1 PENGARUH PENAMBAHAN ION LOGAM DAN PELARUT ORGANIK TERHADAP AKTIVITAS ENZIM LAKASE HASIL FRAKSINASI 20-80%
AMMONIUM SULFAT
Retna Gian Widati1*, Andi Dahliaty2
1Mahasiswa Program S1 Kimia
2Dosen Bidang Biokimia Jurusan Kimia
1,2Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Riau Kampus Binawidya, Pekanbaru, 28293, Indonesia
*retna.gian4071@student.unri.ac.id
ABSTRACT
Laccase is an enzyme that requires additional chemical components (non-protein) such as metal ions to increase its activity. This study aims to determine the effect of adding Cu2+, Mg2+ and Zn2+ metal ions and organic solvents acetonitrile, acetone, ethanol and methanol on the activity of the laccase enzyme produced from the fungus Trichoderma asperellum LBKURCC1 using ABTS as a substrate. The concentration of metal ions and organic solvents added were respectively (1, 5 and 10 mM) and (5, 20 and 40 %). Laccase enzyme activity test was measured using a UV-Vis spectrophotometer with a wavelength of 420 nm and incubated for 5 minutes. The highest laccase activity was obtained by adding Cu2+ metal ions at a concentration of 10 mM with a value of 544.00 ± 12.56 U/L, which increased laccase activity by 63,43% which acts as a cofactor. Meanwhile, the addition of organic solvents decreased its activity by 80,17% with a value of 66.00 ± 4.09 U/L in acetonitrile solvent with a concentration of 40% which caused the enzymes to denature.
Keyword: activity, denaturation, cofactor laccase.
ABSTRAK
Lakase merupakan salah satu enzim yang membutuhkan tambahan komponen kimia (non-protein) seperti ion logam untuk meningkatkan aktivitasnya. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh penambahan ion logam Cu2+, Mg2+ dan Zn2+ dan pelarut organik asetonitril, aseton, etanol dan metanol terhadap aktivitas enzim lakase yang diproduksi dari jamur Trichoderma asperellum LBKURCC1 dengan menggunakan substrat ABTS. Konsentrasi ion logam dan pelarut organik yang ditambahkan masing-masing dengan konsentrasi (1, 5 dan 10 mM) dan (5, 20 dan 40 %). Uji aktivitas enzim lakase diukur menggunakan spektrofotometer UV-Vis dengan panjang gelombang 420 nm dan diinkubasi selama 5 menit. Aktivitas lakase tertinggi diperoleh pada pada penambahan ion logam Cu2+ pada konsentrasi 10 mM dengan nilai 544,00±12,56
2 U/L, yang mampu meningkatkan aktivitas lakase sebesar 63,43% yang bertindak sebagai kofaktor. Sedangkan pada penambahan pelarut organik menurunkan aktivitasnya sebesar 80,17% dengan nilai 66,00±4,09 U/L pada pelarut asetonitril dengan konsentrasi 40 % yang menyebabkan enzim terdenaturasi.
Kata kunci: aktivitas, denaturasi, kofaktor, lakase.
PENDAHULUAN
Lakase adalah salah satu enzim ligninolitik yang merupakan enzim ekstraseluler multicopper yang mampu mengoksidasi komponen struktur aromatik dan non aromatik pada struktur lignin. Salah satu jamur yang dapat menghasilkan enzim lakase adalah jamur T. asperellum. T.
asperellum merupakan salah satu agen pengendali hayati yang efektif dan dapat menghasilkan enzim lakase dengan menggunakan residu tanaman sebagai substrat (Waluyo, 2004).
Ion logam adalah kofaktor yang dapat digunakan untuk mendukung aktivitas katalitik enzim. Ion logam dapat mengaktifkan enzim melalui berbagai kemungkinan, misalnya menjaga bagian internal enzim, menghubungkan enzim dengan substrat, mengubah konstanta kesetimbangan reaksi enzim, mengubah tegangan permukaan protein enzim, menghilangkan
inhibitor, menggantikan ion logam yang tidak efektif pada sisi aktif enzim maupun substrat, dan mengubah konformasi enzim menjadi konformasi yang lebih aktif (Belitz et al., 2009).
Penelitian ini menggunakan ekstrak kasar T. asperellum LBKURCC1 hasil produksi dari Laboratorium Riset Enzim, Fermentasi dan Biomolekuler FMIPA Universitas Riau. Pada penelitian ini dilakukan pengendapan ekstrak kasar lakase secara bertingkat dengan kejenuhan ammonium sulfat 20-80%. Hasil pengendapan dilakukan dialisis menggunakan membran ultrafiltrasi 30.000 Da Molecular Weight Cut Off (MWCO) untuk memisahkan garam, tanin dan molekul-molekul kecil dibawah 30.000 Da.
Penggunaan garam ammonium sulfat bertujuan untuk mendapatkan protein target yang diinginkan.
Garam ammonium sulfat memiliki
3 kelarutan yang tinggi dalam air,
mampu mengendapkan protein, tidak mendenaturasi enzim, serta memiliki harga yang relatif murah dibanding garam lainnya (Scopes, 1993).
Berdasarkan hasil penelitian yang telah dilakukan Nadyani (2022), diperoleh pH dan suhu optimum yaitu 5,5 dan 45oC dengan aktivitas lakase sebesar 332,87 ± 8,89 U/L. Aktivitas enzim lakase masih bisa ditingkatkan dengan menambahkan komponen kimia (non-protein) seperti ion logam.
Berdasarkan informasi dari penelitian Murugesan et al., (2009), dengan menggunakan enzim lakase yang berasal dari jamur pelapuk putih Ganoderma lucidum, penambahan ion logam seperti Cu+2, Zn+2 dan Mg+2 dapat meningkatkan aktivitas enzim lakase dengan variasi konsentrasi 1 mM, 5 mM dan 10 mM.
Penelitian ini juga dilakukan pengaruh penambahan pelarut organik terhadap aktivitas lakase dari jamur Trichoderma asperellum LBKURCC1, sehingga diperoleh informasi mengenai senyawa yang dapat menurunkan aktivitas lakase lebih besar. Shanmugam et al.,
(2018), telah melakukan penelitian dengan menggunakan pelarut organik asetonitril, aseton, etanol dan metanol dengan konsentrasi 5, 20 dan 40% untuk mengetahui pengaruh penambahan pelarut organik terhadap aktivitas enzim lakase dari T. asperellum BPLMBT1. Aktivitas enzim yang dihasilkan membuktikan bahwa pelarut organik tersebut dapat menurunkan aktivitas lakase dengan merusak struktur enzim yang menyebabkan enzim terdenaturasi.
METODOLOGI PENELITIAN a. Alat dan bahan
Alat-alat yang digunakan untuk melakukan penelitian ini adalah spektrofotometer UV-Vis (Genesys 10S UV-Vis), timbangan analitik (KERN ABJ-NM/ABS-N), pipet mikro (Socorex Acura 825), water bath (Sibata warerbath WK-24), pH meter (HORIBA Scientific), sentrifugasi (Centrifuge PLC Series), membran ultrafiltrasi 30.000 Dalton (Corning Spin-X UF) dan alat-alat gelas laboratorium yang digunakan sesuai prosedur kerja.
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah ekstrak kasar enzim dari isolat T. asperellum LBKURCC1, ABTS (2,2’-Azinobis-
4 3-etilbenzotiazolin-6-sulfonat),
ammonium sulfat ((NH4)2SO4), natrium hidroksida (NaOH), asam klorida (HCl), asam asetat glasial (CH3COOH), natrium asetat (CH3COONa), akua DM, ion logam Cu2+ (CuSO4.5H2O), Mg2+ (MgCl2) dan Zn2+ (ZnSO4.7H2O), pelarut organik asetonitril (C2H3N), aseton (C3H6O), etanol (C2H6O) dan metanol (CH3OH).
b. Fraksinasi menggunakan ammonium sulfat
Ekstrak kasar enzim lakase dari jamur T. asperellum LBKURCC1 sebanyak 100 mL ditambahkan ammonium sulfat dengan kejenuhan 0-20% sedikit demi sedikit dan diaduk menggunakan magnetic stirrer pada suhu 40C hingga larut.
Larutan didiamkan selama 30 menit dalam lemari pendingin pada suhu
±4oC. Kemudian larutan disentrifugasi dengan kecepatan 9.000 rpm selama 10 menit.
Supernatan yang diperoleh diendapkan kembali menggunakan garam ammonium sulfat pada kejenuhan 20-80%, kemudian didiamkan selama 30 menit dalam lemari pendingin pada suhu ±4oC dan disentrifugasi pada kecepatan
9.000 rpm selama 10 menit pada suhu 4oC. Endapan yang dihasilkan kemudian digunakan untuk pemurnian tahap selanjutnya.
c. Pemurnian menggunakan membran ultrafiltrasi
Endapan yang telah didapatkan dipisahkan dari sisa-sisa garam dan molekul lainnya dengan menggunakan membran ultrafiltrasi yang memiliki Molecular Weight Cut Of (MWCO) 30.000 Da (30 kDa).
Endapan yang diperoleh dilarutkan ke dalam 50 mL buffer asetat pH 5,5.
Kemudian di masukkan ke dalam tabung sentrifuse tube 15 mL dan di sentrifugasi dengan kecepatan 9.000 rpm selama 10 menit pada suhu
±4oC. Suspensi dan endapan yang dihasilkan dipisahkan jika ada.
Suspensi dipindahkan ke dalam tabung ultrafiltrasi dengan ukuran 30 kDa dan di sentrifugasi selama 15 menit, filtrat yang dihasilkan dipisahkan. Kemudian larutan yang berada diatas membran ditambah buffer asetat pH 5,5. Enzim dicuci sebanyak 3 kali dan di sentrifugasi kembali hingga didapatkan enzim berwarna bening kekuningan. Enzim yang dihasilkan dimasukkan kedalam
5 microtube ukuran 115 μL kemudian
dibekukan didalam freezer.
d. Uji aktivitas enzim terhadap penambahan ion logam
Enzim lakase di inkubasi dengan ion logam yang berbeda-beda (Cu2+, Zn2+, Mg2+) pada variasi konsentrasi akhir 1, 5 dan 10 Mm selama 10 menit. Campuran uji dan kontrol mengandung 425 μL buffer asetat pH 5,5 dan 25 μL ABTS kemudian di inkubasi selama 10 menit dalam water bath pada suhu 45oC.
Campuran ion logam dan enzim lakase untuk uji dan kontrol sebanyak 50 μL dimasukkan ke dalam masing masing sampel. Uji dan kontrol diukur absorbansinya menggunakan spektrofotometer UV- Vis (Genesys 10S UV-Vis) pada panjang gelombang 420 nm yang dilakukan dengan tiga kali pengulangan. Setelah itu, campuran di inkubasi kembali selama 5 menit di dalam water bath dan absorbansinya diukur kembali.
e. Uji aktivitas enzim terhadap penambahan pelarut organik Pengaruh penambahan beberapa pelarut organik pada enzim lakase dilakukan pada konsentrasi akhir 5, 20 dan 40 %. Enzim lakase sebanyak
50 μL diinkubasi dengan pelarut organik yang berbeda (asetonitril, aseton, etanol dan metanol) sebanyak 31,25 μL selama 10 menit.
Campuran uji mengandung 393,75 μL buffer asetat pH 5,5 dan 25 μL ABTS untuk konsentrasi akhir 5%
kemudian di inkubasi selama 10 menit dalam water bath pada suhu 45oC. Campuran pelarut organik dan enzim lakase untuk uji dan kontrol sebanyak 81,25 μL dimasukkan kedalam masing masing sampel.
Uji dan kontrol diukur absorbansinya menggunakan spektrofotometer UV-Vis (Genesys 10S UV-Vis) pada panjang gelombang 420 nm yang dilakukan dengan tiga kali pengulangan.
Setelah itu, campuran di inkubasi kembali selama 5 menit didalam water bath dan absorbansinya diukur kembali. Hal yang sama dilakukan pada konsentrasi akhir 20% dan 40%
dengan campuran sampel yang sesuai dengan perhitungan dan dilakukan tiga kali pengulangan.
HASIL DAN PEMBAHASAN Ekstrak kasar dari T. asperellum LBKURCC1 diendapkan secara bertingkat menggunakan garam ammonium sulfat 20-80%.
6 Penggunaan garam ammonium sulfat
bertujuan untuk mendapatkan protein target yang diinginkan. Pada proses pengendapan ini menggunakan prinsip salting-out, yaitu dengan menambahkan konsentrasi garam yang tinggi, menyebabkan garam menghidrasi air dari permukaan molekul protein, sehingga kelarutan protein menurun dan protein akan mengendap (Male et al., 2015).
Hasil pengendapan dilakukan dialisis menggunakan membran ultrafiltrasi yang memiliki prinsip memisahkan berdasarkan ukuran molekul. Molekul yang memiliki ukuran tertentu tidak dapat melewati membran ultrafiltrasi yang disebut dengan Cut-Off Molecular Weight (Harcum, 2008). Setelah didapatkan enzim berwarna bening kekuningan, maka enzim dapat digunakan untuk melakukan optimasi pH dan suhu optimum aktivitas lakase.
a. Pengaruh penambahan ion logam terhadap aktivitas enzim Penambahan beberapa ion logam (Cu2+, Zn2+, Mg2+) dilakukan terhadap aktivitas lakase menggunakan variasi konsentrasi 1 mM, 5 mM dan 10 mM. Berdasarkan
Gambar 1 dan Tabel 1 aktivitas lakase kontrol atau tanpa penambahan ion logam sebesar 332,87±8,89 U/L. Sedangkan dengan penambahan ion logam aktivitas tertinggi terdapat pada ion logam Cu2+ konsentrasi 10 mM, aktivitas meningkat sebesar 66,43% dengan nilai rata-rata 544,00 U/L. Kemudian diikuti dengan logam Zn2+ dengan aktivitas rata-rata 525,00 U/L.
Aktivitas mengalami peningkatan seiring bertambahnya konsentrasi.
Gambar 1. Grafik pengaruh variasi konsentrasi ion logam terhadap aktivitas lakase.
Tabel 1 Hasil pengaruh penambahan ion logam terhadap aktivitas lakase.
Ion
logam Konsentrasi Aktivitas Enzim (U/L)
Kontrol 0 mM 332,87±8,89
1 mM 443,33±10,17e
Cu2+ 5 mM 513,77±5,01b
0 100 200 300 400 500 600
kontrol Cu2+ Zn2+ Mg2+
Aktivitas Enzim (U/L)
Ion Logam
0mM 1mM 5mM 10mM
7
10 mM 544,00±12,56a
1 mM 424,08±3,07f
Zn2+ 5 mM 500,65±3,05c
10 mM 525,00±7,81b
1 mM 346,47±1,06g
Mg2+ 5 mM 418,68±7,93f
10 mM 475,67±3,88d
Catatan: Nilai rata-rata dari tiga kali pengulangan. Notasi huruf yang sama menunjukkan tidak ada perbedaan nyata pada 5% ( p≥0,05). Sedangkan pada notasi huruf yang berbeda memiliki perbedaan secara nyata pada 5%
(p < 0,05) berdasarkan uji Duncan Jarak Berganda.
Ion-ion logam ini bertindak sebagai kofaktor pada reaksi katalitik enzim dengan cara membantu pengikatan enzim dengan substrat untuk menghasilkan produk. Cu2+
menghasilkan aktivitas lebih tinggi karena tembaga merupakan komponen situs aktif lakase dan telah diamati bahwa penambahan Cu2+
dapat meningkatkan aktivitas enzim.
Ketika ion Cu2+ ditambahkan, konsentrasi Cu2+ pada enzim lakase akan meningkat, apabila konsentrasinya meningkat maka akan mempercepat kerja enzim.
b. Pengaruh penambahan pelarut organik terhadap aktivitas enzim lakase
Penambahan beberapa pelarut organik (asetonitril, aseton, etanol dan metanol) dilakukan terhadap
aktivitas lakase menggunakan variasi konsentrasi akhir 5, 20 dan 40 %.
Aktivitas lakase kontrol atau tanpa penambahan pelarut organik yang didapat dari penelitian sebelumnya sebesar 332,87±8,89 U/L.
Berdasarkan Gambar 4.2 dan Tabel 4.2 aktivitas lakase mengalami penurunan seiring bertambahnya konsentrasi. Aktivitas lakase terrendah ditemukan pada pelarut asetonitril dengan konsentrasi 40 %, penurunan aktivitas sebesar 80,17%
dengan nilai rata-rata 66,00 U/L.
Berdasarkan hasil uji Duncan taraf 5
% (p ≥ 0,05), tidak adanya perbedaan secara nyata pada beberapa konsentrasi pelarut organik.
Gambar 2. Grafik pengaruh variasi konsentrasi pelarut organik terhadap aktivitas lakase.
Tabel 2. Hasil pengaruh penambahan pelarut organik terhadap aktivitas lakase.
0 50 100 150 200 250 300 350 400
Aktivitas enzim (U/L)
Pelarut organik
0%
5%
20%
40%
8
Catatan: Nilai rata-rata dari tiga kali pengulangan. Notasi huruf yang sama menunjukkan tidak ada perbedaan nyata pada 5% ( p≥0,05). Sedangkan pada notasi huruf yang berbeda memiliki perbedaan secara nyata pada 5%
(p < 0,05) berdasarkan uji Duncan Jarak Berganda.
Asetonitril menunjukkan penghambatan lakase yang relatif kuat daripada pelarut organik lainnya pada konsentrasi 40 % dengan aktivitas sebesar 66,00±4,09 U/L.
Hal ini disebabkan karena adanya perubahan konformasi enzim sehingga ikatan pada struktur kuarterner, tersier dan sekunder terganggu menyebabkan denaturasi enzim dan aktivitas lakase menurun (Monsan & Combess, 1984).
Menurut Brumer (1987), pada konsentrasi di atas 10-20 %, aktivitas enzim menurun akibat enzim terdenaturasi karena penambahan pelarut organik akan mengganggu ikatan hidrogen dan interaksi hidrofobik. Dengan demikian aktivitas dan stabilitasnya akan berubah.
KESIMPULAN
Berdasarkan hasil penelitian yang telah dilakukan, penambahan ion logam dapat meningkatkan aktivitas lakase sebesar 63,43%
dengan nilai 544±12,56 U/L pada logam Cu2+ dengan konsentrasi 10 mM. Sedangkan penambahan pelarut organik dapat menurunkan aktivitas lakase sebesar 80,17% dengan nilai 66±4,09 U/L pada pelarut asetonitril dengan konsentrasi 40 %.
DAFTAR PUSTAKA
Belitz, H. D., Grosch, W., dan Schieberle, P. 2009. Food Chemistry. Ed ke-4.
Heidelberg (DE), Springer Verlag.
Brummer, W., dan Gunzer, G. 1987.
Laboratory techniques of
enzyme recovery.
Biotechnology. Vol: 7a.
Pelarut
organik Konsentrasi Aktivitas Enzim (U/L)
Kontrol 0 % 332,87±8,89
5 % 82,16±3,78fgh
Asetonitril 20 % 74,00±3,60hi
40 % 66,00±4,09i
5 % 134,83±9,78b
Aseton 20 % 105,16±4,07d
40 % 88,50±3,46ef
5 % 149,50±3,97a
Etanol 20 % 124,50±9,99c
40 % 90,83±7,50ef
5 % 92,83±4,25e
Metanol 20 % 85,50±4,82efg
40 % 75,50±1,32ghi
9
Germany. VCH
Verlagsgesellschaft mbH.
Harcum, S. W. 2008. Purification of protein solutions, biologically inspired textiles: a volume in woodhead publishing series in textiles. Woodhead Publishing Limited.
Male, D., Telussa, I., dan Lasamahu, A. A. 2015. Isolation dan characterixation of papain from the latex of papaya. Ind.
J . Chems Res. 2: 182–189.
Monsan, P., dan D. Combess. 1984.
Stabilization of Enzyme Activity, The Proceedings of Biotechnology. Online Publications, Tld, London.
Murugesan, K., Young-Mo Kim., Jong-Rok Jeon., dan Yoon- Seok Chang. 2009. Effect of metal ions on reactive dye decolorization by laccase from Ganoderma lucidum.
Journal of Hazardous Materials. 168: 523–529.
Nadyani, K. 2022. Optimasi pH dan Suhu Pada Reaksi Enzimatis Lakase Trichoderma asperellum LBKURCC1 Hasil Fraksinasi 20-80 Ammonium Sulfat. Skripsi. Pekanbaru:
Universitas Riau.
Scopes, R. K. 1993. Protein Purification Principles dan Practice Third Edition. New York: Springer-Verlag.
Shanmugam, S., Hari, A., Ulaganathan, P., Yang, F., Krishnaswamy, S., dan Wu, Y. R. 2018. Potential of biohydrogen generation using the delignified lignocellulosic biomass by a newly identified thermostable laccase from Trichoderma asperellum strain BPLMBTI. Int J Hydrogen Energy. 43:3618-28.
Waluyo. (2004). Mikrobiologi Umum 1st Ed . UMM Press.
Malang.
