ISOLASI METABOLIT SEKUNDER DAN AKTIVITAS ANTIKANKER PAYUDARA DARI EKSTRAK BATANG GANDARIA (Bouea macrophylla Griff) SKRIPSI RICKY YOHANES

ISOLASI METABOLIT SEKUNDER DAN AKTIVITAS

ANTIKANKER PAYUDARA DARI EKSTRAK BATANG

GANDARIA (Bouea macrophylla Griff)

SKRIPSI

RICKY YOHANES

PROGRAM STUDI KIMIA

FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI

UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SYARIF HIDAYATULLAH

JAKARTA

ISOLASI METABOLIT SEKUNDER DAN AKTIVITAS

ANTIKANKER PAYUDARA DARI EKSTRAK BATANG

GANDARIA (Bouea macrophylla Griff)

Skripsi

Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains

Program Studi Kimia

Fakultas Sains dan Teknologi

Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta

Oleh

RICKY YOHANES

NIM : 11160960000035

PROGRAM STUDI KIMIA

FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI

UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SYARIF HIDAYATULLAH

JAKARTA

LEMBAR PENGESAHAN

Judul : Isolasi Metabolit Sekunder dan Aktivitas Antikanker Payudara dari Ekstrak Batang Gandaria (Bouea

macrophylla Griff)

Nama : Ricky Yohanes

NIM : 11160960000035

Program Studi : Kimia

Fakultas : Sains dan Teknologi

Universitas : UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

Menyetujui,

Pembimbing I Pembimbing II

Tarso Rudiana, M.Si Dr. Siti Nurbayti, M.Si

NIDN. 0425028704 NIP. 19740721 200212 2 002

Mengetahui, Ketua Program Studi Kimia

Dr. La Ode Sumarlin, M.Si NIP. 19750918 200801 1 007

PENGESAHAN UJIAN SKRIPSI

Skripsi yang berjudul Isolasi Metabolit Sekunder dan Aktivitas Antikanker

Payudara dari Ekstrak Batang Gandaria (Bouea macrophylla Griff) telah diuji

dan dinyatakan lulus pada Sidang Munaqosah Fakultas Sains dan Teknologi Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta pada hari Rabu 28 Oktober 2020. Skripsi telah diterima sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains (S1) Program Studi Kimia.

Menyutujui,

Penguji I Penguji II

Dr. Sandra Hermanto, M.Si NIP. 19750810 200501 1 005

Anna Muawanah, M.Si NIP. 19740508 199903 2 002

Pembimbing I Pembimbing II

Tarso Rudiana, M.Si NIDN. 0425028704

Dr. Siti Nurbayti, M.Si NIP. 19740721 200212 2 002

Mengetahui,

Dekan Fakultas Sains dan Teknologi,

Prof. Dr. Lily Surayya Eka Putri, M.Env.Stud NIP. 19690404 200501 2 005

Ketua Program Studi Kimia

Dr. La Ode Sumarlin, M.Si NIP. 19750918 200801 1 007

PERNYATAAN

DENGAN INI MENYATAKAN BAHWA SKRIPSI INI ADALAH HASIL KARYA SAYA SENDIRI DAN BELUM PERNAH DIAJUKAN SEBAGAI SKRIPSI ATAU KARYA ILMIAH PADA PERGURUAN TINGGI ATAU LEMBAGA MANAPUN.

Jakarta, Oktober 2020

Ricky Yohanes 11160960000035

ABSTRAK

RICKY YOHANES. Isolasi Metabolit Sekunder dan Aktivitas Antikanker Payudara dari Ekstrak Batang Tanaman Gandaria (Bouea macrophylla Griff). Dibimbing oleh

TARSO RUDIANA dan SITI NURBAYTI

Kanker secara umum menempati urutan kedua di dunia sebagai penyakit paling mematikan setelah penyakit jantung koroner. Gandaria (Bouea macrophylla Griff) merupakan tanaman khas Asia yang banyak ditemukan di Indonesia dan memiliki aktivitas antioksidan sangat kuat. Aktivitas antioksidan memiliki korelasi yang kuat dengan aktivitas antikanker. Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi dan mengidentifikasi metabolit sekunder dari ekstrak aktif batang tanaman gandaria (B. macrophylla). Penelitian ini meliputi maserasi, pemisahan dan pemurnian. Maserasi dilakukan dengan pelarut n-heksana, etil asetat (EA), dan metanol. Pemisahan dan pemurnian dilakukan dengan metode kromatografi vakum cair, kromatografi kolom, dan kromatografi lapis tipis. Aktivitas antikanker diuji dengan metode pengujian MTS. Penentuan struktur isolat murni menggunakan spektrometer 1H dan 13C-NMR. Ekstrak EA menunjukkan nilai aktivitas antikanker payudara MCF-7 terbaik dengan IC50 sebesar 279,73 µg/mL. Pemisahan dan

pemurnian ekstrak EA menghasilkan 1 isolat murni dengan massa 5,1 mg. Hasil analisis 1H-NMR menunjukkan 9 sinyal proton dengan 6 sinyal diantaranya merupakan sinyal proton aromatik pada pergeseran δH 6,4-7,72 ppm. Analisis 13

C-NMR, dan DEPT 135o _{menunjukkan isolat memiliki 15 karbon pada pergeseran δ} C

69,38-193,24 ppm dengan 7 diantaranya karbon kuarterner. Berdasarkan hasil analisis proton dan karbon 1D dan 2D NMR isolat memiliki kesesuaian yang tinggi dengan senyawa fustin sehingga dapat diketahui isolat tersebut merupakan senyawa 2-(3,4-dihydroxyphenyl)-3,7-dihydroxychroman-4-one atau fustin.

ABSTRACT

RICKY YOHANES. Isolation of Breast Anticancer Active Compounds From The Stems

of Gandaria Plants (Bouea macrophylla Griff). Guided by TARSO RUDIANA dan SITI

NURBAYTI

Cancer in general ranks second in the world as the deadliest disease after coronary heart disease. Gandaria (Bouea macrophylla Griff) is a typical Asian plant which is found in Indonesia and has very string antioxidant activity. Antioxidant activity has a strong correlation with anticancer activity. This study aims to isolation and identification secondary metabolite from the active extracts of the gandaria plant stem (B. macrophylla). This reasearch includes maceration, isolation, and purification. Maceration is done with n-hexane, ethyl acetate, and methanol. Separation and purfication is done with liquid vaccumn chromatography, coloumn chromatography, and thin liquid chromatography. Activity of anticancer is evaluated with MTS assay method. Elucidation structure used 1H and 13C-NMR spectrometer. EA extract showed the best activity of anticancer value with IC50

279,73 µg/mL. Separation and purification of EA extract resulted 1 isolate with 5,1 mg mass. Resulted of analysis 1H-NMR showed 9 proton signal with 6 signal is aromatic proton signal with δH 6,4-7,72 ppm. Analysis of 13C-NMR and DEPT 135o

showed the isolated has 15 carbon with shift δC 69,38-193,24 ppm with 7 is carbon

quarterner. Based on analysis resulted of proton and carbon 1D and 2D NMR, isolate 1 has high suitabillity with fustin compound so that the compound isolate can be known as 2-(3,4-dihydroxyphenyl)-3,7-dihydroxychroman-4-one or fustin compound.

viii

KATA PENGANTAR

Bismillaahirrohmaanirrohim

Assalamualaikum Warahmatullah Wabarakatuh

Puji dan syukur penulis haturkan ke hadirat Allah SWT, atas segala nikmat-Nya sehingga penulis mampu menyelesaikan skripsi ini. Shalawat serta salam semoga selalu dilimpahkan kepada junjungan kita nabi Muhammad SAW.

Skripsi ini berjudul Isolasi Metabolit Sekunder dan Aktivitas

Antikanker Payudara dari Ekstrak Batang Tanaman Gandaria (Bouea

macrophylla Griff). Pada kesempatan ini, penulis ingin menyampaikan ucapan terima kasih kepada semua pihak yang telah membantu dan mendukung sehingga penulisan skripsi ini dapat diselesaikan.

1. Tarso Rudiana, M.Si selaku pembimbing I yang telah memberikan pengetahuan mendalam dan ide penelitian melalui bimbingan dan dukungan penuh selama proses penulisan serta berbagi pengalaman dalam dunia kerja dan keilmuan

2. Dr. Siti Nurbayti, M.Si selaku pembimbing II yang telah memberikan pengetahuan melalui bimbingan keilmuan dan penulisan serta mendukung proses penulisan dan penyusunan penelitian sehingga penulisan ini dapat diselesaikan dengan baik

3. Dr. Sandra Hermanto, M.Si selaku penguji I yang telah memberikan saran dan masukan yang mendukung kelancaran penelitian yang dilakukan 4. Anna Muawanah, M.Si selaku penguji II yang telah memberikan saran dan

ix 5. Dr. La Ode Sumarlin, M.Si., selaku Ketua Program Studi Kimia, Fakultas

Sains dan Teknologi, UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

6. Prof. Dr. Lily Surayya Eka Putri, M. Env.Stud selaku Dekan Fakultas Sains dan Teknologi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

7. Orang tua dan keluarga sebagai yang pertama dan utama dalam menjadi motivasi dan semangat dalam setiap kegiatan dan usaha baik yang dilakukan 8. Pak Supriatno Salam, Aldi, Sarwan, dan seluruh teman-teman kimia angkatan 2016 yang telah memberikan motivasi dalam kelancaran penulisan.

Ciputat, 2 Oktober 2020

x

DAFTAR ISI

Halaman

KATA PENGANTAR ... viii

DAFTAR ISI ... x

DAFTAR GAMBAR ... xii

DAFTAR TABEL ... xiv

DAFTAR LAMPIRAN ... xv BAB I PENDAHULUAN ... 16 1.1 Latar Belakang ... 16 1.2 Rumusan Masalah ... 20 1.3 Hipotesis Penelitian ... 20 1.4 Tujuan Penelitian ... 20 1.5 Manfaat Penelitian ... 20

BAB II TINJAUAN PUSTAKA ... 21

2.1 Gandaria (Bouea macrophylla Griff) ... 21

2.1.1 Morfologi Tanaman Gandaria ... 21

2.1.2 Aktivitas dan Kandungan Kimia... 22

2.2 Metode Isolasi Senyawa Bahan Alam ... 23

2.3 Penentuan Struktur Senyawa Bahan Alam ... 25

2.4 Kanker dan Antikanker ... 27

2.4.1 Kanker ... 27

2.4.2 Korelasi Antioksidan dan Antikanker... 28

2.5 Metode Pengujian Antikanker ... 29

BAB III METODE PENELITIAN ... 31

3.1 Waktu dan Tempat Penelitian ... 31

xi

3.2.1 Alat... 31

3.2.2 Bahan ... 31

3.3 Diagram Alir Penelitian ... 32

3.4 Prosedur Kerja ... 33

3.4.1 Ekstraksi Batang Tanaman Gandaria ... 33

3.4.2 Pengujian Antikanker Ekstrak Kasar ... 33

3.4.3 Isolasi Senyawa Metabolit Sekunder ... 36

3.4.4 Identifikasi Isolat ... 38

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ... 39

4.1 Ekstraksi Batang Tanaman Gandaria ... 39

4.2 Uji Aktivitas Antikanker Payudara Ekstrak Batang Tanaman Gandaria ... 40

4.3 Isolasi Senyawa dari Ekstrak Aktif Antikanker Payudara ... 43

4.4 Uji Kemurnian Menggunakan KLT 2 Dimensi ... 47

4.5 Analisis Struktur Isolat 1 ... 48

4.5.1 1_{H-NMR ... 48} 4.5.2 13C-NMR ... 51 BAB V PENUTUP ... 61 5.1 Simpulan ... 61 5.2 Saran ... 61 DAFTAR PUSTAKA ... 62 LAMPIRAN ... 66

xii

DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 1. Gandaria (B. macrophylla) ... 21

Gambar 2. Kandungan senyawa pada biji tanaman gandaria ... 22

Gambar 3. Langkah dalam analisis penelitian kimia bahan alam ... 24

Gambar 4. Kromatografi lapis tipis (KLT) ... 25

Gambar 5. Pergeseran kimia 1H-NMR ... 26

Gambar 6. Pergeseran kimia 13C-NMR ... 26

Gambar 7. Distribusi kasus dan mortalitas kanker di tahun 2018 ... 27

Gambar 8. Reaksi reduksi resazurin ... 29

Gambar 9. Diagram alir penelitian ... 32

Gambar 10. Ekstrak etil asetat batang tanaman gandaria ... 41

Gambar 11. Struktur Cisplatin ... 42

Gambar 12. Hasil analisis KLT ekstrak kasar etil asetat ... 43

Gambar 13. Profil KLT hasil KVC ... 44

Gambar 14. Profil KLT hasil kolom fraksi 7 ... 45

Gambar 15. Profil KLT fraksi 7.2 ... 46

Gambar 16. Profil KLT KKG fraksi 7.2 ... 46

Gambar 17. Profil KLT target isolat 1 ... 47

Gambar 18. Profil KLT 2 dimensi isolat 1 ... 48

Gambar 19. Spektrum 1_{H-NMR dari isolat 1 ... 49}

Gambar 20. Spektrum 1H-NMR Isolat 1 ... 51

Gambar 21. Spektrum 13C-NMR isolat 1 dan Spektrum DEPT 135o NMR ... 52

xiii

Gambar 23. Spektrum 2D NMR HMQC ... 55

Gambar 24. Spektrum 2D NMR HMBC terpilih ... 55

Gambar 25. Korelasi 1H-13C HMBC ... 56

Gambar 26. Struktur isolat 1 ... 58

xiv

DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel 1. Hasil ekstraksi batang tanaman gandaria ... 39

Tabel 2. Nilai IC50 pengujian antikanker payudara ekstrak batang gandaria ... 40

Tabel 3. Massa fraksi hasil KVC ekstrak etil asetat ... 45

Tabel 4. Nilai pergeseran dan jenis karbon hasil identifikasi NMR isolat 1 ... 53

Tabel 5. Korelasi COSY dan HMBC ... 56

xv

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

Lampiran 1. Tampilan well plate hasil uji ekstrak ... 66

Lampiran 2. Dokumentasi sel hasil uji ekstrak ... 67

Lampiran 3. Absorbansi hasil uji ekstrak aktivitas antikanker ... 69

Lampiran 4. Perhitungan IC50 aktivitas antikanker MCF-7 ekstrak gandaria ... 71

Lampiran 5. Profil KLT pemisahan isolat 1 ... 74

Lampiran 6. Spektrum 1H NMR, 13C-NMR, dan DEPT 135o isolat 1 ... 75

16

BAB I PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Indonesia merupakan negara yang kaya akan sumber daya hayati. Keanekaragaman hayati yang dimiliki Indonesia berpotensi untuk dikembangkan dan menjadi aset bagi bangsa. Pengembangan dalam pemanfaatan tanaman diperlukan sebagai salah satu solusi untuk mengatasi permasalahan khususnya di bidang medis. Kandungan senyawa metabolit sekunder yang dimiliki oleh tumbuh-tumbuhan berpotensi untuk mengatasi berbagai penyakit saat ini. Tanaman sebagai tanda kebesaran Yang Maha Kuasa memiliki manfaat yang dapat digunakan untuk kebaikan umat manusia. Tanaman disebutkan dalam Al-Quran, yaitu dalam surah Ar-Ra’d ayat ke 4 yang berbunyi :

و ىِف ْلا ِض ْر ع طِق ت ٰرِو ٰج تُّم تّٰن ج َّو ْن ِ م ا نْع ا ب ع ْر ز َّو لْي ِخ ن َّو ا وْن ِص ن رْي غ َّو ا وْن ِص ن ىٰقْسُّي ءٓا مِب ا َّو د ِح ۗ  ل ِ ض ف ن و ا ه ضْع ب ىٰل ع ضْع ب ىِف ْلا ِل ك ۗ  َّنِا ْيِف كِلٰذ ٰ ل تٰي م ْو قـِ ل ِقْعَّي ن ْو ل Artinya:

"Dan di bumi terdapat bagian-bagian yang berdampingan, kebun-kebun anggur, tanaman-tanaman, pohon kurma yang bercabang, dan yang tidak bercabang; disirami dengan air yang sama, tetapi Kami lebihkan tanaman yang satu dari yang lainnya dalam hal rasanya. Sungguh, pada yang demikian itu terdapat tanda-tanda (kebesaran Allah) bagi orang-orang yang mengerti."

Al-Quran menerangkan bahwa setiap tanaman dan bagian-bagiannya memiliki kelebihan dibandingkan tanaman lain bahkan dalam hal rasa. Rasa yang dimaksud ialah dapat berupa kebaikan di dalamnya. Ini dapat terjadi karena setiap tanaman diduga memiliki kandungan kimiawi yang unik. Hal ini menegaskan bahwa setiap tanaman memiliki keunikannya masing-masing. Semua fenomena

17 tersebut menjadi bukti kebesaran Sang Maha Pencipta dan kecintaan-Nya kepada manusia (Al Qarni, 2008).

Kanker merupakan penyakit yang cukup dikhawatirkan di tengah masyarakat. Kanker saat ini menjadi salah satu penyebab sebagian besar kematian di dunia. Penyakit kanker diperkirakan mencatat kasus baru di seluruh dunia saat ini mencapai 18,1 juta kasus dengan 9,6 juta kasus kematian di tahun 2018. Salah satu jenis kanker yang saat ini menjadi fokus perhatian ialah kanker payudara. Kasus baru untuk kanker payudara dilaporkan sebanyak 2.088.849 kasus di seluruh dunia pada tahun 2018 atau 11,6 % dari total keseluruhan kasus dengan 626.679 kasus kematian atau 6,6% dari total keseluruhan kasus kanker. Hal ini menunjukkan bahwa kanker memerlukan perhatian khusus untuk ditangani (Bray et al., 2018).

Fokus penelitian saat ini cukup banyak mengarah kepada eksplorasi bahan alam sebagai agen antikanker. Bidang medis telah mengandalkan agen kemoterapeutik dalam kemoterapi pengobatan kanker (Georgakilas, 2012). Resistensi dan efek samping dari agen kemoterapeutik merupakan suatu alasan utama kegagalan dalam pengobatan kanker sehingga menjadi suatu permasalahan dalam bidang medis (Luqmani, 2005).

Gandaria (Bouea macrophylla Griff) merupakan salah satu tanaman dari Asia. Tanaman ini umumnya ditemukan di wilayah Asia Tenggara seperti Indonesia dan Asia Barat. Buah gandaria diketahui telah banyak dimanfaatkan dalam produk olahan makanan maupun dikonsumsi langsung dan dipercaya mengandung antioksidan yang baik bagi kesehatan. Antioksidan memiliki peran penting dalam menangkal radikal bebas. Sifat antioksidan diperlukan dalam menurunkan risiko

18 penyakit degeneratif akibat stres oksidatif yang mungkin ditimbulkan oleh radikal bebas.

Menurut Rajan dan Bhat (2016), buah mentah gandaria memiliki kandungan fenolik berkisar antara 2.366 mg sampai 5.050,6 mg GAE/100 g, flavonoid mencapai 1004,3 mg CE/100 g tanin mencapai 648,28 mg CE/100 g, dan pada ekstrak buah matang asam askorbat mencapai 99,27 mg AA/100 g. Golongan senyawa seperti flavonoid dan fenolik memiliki peran dalam aktivitas antioksidan. Menurut Rudiana (2018), ekstrak etil asetat batang gandaria (B. macrophylla) memiliki aktivitas antioksidan terbaik dibandingkan dengan ekstrak n-heksana dan metanol dengan nilai IC50 sebesar 4,89 µg/mL. Hal ini menunjukkan tanaman

gandaria memiliki kandungan senyawa metabolit sekunder yang dapat dimanfaatkan dalam bidang medis.

Keberadaan antioksidan memiliki korelasi penting dengan potensi sifat antikanker yang dimiliki. Menurut Kulsum et al. (2018) dalam penelitiannya menyatakan bahwa terdapat korelasi kuat antara aktivitas antioksidan dan antiproliferatif pada pengujian terhadap ekstrak amla dan jahe dengan nilai probabilitas berkisar di bawah 0,05. Hal ini menunjukkan bahwa ekstrak senyawa dengan aktivitas antioksidan yang baik memiliki aktivitas antikanker yang baik. Tanaman gandaria (B. macrophylla) kemungkinan memiliki aktivitas antioksidan yang baik sehingga berpotensi memiliki aktivitas antikanker yang kuat.

Beberapa penelitian yang telah dilakukan, diantaranya oleh Dechsupa et al. (2019) yang menyatakan ekstrak biji gandaria (B. macrophylla) memiliki potensi menghambat pertumbuhan sel leukimia dan sel kanker paru dengan nilai IC50 yang

19 ekstrak buah tanaman gandaria (B. macrophylla) menunjukkan aktivitas pencegahan photoaging dan meningkatkan kelembapan terhadap irradiasi UVB pada tikus. Hal ini memperkuat bahwa tanaman gandaria (B. macrophylla) diduga memiliki manfaat besar di bidang medis.

Bagian batang menjadi bagian penting sebuah tanaman. Bagian ini merupakan jalur penting nutrisi dan air untuk menuju bagian daun dan buah tanaman. Batang memiliki potensi kandungan senyawa metabolit sekunder alami yang dapat dimanfaatkan sebagai antioksidan maupun lebih jauh sebagai antikanker. Marliana (2007) menyatakan terdapat senyawa golongan alkaloid, flavonoid, polifenol, dan terpenoid pada analisis senyawa metabolit sekunder dari batang Spatholobus ferrugineus. Menurut Selles et al. (2002), terdapat 7 konstituen fenolik pada kulit batang mangga (Mangifera indica). Pada tanaman gandaria (B.

macrophylla), belum ada laporan lebih lanjut perihal senyawa yang berhasil

diisolasi maupun aktivitas antikanker dari bagian batang tanaman.

Pada penelitian ini dilakukan isolasi dan identifikasi struktur senyawa metabolit sekunder dari ekstrak aktif antikanker batang tanaman gandaria (B.

macrophylla). Sampel serbuk batang tanaman gandaria (B. macrophylla)

dimaserasi secara bertingkat pelarut n-heksana, etil asetat, dan metanol. Hasil maserat tiap pelarut dilakukan evaporasi sehingga didapatkan ekstrak kasar. Tiap ekstrak kasar dilakukan uji antikanker menggunakan MCF-7 breast cancer cell

lines secara in vitro. Ekstrak dengan aktivitas terbaik dipisahkan dan dimurnikan

dengan berbagai metode kromatografi. Isolat murni yang diperoleh diidentifikasi strukturnya menggunakan spektrometer 1H dan 13C-NMR.

20

1.2 Rumusan Masalah

1. Bagaimana aktivitas antikanker payudara dari ekstrak batang tanaman gandaria?

2. Bagaimana struktur senyawa metabolit sekunder hasil isolasi dari ekstrak aktif batang tanaman gandaria?

1.3 Hipotesis Penelitian

1. Ekstrak batang tanaman gandaria memiliki aktivitas antikanker payudara yang kuat

2. Struktur senyawa metabolit sekunder hasil isolasi dari ekstrak aktif batang gandariaadalah golongan flavonoid

1.4 Tujuan Penelitian

Tujuan dari penelitian ini adalah:

1. Menentukan aktivitas antikanker ekstrak batang tanaman gandaria

2. Mengisolasi dan menentukan struktur senyawa metabolit sekunder dari ekstrak aktif antikanker payudara

1.5 Manfaat Penelitian

Hasil penelitian ini diharapkan menjadi dasar penelitian pencarian lead

21

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Gandaria (Bouea macrophylla Griff)

Gandaria (B. macrophylla) merupakan tanaman asli Asia yang dapat ditemukan dari provinsi Sumatera Utara dan Jawa Barat. Tanaman ini memiliki kesamaan famili dengan mangga. Tanaman ini memiliki berbagai penamaan yang berbeda pada berbagai negara. Tanaman ini memiliki penamaan gandaria di Indonesia, ma-praang di Thailand, dan kundang di Malaysia (Subhadrabandhu, 2001).

2.1.1 Morfologi Tanaman Gandaria

Pohon gandaria (B. macrophylla) dapat tumbuh sampai ketinggian 27 m dengan panjang daun dapat mencapai 45 cm dan lebar 13 cm (Gambar 1a) (Subhadrabandhu, 2001). Gandaria umumnya memiliki daun berukuran panjang, dengan batang yang besar dan permukaan yang kasar (Harsono et al., 2016). Buah dari tanaman gandaria (B. macrophylla) (Gambar 1b) umumnya dikonsumsi langsung, namun terkadang dimasak sebagai sirup (Subhadrabandhu, 2001).

(a) (b)

Gambar 1. Gandaria (B. macrophylla) (a) Pohon gandaria (b) Buah gandaria

22

2.1.2 Aktivitas dan Kandungan Kimia

Anacardiaceae merupakan famili tanaman yang meliputi 860 spesies yang telah diketahui sampai saat ini. Famili Anacardiaceae meliputi tanaman kedondong (Spondias dulcis), pistacio (Pistacia vera), mangga (Mangifera indica), mastik (Pistacia lentiscus), dan gandaria (B. macrophylla) (Christenhusz, 2016). Fitokimia tanaman gandaria dilaporkan mengandung senyawa seperti asam galat (1), asam elagik (2), Epigalokatekin galat (3) (Gambar 2) pada bagian biji (Dechsupa et al., 2019). Selain itu, ekstrak tanaman dari famili Anacardiaceae telah diketahui memiliki aktivitas yang baik sebagai antikanker. Ekstrak biji tanaman mangga (M.

indica) diketahui memiliki aktivitas antikanker payudara dengan nilai IC50 sebesar

30 μg/mL (Abdullah, 2014).

Gambar 2. Kandungan senyawa pada biji tanaman gandaria. Asam galat (1);

Asam elagik (2); Epigalokatekin galat (3) (Zhu et al., 2013)

Gandaria (B. macrophylla) dilaporkan memiliki aktivitas antioksidan yang sangat baik. Rudiana et al. (2018) mengemukakan bahwa ekstrak etil asetat batang gandaria (B. macrophylla) memiliki aktivitas antioksidan yang baik dengan IC50

23 4,89 µg/mL. Nilai total fenolik dan flavonoid masing-masing sebesar 22,62 mg GAE/g dan 32,28 mg kuersetin/g. Menurut Kulsum et al. (2018), terdapat korelasi kuat antara aktivitas antioksidan dan antiproliferatif. Hal ini menandakan nilai antioksidan yang baik dimungkinkan memiliki indikasi yang baik terhadap kemungkinan aktivitas antikanker yang baik pula.

Dechsupa et al. (2019) melaporkan bahwa ekstrak biji tanaman gandaria memiliki aktivitas yang baik dalam menghambat pertumbuhan sel kanker. Sel kanker paru dan leukemia merupakan sel kanker yang dapat dihambat dengan baik. Variasi konsentrasi ekstrak biji gandaria dalam penelitian menghambat pertumbuhan 4 sel kanker dengan nilai IC50 bervariasi antara 3 sampai 45 µg/mL.

Ekstrak biji gandaria menunjukkan hasil penghambatan yang lebih besar pada sel kanker paru-paru dibandingkan sel leukemia

Buah gandaria dilaporkan memiliki kandungan total fenolik sampai 5 g GAE/100 g sampel. Rajan dan Bhat (2016) memaparkan bahwa buah mentah gandaria memiliki kandungan total fenolik berkisar antara 2,37 g sampai 5,05 g GAE per 100 g sampel. Sedangkan buah matang gandaria memiliki kandungan total fenolik berkisar antara 1,245 g sampai 2,387 g GAE per 100 g sampel.

2.2 Metode Isolasi Senyawa Bahan Alam

Pencarian senyawa bioaktif baru dari bahan alam telah berperan penting dalam pengembangan kimia organik. Pencarian saat ini pada bidang kimia bahan alam tidak hanya menekankan pada teknik isolasi dan penentuan struktur kimianya, tapi pengujian aktivitas biologis dari hasil isolasi yang dapat dimanfaatkan untuk kepentingan manusia menjadi sangat penting (Sampietro et al., 2009).

24 Strategi pencarian dalam area bahan alam telah berkembang signifikan dalam beberapa dekade. Proses pencarian dimulai dari pengumpulan informasi untuk analisis, proses isolasi, sampai hasil analisis (Gambar 3). Secara umum, proses eksplorasi senyawa bahan alam meliputi ekstraksi, fraksinasi, dan isolasi (Sarker et al., 2006).

Gambar 3. Langkah dalam analisis penelitian kimia bahan alam (Modolveanu

dan Victor, 2002)

Kromatografi merupakan proses yang digunakan dalam bidang kimia bahan alam untuk mendapatkan senyawa murni melalui pemisahan campuran senyawa dari komponen alami tanaman maupun hewan. Kromatografi lapis tipis (KLT) merupakan salah satu metode kromatografi planar yang umum digunakan (Gambar 4). Metode KLT digunakan untuk penentuan eluen terbaik dalam pemisahan senyawa alam. Proses kromatografi umum digunakan untuk analisis, identifikasi kemurnian, dan atau kuantifikasi senyawa. Prinsip pemisahan didasarkan kepada tingkat kepolaran senyawa yang dibawa oleh fase gerak melalui fase diam. Pada metode ini digunakan silika gel atau alumunium oksida sebagai fase diam (Sampietro et al., 2009).

25

Gambar 4. Kromatografi lapis tipis (KLT) (Sampietro et al., 2009) 2.3 Penentuan Struktur Senyawa Bahan Alam

Struktur kimiawi suatu senyawa dapat ditentukan meliputi spesifikasi geometri molekular senyawa. Geometri molekular merujuk kepada penataan spasial atom pada molekul dan ikatan kimia yang mengikat antar atom. Hal ini dapat direpresentasikan menggunakan formula struktur dan melalui model molekular (Sarker et al., 2006).

Dalam penentuan struktur senyawa kimia, satu yang umum untuk diperoleh ialah pola dan multiplisitas ikatan antara semua atom dalam molekul. Struktur dapat ditentukan melalui pengukuran spektroskopi NMR (Sampietro et al., 2009).

NMR (nuclear magnetic resonace) merupakan salah satu instrumentasi yang digunakan oleh ahli kimia sebagai alat bantu dalam penentuan struktur. NMR termasuk perangkat utama dalam penelitian khususnya di bidang organik. Dasar fisika spesktroskopi NMR terletak pada sifat magnetik suatu inti atom. Interaksi terjadi antara inti atom dengan medan magnet eksternal (Gunther, 2013).

26

Gambar 5. Pergeseran kimia 1H-NMR (Gunther, 2013)

Spektroskopi NMR didasarkan pada penerapan gelombang radio oleh inti tertentu dalam molekul organik. Spektra resonansi magnet inti proton (1H-NMR) memberikan informasi tentang jenis hidrogen, jumlah hidrogen, dan lingkungan hidrogen dalam suatu senyawa. Spektra resonansi magnet ini karbon (13C-NMR) memberikan informasi tentang jumlah karbon dan jenis karbon pada suatu senyawa. Pergeseran kimia untuk 1H-NMR dan 13C-NMR ditunjukkan dalam Gambar 5 dan 6 (Supratman, 2010).

27

2.4 Kanker dan Antikanker 2.4.1 Kanker

Kanker merupakan kelompok penyakit yang disebabkan oleh terjadinya pertumbuhan sel yang tidak normal pada suatu jaringan dengan potensi untuk menyebar dan menyerang bagian lain dalam tubuh (Al-Naggar, 2014). Kanker saat ini menjadi salah satu penyakit yang menyebabkan kematian terbesar setelah penyakit jantung koroner. Kanker secara umum disebabkan oleh terjadinya mutasi genetik yang muncul akibat faktor gaya hidup dan lingkungan (Anand et al., 2008).

Kanker payudara merupakan jenis kanker yang berkembang pada jaringan payudara (Al-Naggar, 2014). Kasus kematian akibat kanker tercatat sebanyak 9,6 juta kasus pada tahun 2018 (Gambar 7). Kanker payudara mencatat sebanyak 2.088.849 kasus baru ditahun 2018 dan menyebabkan kematian sebanyak 626.679 kasus (Bray et al., 2018). Kanker payudara berkembang akibat berbagai faktor antara lain obesitas, kurangnya latihan fisik atau olahraga, meminum alkohol, terpapar radiasi ionisasi, usia, serta faktor keturunan (Anand et al., 2008).

Gambar 7. Distribusi kasus dan mortalitas kanker di tahun 2018

28

2.4.2 Korelasi Antioksidan dan Antikanker

Antikanker atau agen kemoterapeutik merupakan senyawa kimiawi yang memiliki efek penghambatan pada kanker. Agen kemoterapeutik digunakan dalam kemoterapi dalam pengobatan kanker (Georgakilas, 2012). Oksidasi ialah reaksi kimia yang menghasilkan radikal bebas, yang dapat menyebabkan reaksi berantai jika dialami oleh sel organisme akan mengalami kerusakan. Antioksidan merupakan senyawa dengan kemampuan menghambat terjadinya oksidasi (Rao et al., 2011).

Pada makhuk hidup, seperti tanaman memiliki sistem utama dalam menanggulangi oksidasi. Senyawa metabolit sekunder merupakan keluaran metabolisme tanaman sebagai upaya pertahanan diri (Sarker et al., 2006). Beberapa senyawa berkontribusi terhadap pertahanan oksidasi melalui pengkelatan logam maupun mencegah terjadinya reaksi radikal bebas pada sel (Rao et al., 2011).

Korelasi antara aktivitas antioksidan dan antikanker saat ini menjadi perhatian dalam berbagai kesempatan penelitian. Berbagai penelitian mengemukakan hubungan antara kedua aktivitas. Li et al. (2007) mengemukakan terdapat hubungan linier yang positif antara aktivitas antioksidan dan efek antikanker pada lima ekstrak herbal sampel. Aktivitas antikanker pada penelitian tersebut dievaluasi pada MCF-7 human breast cancer cell lines. Hal senada juga dikemukakan oleh Mendonca et al. (2019), yang menyatakan bahwa terdapat korelasi kuat antara aktivitas antioksidan dan antikanker pada pengujian anggur muscadine.

29

2.5 Metode Pengujian Antikanker

Pengujian antikanker saat ini menjadi salah satu fokus dalam berbagai penelitian bahan alam. Penelitian antikanker dapat dilakukan dengan berbagai metode. Metode pengujian MTS

(3-[4,5,-dimethylthiazol-2-yl]-5-[3-carboxymethoxy-phenyl]-2-[4-sulfophenyl]-2H-tetrazolium inner salt) merupakan

salah satu metode yang dapat digunakan. Metode pengujian MTS pada penelitian antikanker memiliki prinsip pengukuran aktivitas metabolik sel. Pengukuran didasarkan kepada viabilitas sel dengan memanfaatkan perubahan penampakan warna akibat terjadinya reduksi zat warna resazurin. Resazurin mengalami reduksi menjadi resorufin melalui aktivitas metabolik sel (Gambar 8). Metode ini dapat digunakan untuk penelitian jangka panjang karena memiliki sifat toksisitas yang rendah (Rahman et al., 2005).

N+ O O -O O H N O O O H

Gambar 8. Reaksi reduksi resazurin (Oja et al., 2014)

Metode MTS memiliki kelebihan dibandingkan metode lain dalam pengujian antikanker. Kelebihan yang dimiliki ialah sifat non-toksik. Hal ini memungkinkan sel yang digunakan untuk dipakai kembali melalui kultur untuk pengujian lain (Sorbello et al., 2006). Pada pengujian menggunakan metode MTS, sel MCF-7 umum digunakan sebagai model cell line kanker payudara.

Sel kanker payudara MCF-7 (Michigan Cancer Foundation-7) merupakan

30 menderita kanker pada payudaranya. MCF-7 merupakan model in vitro yang baik untuk studi mekanisme respon tumor. Sebelum penggunaan MCF-7, tidak memungkinkan penelitian kanker untuk mendapatkan cell line mamalia yang mampu tersedia untuk penelitian yang membutuhkan waktu yang lama (Levenson dan Jordan, 1997).

31

BAB III

METODE PENELITIAN

3.1 Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Agustus 2019 sampai Maret 2020. Proses ekstraksi, isolasi, dan uji aktivitas antikanker dilakukan di Laboratorium Sentral Universitas Padjadjaran Jatinangor. Analisis isolat dilakukan di Pusat Penelitian Kimia LIPI Serpong.

3.2 Alat dan Bahan 3.2.1 Alat

Rotary evaporator BUCHI tipe R-300 yang dilengkapi vacuum pump BUCHI

tipe V-100, 1H dan 13C Nuclear Magnetic Resonance (NMR) (JEOL ECZ-600, 500 MHz for 1H dan 125 MHz untuk 13C), Multimode Reader, Centrifuge, Biosafety

cabinet (BSC), inkubator CO2, dan alat gelas umum lainnya.

3.2.2 Bahan

Sampel batang gandaria (B. macrophylla) dari Kabupaten Serang, Banten, berbagai pelarut organik grade teknis terdestilasi seperti n-heksana, metilen klorida (MTC), etil asetat, aseton, etanol, dan metanol serta kloroform (Merck). Silika gel 60 (Merck), TLC plates silica gel GF254 alumunium sheets (Merck), cisplatin,

antibiotik streptomisin, dimetil sulfoksida (DMSO), phosphate buffered saline (PBS), reagen prestoblueTM _{cell viability, Roswell Park Memorial Institute medium}

32

3.3 Diagram Alir Penelitian

Gambar 9. Diagram alir penelitian

7,6 kg Batang Gandaria (B. macrophylla)

Maserasi dilakukan dengan kepolaran bertingkat menggunakan n-heksana, etil asetat, dan metanol.

Evaporasi pada suhu 40o_{C, 150 sampai 260 mBar}

Ekstrak kasar etil asetat

Ekstrak kasar metanol

Uji aktivitas antikanker dilakukan dengan menggunakan MCF-7 Human Breast Cancer Cell Lines secara in vitro

Ekstrak dengan aktivitas antikanker terbaik

Pemisahan dilakukan dengan berbagai metode kromatografi diantaranya KLT, KVC, KKG. Uji kemurnian dengan KLT 2D

Isolat Murni

Struktur diidentifikasi senyawa

menggunakan spektrometer 1_H

dan 13_C-NMR

Ekstrak kasar

33

3.4 Prosedur Kerja

3.4.1 Ekstraksi Batang Tanaman Gandaria

Serbuk batang gandaria (B. macrophylla) sebanyak 7,6 kg dimaserasi dengan

n-heksana, etil asetat, dan metanol. Sampel dimaserasi dengan masing-masing

pelarut organik selama 3 hari secara bertahap. Maserat dipekatkan dengan menggunakan vaccum rotary evaporator pada suhu 40oC dengan tekanan 150 sampai 260 mBar sehingga didapatkan ekstrak pekat (crude extract).

3.4.2 Pengujian Antikanker Ekstrak Kasar (Skehan et al, 1990)

Aktivitas antikanker ekstrak kasar dievaluasi dengan menggunakan MTS

assay.

3.4.2.1 Preparasi media, kontrol positif, dan sampel

Media kultur cair Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI) komplit (yang mengandung Fetal Bovine Serum (FBS) 10% dan 50 μL antibiotik untuk 50 mL media) disiapkan. Cisplatin sebagai kontrol positif disiapkan. Sampel yang akan diuji dibuat dalam berbagai konsentrasi, yaitu 1000; 500; 250; 125; 62,50; 31,25; 31,25; 15,63; dan 7,81 μg/mL. Pelarut yang digunakan yang tidak bersifat

toksik terhadap sel (DMSO <5%). Larutan kerja antiproliferasi assay PrestoBlue™

Cell Viability Reagent disiapkan. 3.4.2.2 Preparasi sel

Sel yang akan digunakan telah konfluen min 70% media ditempatkan pada

dish, lalu bilas sel sebanyak 2x dengan 1 mL PBS. Larutan Trypsin-EDTA 1 mL

ditambahkan lalu diinkubasi selama 5 menit agar lapisan sel terdispersi (di bawah mikroskop inverted sel akan tampak melayang. Sel dipindahkan ke dalam tabung

34 yang telah berisi media. Sel disentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm selama 5 menit. Supernatan dibuang, lalu pelet dilarutkan ke dalam tabung berisi media.

3.4.2.3 Seeding cell ke dalam 96 well plate

Jumlah dan viabilitas sel (dengan trypan blue exclusion) ditentukan, dan

resuspend sel dengan kepadatan sel akhir 170.000 sel/mL dalam media (17.000

sel/well). Trypan blue disiapkan 10 μL dalam microtube steril. Suspensi sel sebanyak 10 μL ditambahkan ke dalam larutan trypan blue lalu dihomogenkan. Hemasitometer dibersihkan dan tutup slip menggunakan etanol 70% kemudian dikeringkan. Larutan sel-trypan blue sebanyak 10 μL dimasukkan dengan menggunakan pipet secara perlahan-lahan ke salah satu sisi bilik/chamber. Jumlah sel yang sehat dihitung dan tentukan jumlah sel (viabel) per mL. Kultur sel dilakukan di wadah 96 well plate, kemudian diinkubasi selama 24 jam (atau sampai sel konfluen min. 70%) pada pada suhu 37°C dan 5% gas CO2.

3.4.2.4 Perlakuan sel dengan sampel, kontrol positif, dan kontrol negatif

Delapan buah microtube 1,5 mL disiapkan, lalu masing-masing microtube diberi label konsentrasi pengenceran yang sesuai, kemudian stok sampel diencerkan menjadi delapan varian konsentrasi menggunakan pelarut media. Well plate 96 yang telah berisi sel dari inkubator dikeluarkan. Plat sepanjang margin diberi label pada kiri untuk baris mana yang akan diberi perlakuan oleh standar dan baris mana yang akan diberi sampel. Media dari setiap well lalu dibuang. Mikropipet digunakan untuk memindahkan 100 μL masing-masing sampel dan kontrol positif cisplatin dari microtube ke dalam masing-masing well yang sesuai pada 96 well plate yang telah berisi sel dan selanjutnya diinkubasi kembali selama 48 jam.

35

3.4.2.5 Pemberian pereaksi presto blue dan pengukuran absorbansi

Media sebanyak 9 mL pada tube disiapkan yang ditambahkan 1 mL PrestoBlue™ Cell Viability Reagent (10 μL pelarut untuk 90 μL media). Campuran larutan tersebut sebanyak 100 μL dimasukkan ke dalam tiap well microplate kemudian diinkubasi selama 1-2 jam sampai terlihat perubahan warna (Saat memasuki sel hidup, pereaksi PrestoBlue® akan direduksi dari senyawa biru resazurin, menjadi senyawa resorufin yang berwarna merah muda dan sangat berpendar). Nilai IC50 sebanding dengan nilai konsentrasi pada setengah absorbansi

jumlah sel yang aktif. Pengukuran absorbansi dilakukan pada panjang gelombang 570 nm (resorufin) dan 600 nm (resazurin) menggunakan multimode reader. Perhitungan nilai absorbansi pada konsentrasi tertentu :

𝑦 = (𝑎𝑏𝑠 570 − 𝑎𝑏𝑠 600) − Χ 𝑚𝑒𝑑𝑖𝑎 𝑐𝑒𝑙𝑙 Keterangan:

𝑦 / corrected absorbance = nilai abs orbansi kurva linier pada konsentrasi sampel tertentu

abs 570 = absorbansi sampel pada konsentrasi tertentu abs 600 = absorbansi sampel pada konsentrasi tertentu X media cell = rerata absorbansi media cell

Perhitungan IC50 aktivitas antikanker :

Persamaan kurva regresi linier yang diperoleh dari kurva konsentrasi berbanding corrected absorbance

𝑦 = 𝑎𝑥 + 𝑏 Keterangan:

y = nilai rerata corrected absorbance media + pelarut dibagi 2 x = nilai konsentrasi IC50

36

3.4.3 Isolasi Senyawa Metabolit Sekunder

Ekstrak kasar batang gandaria dilakukan pemisahan dan pemurnian dengan berbagai metode kromatografi antara lain: kromatografi lapis tipis (KLT), kromatografi vakum cair (KVC), dan kromatografi kolom gravitasi (KKG).

3.4.3.1 Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

Metode KLT dilakukan untuk menentukan eluen terbaik yang akan digunakan dalam proses kromatografi vakum cair dan kromatografi kolom gravitasi. Sejumlah ekstrak diambil dengan menggunakan pipa kapiler dan ditotolkan pada plat KLT silika gel 60 F254. Ekstrak yang telah ditotolkan pada plat

KLT dielusi dengan campuran pelarut organik dengan berbagai perbandingan. Campuran eluen yang digunakan dapat berupa campuran dua atau lebih pelarut organik. Ekstrak yang telah dielusi dilakukan deteksi pergeseran titik spot ekstrak. Deteksi dilakukan dengan menggunakan lampu UV pada panjang gelombang 254 dan 365 nm. Eluen pelarut terbaik digunakan pada proses kromatografi vakum cair dan kromatografi kolom gravitasi (Fitrya et al., 2010).

3.4.3.2 Kromatografi Vakum Cair (KVC)

Metode KVC dilakukan untuk memisahkan senyawa pada ekstrak kasar (crude extract) sampel. Metode ini dilakukan dengan bantuan vakum. Ekstrak sampel, silika gel 60 70-230 mesh untuk kolom kromatografi, dan silika gel impreg 60 disiapkan. Perbandingan jumlah sampel dan silika gel untuk kolom sebesar 1:10. Perbandingan jumlah sampel dan silika gel impreg sebesar 1:1. Silika gel ditempatkan pada kolom KVC kemudian dipadatkan. Silika gel yang ditempatkan pada kolom KVC dijenuhkan. Ekstrak sampel dicampurkan dengan silika impreg dalam wadah mortar dan diaduk hingga merata. Campuran sampel dan silika

37 impreg dibiarkan kering hingga membentuk bubuk. Campuran yang telah siap ditempatkan pada kolom KVC. Campuran sampel dan silika impreg dielusi dengan menggunakan campuran pelarut organik hasil KLT. Elusi dilakukan dengan metode gradien (Fitrya et al., 2010).

3.4.3.3 Kromatografi Kolom Gravitasi (KKG)

Metode KKG dilakukan untuk memisahkan senyawa hasil pemisahan KVC untuk mendapatkan isolat murni. Ekstrak sampel, silika gel 60 70-230 mesh untuk kolom kromatografi, dan silika gel impreg 60 disiapkan. Perbandingan jumlah sampel dan silika gel untuk kolom ialah sebesar 1:30. Perbandingan jumlah sampel dan silika gel impreg ialah sebesar 1:1. Silika gel ditempatkan pada kolom KKG kemudian dipadatkan. Silika gel yang ditempatkan pada kolom KKG dijenuhkan. Ekstrak sampel dicampurkan dengan silika impreg dalam wadah mortar dan diaduk hingga merata. Campuran sampel dan silika impreg dibiarkan kering hingga membentuk bubuk. Campuran yang telah siap ditempatkan pada kolom KVC. Campuran sampel dan silika impreg dielusi dengan menggunakan campuran pelarut organik hasil KLT. Elusi dilakukan dengan metode gradien atau isokratik (Fitrya et al., 2010).

3.4.3.4 Uji Kemurnian Isolat

Isolat diuji kemurniandengan kromatografi lapis tipis 2D menggunakan plat silika gel GF254 (Merck). Sejumlah isolat diambil dengan menggunakan pipa kapiler

dan ditotolkan pada plat KLT silika gel GF254 dengan dimensi area elusi plat 5 cm:5

cm. Isolat yang telah ditotolkan pada plat KLT dielusi dengan campuran pelarut organik dengan berbagai perbandingan. Penampakan 1 spot pada daerah elusi menunjukkan kemurnian isolat. Isolat yang telah murni dilakukan karakterisasi.

38

3.4.4 Identifikasi Isolat

Senyawa murni hasil isolasi dikarakterisasi struktur senyawanya dengan pengukuran menggunakan instrumentasi spektrometer 1H dan 13C-NMR. Isolat murni sebanyak 5 mg dan dilarutkan dalam 0,5 mL pelarut bebas proton yaitu aseton-d (CD3COCD3). Larutan sampel dimasukkan ke dalam tabung injeksi

kemudian diletakan dalam alat NMR untuk mengukur 1H-NMR pada 500 MHz dan

39

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Ekstraksi Batang Tanaman Gandaria

Serbuk halus batang gandaria sebanyak 7,6 kg diekstraksi. Proses ekstraksi menggunakan metode maserasi dengan kepolaran bertingkat. Proses ini dilakukan dengan menggunakan pelarut yang berbeda tingkat kepolarannya yaitu pelarut n-heksana (nonpolar), etil asetat (semipolar), dan metanol (polar). Proses maserasi dilakukan selama 3x24 jam pada masing-masing pelarut.

Maserasi bertingkat dipilih karena metode ini mudah digunakan serta dapat mengekstrak seluruh kandungan metabolit sekunder yang terdapat pada sampel secara bertingkat mulai dari non polar, semi polar, dan polar dengan baik. Proses maserasi memiliki kelebihan diantaranya kandungan senyawa metabolit sekunder yang tidak tahan panas dapat terekstraksi dengan baik (Clark et al., 2013). Maserat kemudian dievaporasi sehingga diperoleh ekstrak kasar (crude extract). Tabel 1 menunjukkan massa dan % rendemen yang diperoleh dari masing-masing ekstrak.

Tabel 1. Hasil ekstraksi batang tanaman gandaria

No. Sampel Massa Ekstrak (g) Rendemen (%)

1 Ekstrak n-heksana 21,11 0,27

2 Ekstrak etil asetat 19,90 0,26

3 Ekstrak metanol 50,00 0,64

Hasil maserasi menunjukkan massa dari ekstrak metanol memiliki nilai terbesar dibanding ekstrak n-heksana dan etil asetat. Hal ini dikarenakan metanol merupakan pelarut universal yang bersifat amfifilik. Amfifilik merupakan sifat gabungan hidrofilik (polar) dan lipofilik (nonpolar). Metanol dapat mengekstraksi

40 senyawa dengan sifat polar maupun nonpolar sehingga rendemen yang dihasilkan lebih besar dibanding dua pelarut lainnya (Houghton dan Raman, 1998).

Ekstraksi menggunakan metode maserasi didasarkan kepada sifat kelarutan senyawa metabolit terhadap pelarut. Tingkat kepolaran mempengaruhi kandungan yang terekstrak. Senyawa metabolit sekunder seperti golongan steroid dan terpenoid yang bersifat nonpolar larut baik dalam pelarut nonpolar. Golongan flavonoid glukosida, alkaloid dan flavonoid termetilasi larut baik dalam pelarut-pelarut semipolar. Sedangkan golongan fenolik, flavonoid, dan flavonoid glukosida yang bersifat lebih polar larut baik dalam pelarut polar (Sarker dan Nahar, 2012).

4.2 Uji Aktivitas Antikanker Payudara Ekstrak Batang Tanaman Gandaria

Pengujian aktivitas antikanker payudara dilakukan terhadap ekstrak kasar batang tanaman gandaria. Pengujian dilakukan pada ekstrak n-heksana, etil asetat, dan metanol. Tabel 2 menunjukkan hasil pengujian aktivitas antikanker payudara dari ketiga ekstrak. Ekstrak etil asetat memiliki aktivitas antikanker payudara terbaik dengan nilai IC50 sebesar 279,73 µg/mL. Hasil perhitungan didapatkan

berdasarkan data absorbansi yang diperoleh (Lampiran 4). Lampiran 1 menunjukkan tampilan well plate hasil uji ekstrak.

Tabel 2. Nilai IC50 pengujian antikanker payudara ekstrak batang gandaria

No. Sampel IC50 (µg/mL)

1 Ekstrak n-heksana 3.572,50

2 Ekstrak etil asetat 279,73

3 Ekstrak metanol 482,75

Menurut National Cancer Institute (NCI), aktivitas ekstrak antikanker dikategorikan menjadi 3 kategori. Kategori tersebut ialah aktif (IC50 < 20 µg/mL),

41 Bibby, 2005). Merujuk pada ketegori dari NCI, aktivitas ekstrak etil asetat termasuk kategori tidak aktif. Meskipun demikian, potensi aktivitas ekstrak etil asetat (EA) lebih baik dibandingkan ekstrak n-heksana dan metanol (Tabel 2). Dokumentasi sel pada uji ekstrak EA menunjukkan penurunan jumlah sel yang tampak pada konsentrasi 250 µg/mL (Lampiran 2).

Etil asetat umum digunakan sebagai pelarut dalam ekstraksi bahan alam. Berbagai metabolit sekunder dapat terekstraksi dengan baik pada pelarut ini. Golongan metabolit sekunder yang terlarut baik dalam etil asetat antara lain alkaloid, flavonoid termetilasi, serta golongan tanin (Sarker et al., 2006). Hasil uji aktivitas antikanker pada penelitian ini menunjukkan bahwa ekstrak etil asetat lebih aktif dibandingkan ekstrak n-heksana dan metanol. Gambar 10 menunjukkan ekstrak etil asetat batang tanaman gandaria.

Gambar 10. Ekstrak etil asetat batang tanaman gandaria

Ekstraksi menggunakan etil asetat telah dilaporkan memiliki potensi yang baik terhadap aktivitas antikanker. Aktivitas antikanker payudara ekstrak etil asetat tanaman Campnosperma zeylanica lebih baik dibandingkan ekstrak lainnya. Potensi ekstrak etil asetat dilaporkan lebih baik dari ekstrak metanol pada bagian kulit batang dan lebih baik dibanding ekstrak n-heksana, kloroform, metanol pada bagian daun (Jayarathna et al., 2016).

42 Kandungan pada ekstrak etil asetat mempengaruhi aktivitas antikanker yang dimiliki. Salah satu golongan yang dapat larut dalam etil asetat dan memiliki aktivitas yang baik terhadap uji aktivitas antikanker ialah flavonoid. Total flavonoid pada ekstrak etil asetat batang tanaman gandaria dilaporkan sebesar 32,28 mg kuersetin/g (Rudiana et al., 2019). Ahmed (2016) melaporkan aktivitas yang baik salah satu senyawa golongan flavonoid, yaitu senyawa kuersetin terhadap uji aktivitas antikanker MCF-7 dengan nilai IC50 mencapai 0,87 µg/mL. Hal ini

memperkuat bahwa potensi ekstrak etil asetat menghasilkan nilai aktivitas antikanker payudara yang lebih baik dibandingkan pelarut lainnya.

Senyawa metabolit sekunder dapat melalui mekanisme yang berbeda-beda dalam perannya sebagai antikanker. Mekanisme yang dapat dilalui antara lain ialah inisiasi apoptosis sel dan inhibisi sel.. Pada penelitian ini, kontol positif yang digunakan ialah cisplatin (Gambar 11). Cisplatin merupakan obat sitotoksik pertama yang menghambat kultur sel melalui mekanisme apoptosis (Barry et al., 1990).

Gambar 11. Struktur cisplatin

Dalam jalur apoptosis sel, agen antikanker dapat berperan dalam jalur mekanisme melalui memodulasi sensitivitas sel yaitu jalur

sphingomyelin-ceramide. Sejumlah obat kemoterapeutik menunjukkan efek melalui jalur aktivasi

enzim sphingomyelinase sehingga kematian sel kanker dapat terjadi. Mekanisme ini dilalui oleh beberapa jenis obat seperti daunorubicin, mitoxantrone, etoposide,

43 Etil asetat merupakan pelarut yang bersifat semipolar. Pelarut ini dapat mengekstraksi dengan baik senyawa-senyawa golongan flavonoid, alkaloid, dan steroid. Flavonoid merupakan salah satu golongan senyawa yang dapat berperan sebagai agen antikanker melalui mekanisme apoptosis maupun inhibisi sel bergantung kepada subtituen yang dimiliki (Lazaro, 2002). Keberadaan golongan senyawa yang memiliki peran dalam aktivitas antikanker pada ekstrak etil asetat, memungkinkan terjadinya peningkatan nilai aktivitas antikanker payudara pada ekstrak tersebut.

4.3 Isolasi Senyawa dari Ekstrak Aktif Antikanker Payudara

Proses pemisahan senyawa dilanjutkan terhadap ekstrak etil asetat. Ekstrak etil asetat dipilih karena memiliki aktivitas antikanker payudara terbaik. Isolasi dilakukan melalui tahap KLT, KVC dan KKG.

Metode KLT merupakan metode pemisahan senyawa bahan alam berdasarkan perbedaan sifat kepolaran. Sifat berpendar dari senyawa pada lampu UV-254 dan UV-365 memberikan gambaran terhadap jenis senyawa yang terkandung (Sarker dan Nahar, 2012). Hasil profil KLT kandungan ekstrak etil asetat dapat dilihat pada Gambar 12.

Gambar 12. Hasil analisis KLT ekstrak kasar etil asetat. (a) UV-254; (b) UV-365;

44 Hasil profil KLT menunjukkan sifat berpendar pada lampu UV-254 maupun 365. Pada analisis di bawah lampu UV-365, diketahui ekstrak memiliki pendaran warna merah, biru muda, biru, dan hijau (Gambar 11b). Berdasarkan Sampietro et al. (2009), pendaran berwarna biru, merah, hijau, dan kuning pada deteksi UV-365 menandakan kandungan metabolit sekunder seperti kumarin, derivat antrasen, flavonoid, dan alkaloid.

Eluen terbaik untuk pemisahan ekstrak dengan kromatografi lapis tipis adalah metilen klorida (MTC), etil asetat dan etanol dengan perbandingan 7:2:1. Pemilihan eluen tersebut didasarkan pada pola noda yang terpisah dibandingkan dengan eluen lainnya. Selanjutnya dilakukan pemisahan ekstrak menggunakan KVC secara gradien (10%; v/v) menggunakan perbandingan pelarut di atas. Hasil KVC ekstrak menghasilkan 11 fraksi (Gambar 13). Tabel 3 menunjukkan massa dari setiap fraksi yang diperoleh.

Gambar 13. Profil KLT hasil KVC dengan eluen MTC:EA:EtOH (7:2:1)

Pemisahan lebih lanjut dilakukan terhadap fraksi 7 berdasarkan kemudahan pola pemisahan pada KLT dan bobot massa fraksi. Proses isolasi terhadap fraksi 7 dilakukan dengan menggunakan kromatografi kolom gravitasi.

45

Tabel 3. Massa fraksi hasil KVC ekstrak etil asetat

Fraksi Massa (mg) 1 664,7 2 273,5 3 896,2 4 3880,2 5 631,1 6 606,2 7 594,7 8 2479,6 9 674,7 10 320.9 11 276,8

Gambar 14 menunjukkan profil KLT hasil kolom fraksi 7. Hasil pemisahan fraksi 7 menghasilkan 2 subfraksi, 7.1 dan 7.2. Noda nomor 1 sampai 4 pada gambar digabungkan sebagai fraksi 7.1 (189,3 mg) dan noda nomor 5 sampai akhir digabungkan sebagai fraksi 7.2 (232,9 mg).

(a) (b)

Gambar 14. Profil KLT hasil kolom fraksi 7 dengan eluen MTC:EA (4:6)

(a) UV-254; (b) UV-365

Proses pemisahan dilanjutkan terhadap fraksi 7.2 karena memiliki massa lebih banyak dibandingan fraksi 7.1. Fraksi 7.2 dianalisis pola profil KLT-nya. Eluen dengan kompisisi n-heksana:MTC:EA (3:4:2) memberikan pemisahan terbaik (Gambar 15). Proses pemisahan dengan KKG terhadap fraksi 7.2 dilakukan dengan menggunakan eluen tersebut secara isokratik.

46

Gambar 15. Profil KLT fraksi 7.2 dengan eluen n-heksan:MTC:EA (3:4:2)

Hasil pemisahan menggunakan kromatografi kolom gravitasi terhadap fraksi 7.2 menghasilkan 80 fraksi, dimana pada fraksi 48-51 menunjukkan noda tunggal yang sama dan selanjutnya ditetapkan sebagai target (Gambar 16).

Gambar 16. Profil KLT KKG fraksi 7.2 dengan eluen MTC:EA:Aseton (5:4:1)

(a) UV-254; (b) UV-365

Profil KLT target (isolat 1) dari gabungan fraksi 48-51 memperlihatkan noda tunggal pada jalur elusi, baik pada pengamatan di bawah lampu UV-254 maupun UV-365 nm (Gambar 17). Hal ini menunjukkan dugaan bahwa isolat 1 telah murni Selanjutnya dilakukan uji kemurnian KLT 2 dimensi pada isolat 1.

47

Gambar 17. Profil KLT target isolat 1 dengan eluen n-heksana:MTC:EA (1:5:4)

(a) UV-254 (kiri); (b)UV-365 (kanan)

4.4 Uji Kemurnian Menggunakan KLT 2 Dimensi

Kromatografi 2 dimensi merujuk kepada proses kromatografi yang mana dilakukan 2 kali elusi dengan 2 eluen berbeda pada kromatogram yang sama namun arah elusi yang berbeda 90o. Teknik ini mudah dilakukan untuk memisahkan komponen dalam suatu campuran sehingga dapat ditentukan kemurniannya. Hal ini berguna dilakukan untuk pemisahan campuran kompleks dengan kandungan senyawa yang mirip (Sampietro et al., 2009).

Pengujian KLT 2 dimensi dilakukan untuk mengetahui kemurnian isolat 1 yang diperoleh. Elusi pertama dilakukan dengan menggunakan metilen klorida (MTC) dan etil asetat dengan perbandingan 3:7. Elusi kedua dilakukan dengan menggunakan komposisi pelarut yang berbeda, yaitu menggunakan aseton dan etanol dengan perbandingan 9:1. Gambar 18 menunjukkan profil KLT dua dimensi. Satu noda telah terlihat pada plat KLT 2 dimensi yang digunakan. Hal ini menunjukkan bahwa isolat 1 telah murni. Langkah selanjutnya ialah penentuan struktur menggunakan instrumentasi NMR (nuclear magnetic resonance)

48 (a)

(b)

Gambar 18. Profil KLT 2 dimensi isolat 1. (a) eluen MTC:EA 3:7;

(b); eluen aseton:EtOH 9:1 (2)

4.5 Analisis Struktur Isolat 1

4.5.1 1_H-NMR

Isolat 1 diidentifikasi menggunakan 1D NMR. Pengukuran spektrum 1 H-NMR terhadap isolat dilakukan untuk mengetahui struktur isolat berdasarkan proton yang dimiliki. Spektrum 1H-NMR memberikan 3 informasi penting untuk penentuan struktur kimia dalam penelitian bahan alam. Informasi yang dapat diperoleh antara lain, nilai geseran kimia (δH) untuk menentukan jenis hidrogen,

konstanta kopling dan multiplisitas untuk menentukan lingkungan hidrogen, dan nilai integrasi untuk menentukan jumlah hidrogen (Supratman, 2010).

Berdasarkan spektrum 1H-NMR yang diperoleh terdapat 8 sinyal proton dengan jumlah proton sebanyak 8 proton. Sinyal proton spektrum NMR muncul

Elu si Per ta m a Elusi Kedua

49 pada rentang 4,5 sampai 8 ppm. Spektrum 1H-NMR isolat 1 dapat dilihat pada Gambar 19.

Gambar 19. Spektrum 1H-NMR dari isolat 1 (aseton-D6, 500 MHz)

Sinyal proton spektrum NMR isolat 1 pada geseran kimia 6-8 ppm muncul 6 sinyal yang khas sebagai proton aromatik. Pada rentang ini terdapat 6 proton. Hal ini menunjukkan bahwa struktur kimia isolat mempunyai kerangka cincin aromatik (Gunther, 2013). Sinyal 6 proton tersebut muncul pada δH 6,40 (1H, d, J = 2,5 Hz)

dan 6,62 (1H, dd, J = 8,5 Hz; 2 Hz), δH 6,86 (1H, dd, J = 8 Hz; 2,5 Hz), 6,92 (1H, td, J = 8 Hz; 2 Hz), dan 7,07 (1H, d, J = 2,5 Hz), 7,72 (1H, d, J = 8,5 Hz). Nilai

konstanta kopling (J) 8 sampai 8,5 Hz menunjukkan pola orto, sedangkan J dengan nilai 2 sampai 2,5 menunjukkan pola meta. Berdasarkan Mabry et al. (1964), sinyal proton pada rentang 6 sampai 8 ppm dengan pola nilai kopling orto dan meta mengindikasikan kerangka isolat yang diperoleh adalah golongan flavonoid.

Flavonoid memiliki ciri khas spektrum pada masing-masing kerangka cincinnya. Secara umum, cincin A dengan substituen 5,7-dihidroksi memiliki pola sinyal proton yang akan muncul pada geseran kimia 6,0 sampai 6,7 ppm (Mabry et al., 1964). Sinyal proton pada rentang 6,0 sampai 6,7 ppm muncul sebanyak 2 sinyal pada δH 6,40 (1H, d, J = 2,5 Hz) dan 6,62 (1H, dd, J = 8,5 Hz; 2 Hz) yang

ab u n d an ce 0 0 .1 0 .2 0 .3 0 .4 0 .5 0 .6 0 .7 0 .8 0 .9 1 .0 1 .1 1 .2 1 .3 1 .4 1 .5 1 .6 1 .7 1 .8 1 .9

X : parts per Million : Proton

14.0 13.0 12.0 11.0 10.0 9.0 8.0 7.0 6.0 5.0 4.0 3.0 2.0 1.0 0 7 .7 2 8 7 .7 1 1 7 .0 8 5 7 .0 8 2 6 .9 1 8 6 .9 1 4 6 .8 6 9 6 .8 5 3 6 .6 2 8 6 .6 2 4 6 .6 1 0 6 .4 0 2 6 .3 9 7 4 .9 9 7 4 .9 7 3 4 .5 4 0 4 .5 1 7 2 .1 1 1 2 .1 0 6 2 .1 0 2 2 .0 6 7 2 .0 5 9 2 .0 5 5 2 .0 5 0 2 .0 4 5 2 .0 4 2 1 .4 1 1 1 .4 0 8 1 .4 0 5 1 .2 8 3 H2O ACETONE 1 .4 3 1 .3 8 1 .0 5 1 .0 3 1 .0 3 1 .0 0 1 .0 6 1 .0 5

50 menunjukkan karakteristik proton H-8 dan H-6 pada cincin A. Penjodohan didasarkan kepada pola kopling meta yang diberikan oleh masing-masing sinyal.

Pada cincin A, ketika suatu hidrogen menggantikan gugus hidroksil pada C-5 maka akan muncul puncak sinyal pada area sekitar 7,7 sampai 8,0 ppm (Mabry et al., 1964). Satu sinyal proton muncul pada geseran 7,72 ppm (1H, d, J = 8,5 Hz). Pola spektrum menunjukkan karakteristik penjodohan proton sistem AB diamati pada δH 6,62 (1H, dd, J = 8,5; 2 Hz) dan 7,72 (1H, d, J = 8,5 Hz) yang

mengindikasikan spesifik untuk proton pada H-6 dan H-5. Proton H-6 dan H-5 memiliki korelasi orto satu sama lain.

Pada cincin B, geseran muncul pada rentang sekitar 6,7 sampai 7,7 ppm (Mabry et al., 1964). Pada rentang 6,7 sampai 7,7 ppm muncul sebanyak 3 sinyal, yaitu pada δH 6,86 (1H, dd, J = 8 Hz; 2,5 Hz), 6,92 (1H, td, J = 8 Hz; 2 Hz), dan

7,07 (1H, d, J = 2,5 Hz). Karakteristik proton sistem ABX ditunjukkan pada pergeseran tersebut. Ketiga sinyal mengindikasikan sinyal proton untuk cincin B dengan masing-masing sinyal mewakili H-5’, H-6’, dan H-2’. Ketiga sinyal berkorelasi orto dan meta satu sama lain. Variasi geseran kimia proton pada cincin A dan cincin B didasarkan pada substituen yang terikat. Gambar 20 menunjukkan spektrum 1H-NMR pada rentang 6,0 sampai 8,0 ppm.

Cincin C flavonoid memiliki karakteristik spektrum berdasarkan jenis flavonoid isolat. Proton H-3 pada flavon memberikan sinyal tunggal tajam pada pergeseran sekitar δH 4,53 ppm. Pada proton H-2 isoflavon akan memberikan

puncak sinyal tunggal pada pergeseran sekitar δH 7,7 ppm. Sedangkan pada

dihidroflavonol, sinyal H-2 akan muncul pada pergeseran sekitar δH 4,9 ppm.

51 pergeseran sekitar δH 4,2 ppm (Mabry et al., 1964). Spektrum isolat 1 menunjukkan

pola flavonoid jenis dihidroflavonoid dimana muncul sinyal pada δH 4,98 (1H, d, J

= 12 Hz) sebagai H-2 dan δH 4,53 (1H, d, J = 11,5 Hz) sebagai H-3. Nilai pergeseran

kimia dan jenis hidrogen spektrum 1_{H-NMR selengkapnya ditampilkan dalam}

Tabel 6.

Gambar 20. Spektrum 1H-NMR Isolat 1 rentang 6,0 sampai 8,0 ppm

4.5.2 13_C-NMR

Penentuan karbon pada struktur isolat dilakukan melalui pengukuran 13 C-NMR dan DEPT 135o _{(Gambar 21). Pengukuran} 13_{C-NMR dilakukan untuk}

mengetahui jumlah dan jenis karbon yang dimiliki oleh struktur isolat. DEPT atau

distortionless enhancement by polarization transfer merupakan analisis yang

dilakukan dalam penelitian bahan alam untuk menentukan jenis karbon yang dimiliki pada struktur isolat. Analisis ini digunakan untuk menentukan jenis karbon metil, metilen, atau metin (Sampietro et al., 2009).

ab u n d an ce 0 0 .1 0 .2 0 .3 0 .4

X : parts per Million : Proton

8.0 7.9 7.8 7.7 7.6 7.5 7.4 7.3 7.2 7.1 7.0 6.9 6.8 6.7 6.6 6.5 6.4 6.3 6.2 6.1 7 .7 2 8 7 .7 1 1 7 .0 8 5 7 .0 8 2 6 .9 3 4 6 .9 3 1 6 .9 1 8 6 .9 1 4 6 .9 0 1 6 .8 9 8 6 .8 6 9 6 .8 6 4 6 .8 5 3 6 .8 4 8 6 .6 2 8 6 .6 2 4 6 .6 1 0 6 .6 0 7 6 .4 0 2 6 .3 9 7 9 .3 5 1 .4 0 1 .4 3 1 .3 8 1 .0 5 1 .0 3 1 .0 3 1 .0 0 1 .0 6 abundance 0 0.1 0.2 0.3

X : parts per Million : Proton

7.17.097.087.077.067.057.047.037.027.017.06.996.986.976.966.956.946.936.926.916.96.896.886.876.866.856.84 7.0 85 7.0 82 6.9 34 6.9 31 6.9 18 6.9 14 6.9 01 6.8 98 6.8 69 6.8 53 9.35 1.4 0 1.43 1.38 1.0 5 1.06 1.00 1.03 1.03

52

Gambar 21. Spektrum 13C-NMR isolat 1 (atas); Spektrum DEPT 135o NMR

isolat 1 (bawah)

Hasil analisis pada spektrum 13C-NMR menunjukkan bahwa isolat 1 memiliki 15 sinyal karbon. Hasil analisis DEPT 135o NMR menunjukkan 8 sinyal karbon metin (δC 74,02; 85,04; 103,06; 111,76; 115,76; 115,97; 120,87; 129,81 ppm) dan

terdapat 7 sinyal karbon kuarterner (δC 113,08; 130;06; 145,77; 146,57; 164,55;

165,84; 193,24 ppm) (Tabel 4). Pada spektrum 13C-NMR, muncul 12 sinyal pada rentang geseran kimia 103 ppm sampai 166 ppm yang merupakan daerah khas dari karbon aromatik. Kerangka dasar dihidroflavonol memiliki 15 karbon dengan 12 diantaranya merupakan karbon pada rentang daerah aromatik (Pavia et al., 2009).

Spektrum 13C-NMR menunjukkan sinyal pada pergeseran di bawah 100 ppm, yaitu pada δC 85,04 dan 74,02 ppm sebagai ciri khas karbon jenuh (saturated

carbon) sp3 yang berikatan dengan atom elektronegatif seperti oksigen (Pavia et al.,

2009). Sinyal karbon pada geseran 193,24 ppm merupakan ciri khas dari karbon karbonil yang memiliki rentang geseran diantara 185-220 ppm (Pavia et al., 2009). Sinyal pada geseran tersebut juga menguatkan posisi C-5 yang tersubstitusi proton dimana analisis spektrum 1_{H-NMR menunjukkan terdapat puncak spektrum khas}

untuk substitusi proton pada C-5. Pada struktural posisi C-5 yang tersubstitusi

(t h o u san d th s) 0 0 .1

X : parts per Million : Carbon13

220.0 210.0 200.0 190.0 180.0 170.0 160.0 150.0 140.0 130.0 120.0 110.0 100.0 90.0 80.0 70.0 60.0 50.0 40.0 30.0 20.0 10.0 0 -10.0 -20.0 2 0 6 .5 2 6 2 0 6 .3 7 2 2 0 6 .2 1 9 1 9 3 .2 4 1 1 6 5 .8 3 7 1 6 4 .5 5 1 1 4 6 .5 7 2 1 4 5 .7 6 6 1 3 0 .0 6 2 1 2 9 .8 1 3 1 2 0 .8 7 7 1 1 5 .9 6 2 1 1 5 .7 5 1 1 1 3 .0 8 2 1 1 1 .7 4 8 1 0 3 .6 3 7 8 5 .0 2 5 8 4 .5 4 5 7 4 .0 1 6 3 0 .7 3 5 3 0 .4 5 7 3 0 .3 6 1 3 0 .3 0 3 3 0 .2 0 7 3 0 .1 5 0 3 0 .0 5 4 2 9 .9 0 0 2 9 .7 4 6 2 9 .5 9 3 2 9 .4 3 9 2 9 .0 4 6 2 8 .8 9 2 2 8 .7 3 9 (t h o u san d th s) 0 0 .1 0 .2

X : parts per Million : Carbon13

220.0 210.0 200.0 190.0 180.0 170.0 160.0 150.0 140.0 130.0 120.0 110.0 100.0 90.0 80.0 70.0 60.0 50.0 40.0 30.0 20.0 10.0 0 -10.0 -20.0 1 2 9 .8 2 3 1 2 0 .8 8 6 1 1 5 .9 7 2 1 1 5 .9 2 4 1 1 5 .7 6 1 1 1 1 .7 5 8 1 0 3 .6 3 8 8 5 .0 3 5 8 4 .5 5 5 7 4 .0 1 6 3 0 .7 4 5 3 0 .4 7 6 3 0 .4 2 8 3 0 .3 2 3 3 0 .1 6 9 3 0 .0 1 6 2 9 .8 6 2

53 proton pada flavanon, C-4 mengabsorbsi pada sinyal antara 189,7 sampai 194,5 ppm (Agrawal, 1989). Analisis didukung dengan hasil spektrum DEPT 135o _yang

menunjukkan puncak pada 193,24 ppm merupakan karbon kuarterner.

Tabel 4. Nilai pergeseran dan jenis karbon hasil identifikasi NMR isolat 1

13_C-NMR δC (ppm) DEPT 135o δC (ppm) Jenis Karbon 74,02 74,02 Tersier 85,03 85,04 Tersier 103,64 103,06 Tersier 111,75 111,76 Tersier 113,08 - Kuarterner 115,75 115,76 Tersier 115,96 115,97 Tersier 120,88 120,87 Tersier 129,81 129,82 Tersier 130,06 - Kuarterner 145,77 - Kuarterner 146,57 - Kuarterner 164,55 - Kuarterner 165,84 - Kuarterner 193,24 - Kuarterner

Penentuan struktur melalui korelasi inti kemudian dilakukan terhadap isolat

1 menggunakan 2D-NMR. Korelasi 1_H-1_{H (homonuclear) ditentukan dengan}

menggunakan Correlated Spectroscopy (COSY) sedangkan korelasi 1H-13C

(heteronuclear) ditentukan dengan menggunakan Heteronuclear Multiple Quantum

Coherence (HMQC) dan Heteronuclear Multiple Bond Connectivity (HMBC).

COSY merupakan teknik yang umum digunakan dalam 2D-NMR untuk

identifikasi struktur senyawa organik. Kedua sumbu vertikal dan horizontal pada

spektrum menunjukkan geseran kimia proton. Puncak silang (cross peak) muncul

pada COSY sebagai akibat penjodohan spin-spin. Puncak silang ini selalu muncul

54

(a) (b)

Gambar 22. Spektrum 2D NMR COSY terpilih, Perbesaran 4,1 ppm sampai 5,9

ppm (a) dan 6,2 ppm sampai 7,9 ppm (b)

Spektrum 2D NMR COSY korelasi 1H-1H (Gambar 22) menunjukan terdapat

korelasi antara H-3 (δH 4,53 ppm) dengan H-2 (δH 5,00 ppm) dan H-5 (δH 7,72 ppm)

dengan H-6 (δH 6,62 ppm). Hal ini mengkonfirmasi bahwa struktur dasar isolat

merupakan flavonoid dengan 2 proton pada cincin A maupun cincin B

masing-masing diantaranya saling berkorelasi .

Isolat 1 selanjutnya diidentifikasi menggunakan 2D NMR HMQC. HMQC

merupakan salah satu tipe 2D NMR yang digunakan untuk penentuan struktur

senyawa bahan alam. HMQC digunakan untuk menentukan ikatan langsung

hidrogen dengan karbon (1_H-13_{C). Puncak silang pada spektrum HMQC hanya}

muncul ketika suatu hidrogen memiliki ikatan langsung dengan karbon (Keeler,

55

Gambar 23. Spektrum 2D NMR HMQC

Hasil analisis spektrum 2D NMR HMQC menunjukan terdapat 8 korelasi

sinyal proton dengan sinyal karbon. Korelasi menunjukkan adanya ikatan langsung

antara proton dengan karbon yaitu pada sinyal proton δH 4,53 (H-3); 5,00 (H-2);

6,40 (H-8); 6,62 (H-6); 6,86 (H-5’); 6,92 (H-6’); 7,07 (H-2’); 7,72 (H-5) ppm yang

masing-masing berkorelasi dengan karbon pada δC 74,02 (C-3); 85,03 (C-2); 103,64

(C-8); 111,75 (C-6); 115,75 (C-5’);120,88 (C-6’); 115,96 (C-2’); dan 129,81 (C-5)

ppm (Gambar 23).

56 Identifikasi isolat juga dilakukan menggunakan 2D NMR HMBC (Gambar

24). HMBC digunakan untuk membantu menentukan kerangka karbon melalui

ikatan jarak jauh hidrogen dengan karbon. Suatu proton dapat memiliki korelasi

jarak jauh dengan lebih dari 1 karbon. Ikatan jarak jauh yang dapat terdeteksi

menggunakan HMBC berkisar 3 ikatan (Keeler, 2010). Identifikasi spektrum

HMBC isolat 1 menunjukan bahwa terdapat beberapa korelasi antara proton dengan

karbon yang ditampilkan dalam Tabel 5.

Tabel 5. Korelasi COSY dan HMBC

No. C H ppm (multiplisitas, J Hz) C ppm HMBC (1_{H }13_{C) COSY} (1_{H }1_H) 2 4,98 (d, 12) 85,0 C-3, C-4, C-1’, C-5’, C-6’ H-3 3 4,53 (d, 11,5) 74,0 C-2 H-2 4 - 193,2 5 7,72 (d, 8,5) 123,8 C-4, C-7 H-6 6 6,62 (dd, 8,5; 2) 111,7 C-8, C-10 H-5 7 - 165,8 8 6,40 (d, 2,5) 103,6 C-6, C-9 9 - 164,5 - 10 - 113,1 - 1’ - 130,1 - 2’ 7,07 (d, 1,5) 115,9 C-2, C-3’, C-6’ 3’ - 146,5 4’ - 145,7 5’ 6,86 (dd, 8,0; 2,5) 115,7 C-1’, C-4’ 6’ 6,92 (dd, 8,0; 1,5) 120,8 C-2, C-2’, C-3’

Korelasi struktur dapat dilihat pada Gambar 25.