagai sumber karbon. Xilan mahal harganya sehingga penggunaan senyawa murni secara langsung dalam media produksi memerlukan biaya cukup tinggi. Jerami padi merupakan limbah pertanian yang sangat melimpah. Komposisi jerami padi sebagian besar merupakan polisakarida, sehingga dapat digunakan sebagai sumber karbon pada media pertumbuhan kapang. Jerami padi mengandung selulosa 34,6 %, hemiselulosa (xilan) 30,4 %, lignin 6,3 % (Muller, 1978 dalam Pearce, 1983). Berdasarkan kandungan xilan dalam jerami padi yang cukup tinggi, maka dalam penelitian ini digunakan jerami padi sebagai sumber karbon.

Kemampuan enzim dalam mengkatalisis reaksi kimia dipengaruhi oleh kondisi lingkungan yang meliputi pH, temperatur dan waktu inkubasi. Xilanase yang dihasilkan oleh A. nidulans mempunyai aktivitas paling tinggi pada pH 5-6 dan temperatur 50-55 oC (Reis et al., 2003) Konstanta Michaelis-Menten (KM) merupakan konsentrasi substrat pada saat kecepatan reaksi telah mencapai ½ kecepatan

maksimum. Sedangkan Vm merupakan kecepatan reaksi bila enzim telah jenuh dengan substrat. Setiap enzim mempunyai nilai tetapan Michaelis-Menten tertentu. Nilai KM dapat digunakan untuk

memperkirakan jumlah subtrat yang diperlukan agar reaksi ezimatis berjalan efisien. Dengan mengetahui nilai KM dan Vm suatu enzim maka dapat dilakukan optimalisasi penggunaan enzim tersebut sebagai biokatalisator reaksi pemecahan substrat menjadi produk.

Dengan demikian, enzim xilanase yang dihasilkan oleh kapang A. niger dengan sumber xilan jerami padi, perlu ditentukan karakternya, agar diketahui kondisi optimum kerja enzim dan parameter kinetiknya.

Kultur murni A. niger diperoleh dari Laboratorium Mikrobiologi PAU Universitas Gadjah Mada Yogyakarta dan jerami padi yang digunakan adalah jenis IR 64.

Penanaman biakan Murni A. niger

Disiapkan jarum ose, kemudian dilakukan pemindahan secara aseptis kapang A. niger ke dalam media padat dan diinkubasi selama 4 sampai 6 hari pada temperatur 30oC.

Pembuatan Inokulum

Pembuatan inokulum dilakukan dengan mengambil spora dari biakan murni A. niger yang telah berumur 4-6 hari dari satu agar miring, kemudian disuspensikan dalam 8 mL akuades setril. Suspensi diambil masing-masing sebanyak 2 mL dan ditanam dalam tiga buah erlenmeyer yang masing-masing

berisi 13 mL media cair steril. Selanjutnya, media tersebut diinkubasi dalam shaker selama 49 jam.

Preparasi jerami padi.

Jerami padi kering digiling, lalu disaring, material yang lolos 150 mesh selanjutnya dicuci dengan air panas beberapa kali , kemudian dikeringkan dalam oven.

Produksi Enzim

Disiapkan 3 buah erlenmeyer 250 mL, yang masing-masing berisi 150 mL media cair, kemudian disterilkan dalam autoklaf pada temperatur 121 oC dengan tekanan 15 psi selama 15 menit. Setelah dingin, ditambahkan secara aseptis 15 mL inokulum. Selanjutnya media tersebut diinkubasi dalam shaker dengan kecepatan 150 rpm pada temperatur kamar selama 98 jam, setelah itu dilakukan isolasi enzim.

Isolasi Enzim

Pada akhir masa inkubasi (98 jam), enzim xilanase diisolasi dengan metode sentrifugasi. Pada masing-masing media cair ditambah dengan 15 mL buffer asetat pH 5,0 dan disentrifuse dengan kecepatan 3000 rpm selama 30 menit pada temperatur 4 oC. Supernatan yang diperoleh merupakan ekstrak kasar enzim xilanase.

Uji Aktivitas Ekstrak Kasar Enzim Xilanase (Isil, 2005)

Disiapkan 5 buah tabung reaksi, masing-masing diisi substrat xilan 1 % (b/v) sebanyak 1,0 mL. Kemudian diinkubasi dalam penangas air pada temperatur 60 oC selama 15 menit. Kemudian ditambah ekstrak kasar enzim xilanase sebanyak 1,0 mL, buffer asetat pH 5,0 sebanyak 1,0 mL dan diinkubasi pada temperatur 60 oC selama 50 menit. Setelah itu, masing-masing tabung diinkubasi pada penangas air mendidih selama 15 menit dan didinginkan dalam air es hingga mencapai temperatur kamar. Kemudian dianalisis kadar gula pereduksi secara spektrofotometri menggunakan reagen Nelson-Somogyi.

Penentuan Kondisi Optimum Enzim Xilanase

a. Penentuan pH optimum

Untuk menentukan pH optimum dilakukan uji aktivitas dengan menggunakan ekstrak kasar enzim xilanase pada variasi pH 5,0; 6,0; 7,0; 8,0; 9,0 dengan cara sebagai berikut: disediakan 5 buah tabung reaksi, masing-masing diisi dengan 1,0 mL substrat xilan 1 % (b/v), yang pHnya telah diatur sebelumnya, yaitu pH 5,0; 6,0; 7,0; 8,0; 9,0. Kemudian diinkubasi di atas penangas air pada temperatur 60oC selama 15 menit. Selanjutnya ditambahkan 1,0 mL ekstrak kasar enzim xilanase dan 1,0 mL buffer asetat pH 5,0; 6,0; 7,0; 8,0; 9,0. Tiap campuran ini diinkubasi pada temperatur 60oC selama 30 menit. Setelah selesai diinkubasi, untuk menghentikan hidrolisis, tabung dimasukkan dalam penangas air mendidih selama 15 menit. Kemudian didinginkan dalam air es sampai temperatur sama dengan temperatur kamar. Kadar gula pereduksi tiap tabung dianalisis secara spektrofotometri menggunakan reagen Nelson-Somogyi.

b. Penentuan temperatur optimum

Untuk menentukan temperatur optimum dilakukan uji aktivitas ekstrak kasar enzim xilanase pada pH optimum yang diperoleh pada percobaan sebelumnya (a). Temperatur divariasi, yaitu (40; 45; 50; 55; 60) o

C selama 30 menit.

Untuk menentukan waktu inkubasi optimum dilakukan uji aktivitas ekstrak kasar enzim xilanase pada pH dan temperatur optimum yang diperoleh pada percobaan sebelumnya (a) dan (b). Waktu inkubasi divariasi selama (40; 45; 50; 55; 60) menit.

d.Penentuan Vm dan KM

Harga Vm dan KM ditentukan melalui uji aktivitas ekstrak kasar enzim xilanase dengan substrat xilan pada pH, temperatur dan waktu inkubasi optimum yang diperoleh pada percobaan sebelumnya. Variasi konsentrasi substrat xilan sebesar (0,1; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0) % (b/v).

Pengukuran Aktivitas Enzim Xilanase

Aktivitas enzim xilanase dinyatakan dalam Unit. Satu Unit aktivitas enzim adalah banyaknya μg gula pereduksi yang dihasilkan oleh 1 mL enzim dalam setiap menit. Pengukuran aktivitas enzim dilakukan dengan mengkonversikan nilai absorbansi yang diperoleh ke dalam persamaan linier kurva standar gula pereduksi, kemudian dihitung dengan rumus sebagai berikut (Lehninger, 1997)

AE = p.q x.V.fp

di mana:

AE = aktivitas enzim (µg/mL.menit) x = konsentrasi gula pereduksi (µg/mL) V = volume total sampel tiap tabung (mL) p = jumlah enzim (mL)

q = waktu reaksi (menit) fp = faktor pengenceran

3. HASIL DAN PEMBAHASAN

Isolasi Ekstrak Kasar Enzim Xilanase dari A. niger

Tahap awal sebelum mengisolasi ekstrak kasar enzim xilanase adalah membuat inokulum dan dilanjutkan dengan produksi enzim. Enzim xilanase dihasilkan oleh kapang A. niger dengan menggunakan sumber xilan jerami padi. Jerami padi mengandung karbohidrat cukup tinggi, sehingga dapat digunakan sebagai sumber energi kapang dalam menginduksi enzim xilanase. Proses isolasi ekstrak kasar enzim dilakukan dengan metode sentrifugasi, dari 450 mL media cair yang digunakan dihasilkan supernatan yang merupakan ekstrak kasar enzim xilanase sebanyak 400 mL.

Keberhasilan isolasi enzim ditentukan melalui uji aktivitas enzim dengan substrat xilan. Terbentuknya gula pereduksi ditandai dengan terbentuknya endapan Cu2O berwarna merah bata. Pemilihan substrat xilan untuk uji aktivitas ini didasarkan pada kandungan xilan yang merupakan hemiselulosa murni tanpa adanya lignin, yang sulit untuk dihidrolisis oleh enzim xilanase, sehingga mengoptimalkan hidrolisis xilan oleh ekstrak kasar enzim xilanase.

Penentuan Kondisi Optimum

Aktivitas enzim dipengaruhi oleh beberapa faktor, antara lain pH, temperatur dan waktu inkubasi. Untuk mengetahui aktivitas optimum, maka dilakukan pengukuran aktivitas dengan variasi kondisi yang berbeda.

Penentuan pH Optimum

Enzim memiliki pH optimum yang karakteristik, yaitu pH yang dapat menghasilkan aktivitas maksimal dalam mengkatalisis suatu reaksi. Perubahan pH berpengaruh terhadap aktivitas enzim, karena muatan gugus-gugus yang terdapat di dalam protein enzim, yaitu gugus karboksil dan asam amino, mengalami perubahan tingkat ionisasi.

Gambar 1. menunjukkan bahwa aktivitas optimum ekstrak kasar enzim xilanase adalah pada pH optimum, yaitu pH 8 dengan aktivitas rata-rata sebesar (21,7721 unit ± 0,1848). Hasil pH optimum ini sedikit berbeda dengan hasil penelitian yang dilakukan Coral, et al (2002), yang melaporkan bahwa aktivitas maksimum enzim xilanase terjadi pada pH 7,5.

terhadap ionisasi gugus fungsi, yang dapat menyebabkan terjadinya perubahan konformasi enzim xilanase

Gambar 1. Kurva pengaruh pH terhadap aktivitas ekstrak kasar enzim xilanase

Penentuan Temperatur Optimum

Enzim memiliki temperatur optimum dalam melakukan fungsinya, sehingga diperoleh aktivitas enzim maksimum. Gambar 2. menunjukkan bahwa aktivitas optimum ekstrak kasar enzim xilanase dicapai pada temperatur 55 oC, dengan aktivitas rata-rata sebesar (22,6054 ± 1,1655) unit. Hal ini sesuai dengan penelitian yang dilakukan oleh Sunna dan Antraniklan (1997) dalam Richana (2002), yaitu temperatur optimum enzim xilanase berkisar antara (50-60) oC.

0

Gambar 4. Kurva pengaruh temperatur terhadap aktivitas ekstrak kasar enzim xilanase

Peningkatan temperatur menyebabkan aktivitas ekstrak kasar enzim meningkat. Hal ini disebabkan oleh temperatur yang makin tinggi akan meningkatkan energi kinetik, sehingga menambah intensitas tumbukan antara substrat dengan enzim. Tumbukan yang sering terjadi akan mempermudah pembentukan kompleks enzim-substrat, sehingga produk yang terbentuk makin banyak. Pada temperatur optimum, tumbukan antara enzim dan substrat sangat efektif, sehingga pembentukan kompleks enzim-substrat makin mudah dan produk yang terbentuk meningkat. Peningkatan temperatur lebih lanjut akan menurunkan aktivitas ekstrak kasar enzim. Hal ini disebabkan karena enzim mengalami denaturasi. Enzim mengalami perubahan konformasi pada temperatur yang terlalu tinggi, sehingga substrat terhambat dalam memasuki sisi aktif enzim (Lakitan, 2004).

Penentuan Waktu Inkubasi Optimum

Waktu inkubasi adalah waktu yang dibutuhkan oleh enzim untuk berikatan dengan substrat. Penentuan waktu inkubasi optimum ekstrak kasar enzim xilanase dilakukan pada kondisi optimum yang telah diperoleh sebelumnya, yaitu pada pH 5 dan temperatur 60 oC.

0

Gambar 3. Kurva pengaruh waktu inkubasi terhadap aktivitas ekstrak kasar enzim xilanase

Penambahan waktu inkubasi akan meningkatkan aktivitas ekstrak kasar enzim. Sisi aktif enzim dalam mengikat substrat secara optimum membutuhkan waktu yang cukup. Jika waktu yang dikondisikan pada enzim dan substrat kurang dari cukup, maka sisi aktif enzim belum optimal dalam mengikat substrat, sehingga produk yang terbentuk masih sedikit pada saat reaksi dihentikan. Pada saat waktu inkubasi optimum, substrat terikat secara maksimum oleh sisi aktif enzim, sehingga pada saat ini dihasilkan produk yang melimpah. Aktivitas enzim mengalami penurunan dengan penambahan waktu inkubasi lebih lanjut. Produk gula pereduksi yang dihasilkan dari reaksi enzimatis sebanding dengan lama waktu inkubasi, tetapi jika sisi aktif enzim telah jenuh oleh substrat, maka lama waktu inkubasi kurang berpengaruh, sehingga produk yang dihasilkan hanya mengalami peningkatan yang relatif kecil.

Penentuan Parameter Kinetika Reaksi Enzimatis

Konsentrasi substrat merupakan salah satu faktor yang dapat mempengaruhi aktivitas enzim. Gambar 4. menunjukkan bahwa konsentrasi substrat sebanding dengan aktivitas ekstrak kasar enzim. Pada konsentrasi substrat rendah, aktivitas ekstrak kasar enzim juga rendah, karena sisi aktif enzim hanya sedikit mengikat substrat, sehingga produk gula pereduksi yang dihasilkan juga sedikit. Demikian juga dengan konsentrasi substrat yang makin tinggi, maka sisi aktif enzim akan makin banyak mengikat substrat, sehingga produk gula pereduksi yang dihasilkan juga makin banyak. Penambahan substrat lebih lanjut hanya sedikit meningkatkan aktivitas ekstrak kasar enzim, karena hampir semua enzim telah membentuk kompleks enzim-substrat, sehingga tidak terdapat lagi sisi aktif enzim yang bebas.

Berdasarkan kurva hubungan antara konsentrasi substrat terhadap aktivitas ekstrak kasar enzim (Gambar 4), menunjukkan adanya hubungan kuantitatif di antara konsentrasi substrat dan kecepatan reaksi enzimatik. Makin tinggi konsentrasi substrat, maka makin besar probabilitas substrat dalam berikatan dengan sisi aktif enzim. Gambar 4 sulit menyatakan berapa konsentrasi substrat yang diperlukan untuk mencapai Vm, karena penambahan substrat berlebih akan terus meningkatkan kecepatan reaksi enzimatik, tetapi hanya mengalami peningkatan yang sangat kecil, sehingga tidak dapat diketahui pada konsentrasi berapa tercapai harga Vm.

0

Gambar 4. Kurva hubungan konsentrasi substrat xilan terhadap aktivitas ekstrak kasar enzim xilanase

o dan slope sebesar 0,0156, sehingga diperoleh nilai Vm sebesar 27,25 µg/menit dan KM sebesar 0,4251 %..

y = 0,0156x + 0,0367

Dari hasil penelitian yang dilakukan dapat diambil kesimpulan bahwa:

1. Kondisi kerja optimum aktivitas ekstrak kasar enzim xilanase dalam menghidrolisis substrat xilan menjadi gula pereduksi terjadi pada pH 8,0, temperatur 55 oC dan waktu inkubasi selama 55 menit dan dihasilkan aktivitas enzim sebesar (25,7331 ± 0,4268) unit.

2. Harga Vm dan KM yang diperoleh dari persamaan Lineweaver-Burk sebesar 27,25 µg/menit dan 0,4251 %.

DAFTAR PUSTAKA

Coral, G., Arikan, B., Unaldi, M.N., Guvenmez, H.K., 2002, Some Properties of Thermostable Xylanase from an A. niger strain, Ann. Microbio., 52, 299-306, diakses tanggal 20 Januari 2009 Dashek, W.V., 1997, Methods in Plant Biochemistry and Molecular Biology,

http://www.en.wikipedia.org/wiki/xylanase, diakses tanggal 17 Juli 2006.

Haltrich, D., Nidetzky, B., Kulbe, K.D., Steiner, W. and Zupaneie, S., 1996, Production of fungal xylanases,http://www2.psu.ac.th/PresidentOffice/EduService/journal/27-2-pdf/10xylanase.pdf, diak ses tanggal 15 Juli 2006.

Isil, S. and N. Aksoz, 2005, Investigation of Factors Affecting Xylanase Activity from Trichoderma

harzianum 1073 D3, Brazilian Journal of Biology and Technology 48(2):1516-8913, diakses

tanggal 15 Juni 2006.

Lakitan, B., 2004, Dasar-dasar Fisiologi Tumbuhan, PT Raja Grafindo Persada, Jakarta.

Marsiati, H. 1995, Isolasi dan Karakterisasi Enzim Selulase dari Jamur Volvariella volvacea, Jurnal Matematika dan Sains Suplemen G. F-MIPA ITB, Bandung

Pearce, G.R., 1983, The Utilization of Fibrous Agricultural Residues, Australian Government Publishing Service, Canberra.

Reis, S.,Costa, M.A.F., Peralta, R.M., 2003, Xylanase Production by a wild strain of A. nidulans, Acta

Scientiarum: Biological Sciences, 25 (1), 221-225, diakses tanggal 12 Juni 2008.

Richana, N., 2002, Produksi dan Prospek Enzim Xilanase dalam Pengembangan Bioindustri di Indonesia,Jurnal AgroBio 5(1):29-36, diakses tanggal 14 Juni 2006

Schlegel, H.G. dan K. Schmidt, 1994, Mikrobiologi Umum, Edisi 6, Alih Bahasa: R.M. Tedjo Baskoro, UGM Press, Yogyakarta.

Yong-Eok Lee, S.E. Lowe, B. Henrissat and J. Gregory Zeikus, 1993, Charactrization of the Active Site and Thermostability Regions of Endoxylanase from Thermoanaerobacterium saccharolyticum