BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN
Pada bab ini akan disajikan hasil dan pembahasan berdasarkan langkah-langkah penelitian yang telah diuraikan dalam bab sebelumnya dalam empat bagian yang meliputi; sampel mtDNA, fragmen 1 kb daerah D-loop hasil PCR, hasil sekuensing, serta hasil analisis urutan nukleotida dan mutasi.
IV.1. Sampel mtDNA
Pada penelitian ini dianalisis 12 sampel sel yang bersumber dari lima individu dengan umur berbeda. Lima individu tersebut tidak memiliki hubungan kekerabatan antara satu individu dengan individu yang lain (Tabel IV.1)
Tabel IV.1. Data duabelas sampel mtDNA yang dianalisis pada lima individu dengan umur berbeda.
Nomor Individu Umur Individu (Thn) Jenis Kelamin Jenis sel Yang dianalisis Jumlah sampel Darah (TR10) 1 10 Perempuan Rambut (TD10) 2 Darah (TD20) 2 20 Laki-laki Rambut (TR20) 2 Darah (TD30) Epitel (TE30) 3 30 Laki-laki Rambut (TR30) 3 Darah (TD40) Epitel (TE40) 4 40 Laki-laki Rambut (TR40) 3 Darah (TD80) 5 80 Perempuan Rambut (TR80) 2 TOTAL 12
Ket : Kelima individu tersebut tidak memiliki hubungan kekerabatan antara satu individu dengan individu dengan yang lain.
Berdasarkan Tabel IV.1 di atas, sampel-sampel sel tersebut dikelompokkan ke dalam bentuk matriks yang menunjukkan pola distribusi sampel yang dianalisis pada lima individu dengan umur berbeda (Tabel IV.2) :
Tabel IV.2. Pola distribusi sampel yang dianalisis pada lima individu yang berbeda umur dalam bentuk matriks
Jenis Sel Nomor Umur
individu
(Tahun) Darah Rambut Epitel
1 10 √ √ Td 2 20 √ √ Td 3 30 √ √ √ 4 40 √ √ √ 5 80 √ √ Td *Td= Tidak dianalisis
MtDNA templat disiapkan menggunakan metode lisis sel. Lisis sel dilakukan dalam buffer lisis yang mengandung Tween-20 (Merck). Tween-20 adalah detergen non ionik yang dalam larutannya membentuk micelles. Struktur molekul Tween-20 memiliki bagian hidrofilik yang tersusun oleh senyawa ester atau alkohol dan bagian hidrofobik yang merupakan senyawa hidrokarbon. Interaksi bagian hidrofobik micelles Tween-20 dengan senyawa fosfolipid dari membran sel membuat senyawa fosfolipid membran larut membentuk campuran micelles dengan Tween-20. Inkubasi pada suhu 50oC selama 1 jam menyebabkan struktur membran sel menjadi rusak. Penambahan enzim proteinase K sebanyak 3,64 unit bertujuan untuk mendegradasi enzim-enzim DNAase dan protein lainnya. Enzim proteinase K selanjutnya dideaktivasi pada suhu 95oC selama 5 menit. Ekstrak DNA hasil lisis langsung dijadikan templat untuk PCR (Noer et al., 1994)
IV.2. Fragmen 1 kb Daerah D-loop mtDNA Hasil PCR
Amplifikasi fragmen 1 kb daerah D-loop mtDNA untuk semua sampel dilakukan dengan teknik Polymerase Chain Reaction (PCR) menggunakan primer M1 dan HV2R. Analisis fragmen hasil PCR dilakukan dengan elektroforesis gel agarosa 1% menggunakan standar pUC19 yang dipotong-potong oleh enzim restriksi HinfI (pUC19/HinfI), menghasilkan lima fragmen DNA berukuran 1419, 517, 396, 214, dan 75 pb (Gambar IV. 1).
1 2 3 4 5 6 7 1419 pb 517 pb 396 pb 214 pb 75 pb 1 kb
Gambar IV.1. Contoh fragmen 1 kb daerah D-loop mtDNA. Standar dalam penentuan ukuran fragmen hasil amplifikasi digunakan pUC19/HinfI, ditunjukkan pada lajur 1. Kontrol positif dan kontrol negatif masing-masing ditunjukkan pada lajur 2 dan 3. Lajur 4, 5, 6, 7 menunjukkan fragmen 1 kb hasil amplifikasi daerah D-loop mtDNA dengan teknik PCR.
Amplifikasi PCR berhasil diamati dengan bantuan gel agarosa sebagai pita tunggal DNA yang diperkirakan berukuran 1 kb (Gambar IV.1). Proses PCR dikontrol oleh dua macam kontrol, kontrol positif dan kontrol negatif. Kontrol positif mengandung templat DNA yang telah pernah berhasil diamplifikasi. Seperti terlihat pada lajur 2, kontrol positif menghasilkan satu pita fragmen berukuran 1 kb. Hasil ini menunjukkan bahwa proses PCR yang dilakukan berhasil. Kontrol negatif tidak mengandung templat mtDNA dan seperti ditunjukkan pada lajur 3, kontrol negatif tidak menghasilkan pita. Hal ini
menunjukkan bahwa hasil amplifikasi yang diperoleh bukan berasal dari kontaminan.
Ukuran fragmen hasil PCR dapat dihitung berdasarkan selisih total pasang basa dalam mtDNA (16569) dengan posisi awal primer M1 (L15978) dan posisi akhir HV2R (H429) + 1. Berdasarkan perhitungan tersebut diperoleh ukuran fragmen hasil PCR adalah 1021 pasang basa. Posisi ukuran fragmen tersebut pada daerah D-loop dapat digambarkan dalam bentuk diagram (Gambar IV.2) :
1021 pb nt 15978 nt 16569 nt 429 nt 16383 nt 16024 nt 57 nt 372 592 pb 429 pb HV1 HV2 M1 HV2R 0 200 400 600 800 1000(pb) 1021 pb
Gambar IV.2. Posisi ukuran fragmen hasil PCR pada daerah D-loop. Fragmen 592 menunjukkan selisih total pasang basa dalam mtDNA (16569 pb) dengan posisi awal primer M1 (L15978), fragmen 429 pb merupakan posisi akhir HV2R (H429). Fragmen 1021 pb menunjukkan ukuran fragmen hasil PCR. Primer M1 ditunjukkan dengan warna biru, primer HV2R ditunjukkan dengan warna merah. Daerah HV1 ditunjukkan dengan warna hijau, daerah HV2 ditunjukkan dengan warna kuning. Warna coklat menunjukkan daerah antara HV1 dan HV2
Selanjutnya, fragmen 1 kb hasil PCR sebanyak 1021 pb pada 12 sampel dianalisis urutan nukleotidanya.
IV.3. Hasil Sekuensing Fragmen 1 kb D-loop mtDNA
Hasil sekuensing diperoleh fragmen 1 kb D-loop mtDNA sekitar 200 - 600 pb pada 12 sampel sel. Mengingat bahwa pada daerah HV1 jumlah variasi mutasi (polimorfik) lebih tinggi dari pada daerah HV2, maka pengamatan yang menitikberatkan pada keseluruhan HV1 dan sebagian HV2 telah cukup
representatif dalam penentuan urutan nukleotida daerah D-loop mtDNA. Hasil sekuensing terhadap 12 sampel sel mtDNA berasal dari lima individu yang umurnya berbeda diperoleh dalam bentuk elektroforegram. Pada individu umur 30 tahun menunjukkan puncak-puncak elektroforegram yang sama pada sel darah, sel epitel, dan sel rambut (Gambar IV.3, Gambar IV.4, Gambar IV.5 ) :
Gambar IV.3. Contoh hasil sekuensing berupa elektroforegram daerah D-loop mtDNA pada sel darah individu umur 30 tahun (TD30)
Gambar IV.4. Contoh hasil sekuensing berupa elektroforegram daerah D-loop mtDNA pada sel epitel individu umur 30 tahun (TE30)
Gambar IV.5. Contoh hasil sekuensing berupa elektroforegram daerah D-loop mtDNA pada sel rambut individu umur 30 tahun (TR30)
Pada elektroforegram terdapat deretan puncak-puncak dengan warna berbeda-beda yang menunjukkan deretan basa dengan notasi A, C, T, G. Puncak warna hijau melambangkan basa adenin (A), Puncak warna biru melambangkan basa sitosin (C), puncak warna merah melambangkan basa timin (T), dan puncak warna hitam melambangkan basa guanin (G). Hasil sekuen daerah D-loop menggunakan primer M1 menunjukkan bahwa panjang nukleotida beberapa sampel ada yang sama, akan tetapi ada juga yang berbeda. Untuk sampel yang panjang nukleotidanya sama, langsung dilakukan penjajaran, akan tetapi untuk sampel yang panjang nukleotidanya berbeda dalam satu individu, dilakukan pemotongan nukleotida hingga panjangnya sama (lampiran 1). Hasil sekuen dalam bentuk elektroforegram kemudian diterjemahkan menjadi urutan nukleotida. Urutan nukleotida daerah D-loop mtDNA (Tabel IV.3) menunjukkan bahwa urutan nukleotida pada sel darah, epitel, dan rambut individu umur 30 tahun adalah sama.
Tabel IV.3. Urutan nukleotida daerah D-loop mtDNA pada sel darah, sel epitel, dan sel rambut pada individu umur 30 tahun.
Sampel Posisi
nukleotida Urutan nukleotida Darah (TD30) Epitel (TE30) Rambut (TR30)
Berdasarkan Tabel IV.3 di atas, urutan nukleotida menunjukkan sama pada sel darah, epitel, dan rambut individu umur 30 tahun. Demikian juga, pada individu
dengan umur yang lain yaitu urutan nukleotida menunjukkan sama pada sel darah, sel epitel, dan sel rambut individu umur 40 tahun. Selain itu, urutan nukleotida sel darah dan sel rambut menunjukkan sama pada masing-masing individu umur 10, 20, dan 80 tahun (Lampiran 2). Dengan demikian, urutan nukleotida daerah D-loop mtDNA pada sel yang berbeda, yaitu sel darah, sel epitel, dan sel rambut menunjukkan urutan nukleotida yang sama tiap individu dengan umur tertentu.
IV.4. Mutasi D-loop mtDNA Sampel Sel yang Berbeda
Analisis mutasi pada setiap sampel dilakukan dengan cara membandingkan urutan nukleotida dan elektroforegram sampel terhadap standar CRS yang berfungsi sebagai satandar primer dan sampel lain sebagai standar sekuender. Analisis mutasi menggunakan program komputer Seqman DNASTAR. Hasil analisis terhadap 12 sampel dari lima individu memberikan informasi jumlah, jenis dan posisi mutasi pada urutan nukleotida daerah D-loop mtDNA.
IV.4.1. Mutasi D-loop mtDNA Sampel Sel yang Berbeda untuk Satu Individu Hasil analisis mutasi pada sel darah, sel epitel, dan sel rambut menunjukkan mutasi yang sama pada individu berumur 30 tahun (Gambar IV.6). Elektroforegram daerah D-loop mtDNA menunjukkan mutasi transisi T16140C dan mutasi transisi C16174T yang sama pada sel darah, epitel, dan rambut individu umur 30 tahun. Demikian pula, elektroforegram daerah D-loop mtDNA yang menunjukkan mutasi transversi A16182C dan A16183C, dan mutasi transisi T16189C sama pada sel darah, sel epitel, dan sel rambut pada individu umur 30 tahun dibandingkan standar primer (CRS) dan standar sekunder yang berasal dari sampel pada individu lain (Gambar IV.6). Sampel lain yang difungsikan sebagai standar sekunder memiliki posisi nukleotida yang sama dengan sampel yang dianalisis mutasinya. Standar sekunder tersebut digunakan untuk membandingkan mutasi yang terjadi pada sampel yang dianalisis tersebut dengan mutasi yang terjadi pada sampel lain terhadap CRS pada posisi nukleotida yang sama.
TD40 TD30 TE30 TR30 a). b). c). CRS
Gambar IV.6. Elektroforegram daerah D-loop yang menunjukkan a).mutasi transisi T16140C, b). mutasi transisi C16174T, c). mutasi transversi A16182C dan A16183C, dan d). mutasi transisi T16189C sama pada sel darah (TD30), sel epitel (TE30), dan sel rambut (TR30) pada individu umur 30 tahun dibandingkan standar primer (CRS) dan standar sekunder (sampel lain, TD40)
Dengan demikian, individu umur 30 tahun memiliki lima mutasi yang sama pada sel darah, sel epitel, dan sel rambut. Satu mutasi transisi diantaranya C16189T yang menyebabkan timbulnya poli C yang juga sama pada sel darah, sel epitel, dan sel rambut (Tabel IV.4). Urutan nukleotida poli C menunjukkan bahwa urutan nukleotida selanjutnya tidak dapat dibaca lagi dengan jenis primer sekuensing yang sama yaitu primer M1. Oleh karena itu, dilakukan sekuensing menggunakan primer M2 menghasilkan enam mutasi yang sama pada sampel darah dan rambut individu umur 30 tahun (Tabel IV.4).
Tabel IV.4. Ringkasan mutasi pada sampel sel darah, sel epitel, dan sel rambut individu umur 30 tahun
Primer sekuensing M1 M2 Posisi nukleotida 1 6 1 4 0 1 6 1 7 4 1 6 1 8 2 1 6 1 8 3 1 6 1 8 9 1 6 1 8 9 1 6 2 1 7 1 6 2 7 4 1 6 3 0 1 1 6 3 3 6 1 6 3 4 5 CRS T C A T A A C - C - Darah C T C C C G G T C C C Epitel C T C C C 30 Rambut C T C C C G G T C C C
Sementara itu, individu umur 40 tahun memiliki delapan mutasi pada daerah D-loop yang sama pada sel darah, sel rambut, dan sel epitel. Elektroforegram daerah D-loop menunjukkan mutasi transisi T16086C sama pada sel darah, sel epitel, dan sel rambut pada individu umur 40 tahun dibandingkan dengan standar primer (CRS) dan standar sekunder yang berasal dari sampel pada individu lain (Gambar IV.7). CRS TD40 TE40 TR40 TD80 a). b). c). d).
Gambar IV.7. Contoh elektroforegram daerah D-loop yang menunjukkan a). mutasi transisi T16086C, dan b). mutasi transisi C16148T, c). mutasi transisi C16223T dan d). mutasi transisi C16259T yang sama pada sel darah (TD40), sel epitel (TE40), dan sel rambut (TR40) pada individu umur 40 tahun dibandingkan dengan CRS sebagai standar primer dan sampel lain (TD80) yang difungsikan sebagai standar sekunder
Demikian juga, elektroforegram daerah D-loop yang menunjukkan mutasi transisi C16259T dan C16278T sama pada sel darah, sel epitel, dan sel rambut pada individu umur 40 tahun dibandingkan dengan CRS sebagai standar primer dan sampel lain (TD80) yang difungsikan sebagai standar sekunder. Elektroforegram daerah D-loop yang menunjukkan mutasi lain pada sampel individu umur 40 tahun secara lengkap pada lampiran 3. Dengan demikian, individu umur 40 tahun memiliki delapan mutasi pada daerah D-loop yang sama pada sel darah, sel epitel, dan sel rambut (Tabel IV.5).
Tabel IV.5. Ringkasan mutasi pada sampel sel darah, sel epitel, dan sel rambut individu umur 40 tahun
Primer sekuensing M1 Posisi nukleotida 1 6 0 8 6 1 6 1 4 8 1 6 2 2 3 1 6 2 5 9 1 6 2 7 8 1 6 3 1 9 1 6 3 9 9 1 6 5 2 6 CRS T C C C C G A G Darah C T T T T A G A Epitel C T T T T A G A 40 Rambut C T T T T A G A
IV. 4.2. Mutasi D-loop mtDNA sampel sel yang berbeda untuk beberapa individu dengan umur yang berbeda
Elektroforegram daerah D-loop mtDNA pada sel berbeda untuk individu umur 30 tahun dan 40 tahun, menunjukkan bahwa tiap individu tersebut memiliki mutasi yang sama pada sel darah, sel epitel, dan sel rambut. Individu umur 30 tahun memiliki lima mutasi yang sama pada sel darah, sel rambut dan sel epitel, satu mutasi transisi diantaranya T16189C yang menyebabkan timbulnya poli C yang juga sama pada sel darah, sel epitel, dan sel rambut. Urutan nukleotida poli C menunjukkan bahwa urutan nukleotida selanjutnya tidak dapat dibaca lagi dengan jenis primer sekuensing yang sama yaitu primer M1. Oleh karena itu, dilakukan sekuensing menggunakan primer M2 menghasilkan enam mutasi yang sama pada sel darah dan sel rambut individu umur 30 tahun (Tabel IV.4).
Berdasarkan hasil analisis mutasi pada sel darah dan sel rambut individu umur 30 tahun yang disekuensing dengan primer M2, ditemukan satu mutasi transisi A16189G yang merupakan komplemen dari mutasi transisi T16189C. Jenis mutasi yang dominan pada kedua sampel tersebut adalah mutasi transisi, satu mutasi insersi 16301C yang sama pada sel darah dan rambut. Dengan demikian, daerah D-loop mtDNA telah berhasil ditentukan 11 varian mutasi yang menunjukkan mutasi yang sama pada sampel sel darah dan sel rambut individu umur 30 tahun (Tabel IV.4). Demikian pula, individu umur 40 tahun memiliki
delapan mutasi pada daerah D-loop yang sama pada sel darah, sel epitel, dan sel rambut. Elektroforegram daerah D-loop menunjukkan mutasi transisi T16086C sama pada sel darah, sel epitel, dan sel rambut pada individu umur 40 tahun dibandingkan dengan standar primer (CRS) dan standar sekunder yang berasal dari sampel pada individu lain (Gambar IV.7).
Sementara itu, elektroforegram daerah D-loop yang menunjukkan mutasi yang sama pada sel darah dan sel rambut ditemukan pada tiap individu umur 10, 20, dan 80 tahun (lampiran 3). Individu umur 10 tahun memiliki tiga mutasi yang sama pada sel darah dan sel rambut. Elektroforegram daerah D-loop yang menunjukkan satu mutasi transisi C16147T, satu mutasi insersi pada posisi 16183C, dan satu mutasi transisi T16189C masing-masing menunjukan mutasi yang sama pada sel darah dan sel rambut pada individu umur 10 tahun dibandingkan standar primer (CRS) dan sampel lain (TD20) yang difungsikan sebagai standar sekunder (Gambar IV.8).
TD10
TR10
TD20 CRS
a). b). c).
Gambar IV.8. Elektroforegram daerah D-loop yang menunjukkan a). mutasi transisi C16147T, b). mutasi insersi 16183C, dan c). mutasi delesi T16190 sama pada sel darah (TD10) dan sel rambut (TR10) pada individu umur 10 tahun dibandingkan standar primer (CRS) dan standar sekunder (sampel lain, TD20)
Satu mutasi insersi 16183C menyebabkan pembacaan urutan nukleotida pada urutan CRS bergeser satu basa ke kiri, sehingga mutasi yang ditunjukkan sebagai mutasi delesi T16190 (Gambar IV.8c) bergeser pembacaannya menjadi mutasi transisi T16189C yang menyebabkan timbulnya urutan nukleotida poli C. Namun demikian, ketiga mutasi pada sampel tersebut menunjukkan sama pada sel darah dan sel rambut individu umur 10 tahun.
Tabel IV.6. Ringkasan mutasi pada sampel sel darah dan sel rambut individu umur 10 tahun
Primer sekuensing M1 Posisi nukleotida 1 6 1 4 7 1 6 1 8 3 1 6 1 8 9 CRS C A T Darah T C C 10 Rambut T C C
Demikian pula, individu umur 20 tahun menunjukkan mutasi yang sama pada sel darah dan rambut. Elektroforegram daerah D-loop yang menunjukkan mutasi insersi 16136G, mutasi transisi T16140C, mutasi transversi C16169A, mutasi delesi A16183, dan mutasi transisi T16189C yang sama pada sel darah dan rambut pada individu umur 20 tahun dibandingkan standar primer (CRS) dan sampel pada individu lain (TD30) yang difungsikan sebagai standar sekunder (Gambar IV.9).
Gambar IV.9. Elektroforegram daerah D-loop yang menunjukkan a). mutasi insersi 16136G, b). mutasi transisi T16140C, c). mutasi transversi C16169A, d). mutasi delesi A16183, e). mutasi transisi T16189C yang sama pada sel darah (TD20) dan sel rambut (TR20) pada individu umur 20 tahun dibandingkan standar primer (CRS) dan standar sekunder (sampel lain, TD40)
Satu mutasi insersi 16136G menyebabkan pembacaan urutan nukleotida berikutnya pada urutan CRS bergeser satu basa ke kiri, sehingga mutasi yang ditunjukkan sebagai mutasi transisi T16190C (Gambar IV.9e) bergeser pembacaannya menjadi mutasi transisi T16189C yang menyebabkan timbulnya urutan nukleotida poli C. Namun demikian, lima mutasi pada sampel tersebut menunjukkan mutasi yang sama pada sel darah dan sel rambut individu umur 20 tahun (Tabel IV.7).
Tabel IV.7. Ringkasan mutasi pada sampel sel darah dan sel rambut individu umur 20 tahun
Primer sekuensing M1 Posisi nukleotida 1 6 1 3 6 1 6 1 4 0 1 6 1 6 9 1 6 1 8 3 1 6 1 8 9 CRS - T C A T Darah G C A - C 20 Rambut G C A - C d). e). b). c). a). TR20 TD20 TD40 CRS
Sementara itu, individu umur 80 tahun menunjukkan tujuh mutasi yang sama pada sel darah dan sel rambut. Elektroforegram daerah D-loop yang menunjukkan mutasi transisi C16067T, mutasi transisi G16129A, mutasi transisi T16136C, mutasi transisi T16140C, dan mutasi transisi C16223T yang sama pada sel darah dan sel rambut pada individu umur 80 tahun dibandingkan standar primer (CRS) dan standar sekunder yang berasal dari sampel individu lain (TR40) yang difungsikan sebagai standar sekunder (Gambar IV.10).
TD80
a). b) c). d). e)
CRS
TR40
TR80
Gambar IV.10. Elektroforegram daerah D-loop yang menunjukkan a). mutasi transisi C16067T, b). mutasi transisi G16129A, c). mutasi transisi T16136C, d). mutasi transisi T16140C, e). mutasi transisi C16223T yang sama pada sel darah (TD80) dan sel rambut (TR80) pada individu umur 80 tahun dibandingkan standar primer (CRS) dan standar sekunder (sampel lain, TR40)
Mutasi transisi G16129A (Gambar IV.10b) menunjukkan sama pada sel darah dan sel rambut individu umur 80 tahun, jenis mutasi ini juga ditemukan pada pasien osteosarcoma (Guo Guang, 2006). Mutasi transisi G16129A tersebut di atas hanya ditemukan pada individu umur 80 tahun yang menunjukkan mutasi yang sama pada sel darah dan sel rambut. Demikian juga, elektroforegram yang menunjukkan mutasi transisi T16271C dan T16519C menunjukkan mutasi yang sama pada sel darah dan sel rambut individu umur 80 tahun (lampiran 3). Dengan demikian, pada individu umur 80 tahun ditemukan tujuh mutasi yang sama pada sel darah dan sel rambut (tabel IV.8).
Tabel IV.8. Ringkasan mutasi pada sampel sel darah dan sel rambut individu umur 80 tahun.
Primer sekuensing M1 Posisi nukleotida 1 6 0 6 7 1 6 1 2 9 1 6 1 3 6 1 6 1 4 0 1 6 2 2 3 1 6 2 7 1 1 6 5 1 9 CRS C G T T C T T Darah T A C C T C C 80 Rambut T A C C T C C
Posisi dan jenis mutasi pada sel darah dan sel rambut individu umur 80 tahun di atas adalah sama. Dengan demikian, urutan nukleotida daerah D-loop mtDNA pada 12 sel yang dianalisis, dengan CRS sebagai standar menunjukkan mutasi yang sama pada sel berbeda tiap individu (Tabel IV.9).
Tabel IV.9. Total mutasi mtDNA D-loop pada sampel yang dianalisis. Mutasi dengan CRS sebagai standar pada dua belas sampel sel terdiri dari sel darah, sel epitel dan sel rambut berasal dari lima individu dengan umur 10, 20,30,40, dan 80 tahun.
Primer sekuensing Posisi nukleotida M1 16050-16569 Posisi nukleotida 16 0 6 7 1 6 0 8 6 1 6 1 2 9 1 6 1 3 6 1 6 1 3 6 1 6 1 4 0 1 6 1 4 7 1 6 1 4 8 1 6 1 6 9 1 6 1 7 4 1 6 1 8 2 1 6 1 8 3 1 6 1 8 3 1 6 1 8 9 1 6 2 2 3 1 6 2 5 9 1 6 2 7 1 1 6 2 7 8 1 6 3 1 9 1 6 3 9 9 1 6 5 1 9 1 6 5 2 6 CRS C T G - T T C C C C A - A T C C T C G A T G Darah T C C 10 Rambut T C C Darah G C A - C 20 Rambut G C A - C Darah C T C C C Epitel C T C C C 30 Rambut C T C C C Darah C T T T T A G A Epitel C T T T T A G A 40 Rambut C T T T T A G A Darah T A C C T C C 80 Rambut T A C C T C C
Dalam mtDNA, mutasi adalah perbedaan nukleotida yang terdapat pada sampel dibandingkan dengan standar CRS karena CRS belum tentu wild type. Jenis mutasi yang dominan pada kedua belas sampel dari lima individu tersebut adalah mutasi transisi yaitu mutasi yang disebabkan oleh perubahan dari basa Purin menjadi basa Purin yang lain yaitu dari basa Adenin menjadi basa Guanin, dan atau perubahan dari basa Pirimidin menjadi basa Pirimidin yang lain yaitu basa Timin menjadi basa Sitosin, atau sebaliknya. Mutasi transversi selalu lebih sedikit dibandingkan dengan mutasi transisi. Hal ini karena tahapan reaksi mutasi transversi lebih panjang dibandingkan dengan mutasi transisi.
Hasil analisis penentuan urutan nukleotida yang ditentukan dengan metoda dideoksi Sanger untuk semua sampel berjumlah kurang lebih 5.500 pb, telah berhasil diperoleh. Hasil analisis urutan nukleotida menggunakan program seqman DNASTAR dengan CRS sebagai rujukan menunjukkan bahwa untuk tiga sel yang berbeda, yaitu sel darah, sel epitel, dan sel rambut, pada individu berumur 30 tahun dan 40 tahun, posisi dan jenis mutasi masing-masing individu tersebut adalah sama. Sementara itu, analisis urutan nukleotida sel darah dan sel rambut individu berumur 10, 20, dan 80 tahun juga menunjukkan posisi dan jenis mutasi yang sama.Urutan nukleotida D-loop mtDNA sama pada sel berbeda tiap individu. Hal ini disebabkan oleh karena sel-sel tersebut bersumber dari satu sel telur yang memiliki satu jenis mtDNA kemudian terdiferensiasi seiring dengan perkembangan embrio. Pada fase perkembangan selanjutnya menjadi manusia dewasa, diferensisasi ini tidak menyebabkan adanya perubahan pada urutan nukleotida mtDNA pada sel rambut, epitel, dan darah dalam satu individu. Dengan demikian, ketiga jenis sel tersebut dapat dikatakan mewakili keseluruhan jenis sel yang ada pada tubuh manusia. Berdasarkan hal tersebut di atas, dapat diusulkan untuk menggunakan salah satu dari sel darah atau sel epitel atau sel rambut dalam keperluan identifikasi forensik. Hal ini didasarkan pada temuan penelitian ini bahwa urutan nukleotida D-loop mtDNA sama pada ketiga sel tersebut untuk berbagai individu dengan umur berbeda.
