BAB 2
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Struktur dan Sifat DNA
Sejak percobaan yang dilakukan oleh Hershey-Chase pada tahun 1952 yang menujawab permasalahan tentang materi genetik, maka DNA telah dianggap sebagai material genetik pada semua organisme kecuali pada beberapa fage dan virus yang menggunakan RNA sebagai material genetiknya (Brown, 1989). Oleh karena itu DNA telah dianggap sebagai materi yang bertanggung jawab terhadap kelainan-kelainan yang terjadi yang berhubungan dengan penurunan sifat sel induk kepada sel anak.
DNA merupakan suatu makromolekul yang terdiri atas nukleotida (Brown, 1989). Antar nukleotida ini dihubungkan dengan ikatan fosfodiester membentuk rangkaian polinukleotida. Tiap nukleotida terdiri dari 3 komponen yaitu gula 2
deoksiribose, fosfat dan basa nitrogen (gambar I). Gula 2'-deoksiribose pada DNA mernbentuk struktur lingkar yang disebut struktur Haworth. Gabungan antara gula 2'deoksiribose dan basa DNA disebut nukleosida.
Basa nitrogen dari DNA terdiri dari timin, sitosin, adenin, dan guanm.
Timin dan sitosin memiliki cine in tunggal pirimidin, sedangkan adenin dan guanin memiliki cincin ganda purin. Basa purin terikat pada gula 2 'deoksiribose pada posisi N-2, sedangkan bas a pirimidin terikat pada posisi N-I (gambar 2).
H, ... H
7~~H
Nw·-c
'NJJ-
No baso
-O-P-O~---CH, II
I
"I
0-0 ,'C... 'C."
p!;\osphato 1 \ ' 1
HI" 't!H
3'r-9,'
OH H sug.r (dllloxyribosol nucleoside (deoxvadenosine) nucleotide (dcoxyadenoslno S'-phosphtlle)
Gambar I. Nukleotida penyusun DNA (Singer & Berg, 1991)
N's
,
'...3'" 51 ")-H_Nt e-4
H N N
o
-O-P-O-CH,II
-6
0OH de cxvadancslne
OH
o o
n II
-O-P-O-CH 2 I -O-P-O-CH,
-0 0
-6
0OH 'JH
deoxythymidine dooxygu01nO$ino dooxycytidino m'Joophosphato. dAMP monophos"hll.to. dTMP monophosphnlO. dGMI' r(\onopho~ph8Ia.dCMP
Gambar 2. Terikatnya basa purin dan pirimidin pada gula 2' -deoksiribose (Singer &
Berg, 1991)
Struktur DNA terbentuk dad 2 rantai polinukleotida terpilin yang disebut double helix.
Dalam double helix DNA, timin selalu berpasangan dengan adenin, sedangl.an sitosin selalu berpasangan dengan guanin dengan ikatan hidrogen membentuk suatu anak tangga yang berputar kekanan (B-DNA dan A-DNA) atau berputar kekiri (Z-DNA) (Singer &
Berg, 1991). Antara timin dan adenin terjadi 2 ikatau hidrogen, sedangkan antara sitosin dan guanin terdapat 3 ikatan hidrogen, sehingga jarak antara guanin-sitosin reJatif lebih pendek dibandingkan dengan jarak antara timin-adenin. Geometri dan jarak antara apsangan basa dalarn DNA dapat dilihat pada gambar 3. Disamping illl, ikatan antara sitosin-guanin lebih kuat daripada timin-adenin. Pasangan-pasangan basa ini disangga oleh penunjang (back bone) yang terdiri dari gabungan gula dan fosfat me..nbentuk heliks. Untuk mempertahankan strukturnya ini, DNA dilindungi oleh proten-protein yang disebut histon.
Gambar 3. Ikatan hidrogen dan geometri pasangan basa komplemen dalam DNA (Singer
& Berg, 1991).
Dad struktur tersebut, DNA memiliki tempat-tempat yang mudah mendapatkan serangan dari gugus elektrofil. Daerah yang paling mudah berinteraksi dengan gugus elektrofil adalah N-7 guanin, yang kemudian diikuti dengan N-3 dan N-7 adenin dari basa DNA (Sanna et al., 1975). Meskipun demikian masih banyak tempat-tempat interaksi antara DNA dan gugus elektrofil yang lain seperti yang telah disebutkan oleh Sa111la dan kawan-kawan (1975) yaitu:
1. Guanin : N-7, 0-6, N-3, 2-NH2 dan C-8.
2. Adenin : N-3, N-7, 6-NH2 dan N-1.
3. Sitosin : N-I, N-3, dan C-5.
4. Tirnin : 0-4 dan C-6
Pada tempat-tempat ini memungkinkan terjadinya serangan dari gugus alkil yang menyebabkan rusaknya susunan DNA. Meskipun pelekatan dengan gugus alkil lebih banyak pada posisi N'-guanin, namun pelekatan pada
d
-guanin rr.emberikan kemungkinan yang lebih besar untuk terjadinya mutasi (Lawley, 1976; Takahashi et al., 1988). Hal ini disebabkan karena perbaikan pada posisi 06- guanin tidak dapat dilakukan melalui hidrolisis biasa, namun harus melalui proses enzimatik (Lawley, 1976) dengan menggunakan enzim khusus yang disebut 06-alkil-guanin-DNA alkiltransferase (AGT) (Karan et al., 1979). Enzim ini akan mengikat secara langsung gugus metil yang terikat pada 0 6-guanin, membentuk ikatan kovalen dengan dirinya sendiri sehingga gugus metiJ dapat dihilangkan dari DNA, akan tetapi AGT tersebut menjadi inaktif karena tidak ada substrat kedua yang akan menerirna gugus metil (Pegg, 1990). Reaksi ini dikenal sebagai reaksi bunuh diri (suicide reaction) dari AGT (Demple & Karan, 1983).2.2. Tinjauan Tentang [H3IN-metil-N-nitrosourea
N-Metil-N-nitrosourea (MNU) adalah suatu senyawa pengalkil ialkylating agent) yang banyak digunakan untuk membunuh sel-sel kanker dan terrnasuk cell cycle
nonspecific (CCNS) artinya sifat anti kankemya tidak mempengaruhi secara langsung pada siklus sel, tetapi merusak DNA (mutasi) setelah terjadinya replikasi (Mulyadi, 1996). Akan tetapi, karena sifat MNU yang dapat menyebabkan mutasi, senyawa ini juga bersifat karsinogen (Minden & Pawson, 1992). Hal ini terutama disebabkan karena MNU merupakan mono/unction alkylating agent yang akan menyerang DNA pada posisi 0 6_ guanin sehingga pada replikasi berikutnya terjadi perubahan pasangan GC->AT. Pada gen H-ras kodon ke-12, mutasi ini akan menyebabkan perubahan asam amino yang dihasilkan, dari glisin berubah menjadi asparagin.
MNU pada pH 7,4 (fisiologis) mudah terurai menghasilkan metildiazohidroksida (Archer, 1992). Dengan melepaskan gugus hidroksidanya, maka senyawa ini menjadi ion diazonium yang sangat reaktif dan bersifat elektrotilik. MNU memiliki reaktifitas elektrofilik (electrphilic reactivity) yang tinggi sehingga mengarah pada reaksi SN I (Lawley, 1976)Adanya bagian-bagian yang kaya elektron pada ONA merupakan target yang paling banyak mendapat serangan seperti : Nl dan N7 adenin, 06, N3 dan N7 guanin, 04 timin dan N3 sitosin (Mulyadi, 1996). Serangan ion diazonium ini akan menyebabkan terbentuknya ikatan kovalen yang kuat pada DNA.
[HJ]MNU adalah MNU radioaktifkarena terjadi penggantian atom H pada gugus metil dengan atom tritium ([H3]). Namun demikian [HJ]MNU memiliki sifat kimia yang sarna dengan MNU, sedangkan sifat fisikanya terdapat beberapa perbedaan.
Sebagaimana senyawa radioaktif dari tritium, [H3]MNU memiliki waktu paruh yang lama
yaitu 12,26 tahun sehingga dapat digolongkan senyawa radioaktif yang dapat disimpan lama. Untuk menentukan jenis scintillation fluid yang akan digunakan, In3K<l perlu diketahui kelarutan MNLJ pada pelarut organik. MNU mudah larut dalam air, oleh karen a itu dipilih scintillation fluid untuk bahan yang bersifat hidrofil seperti misalnya campuran dioksan dan toluen.
2.3. Tinjauan Teutang Liquid Scintillation Counter
Suatu unsur yang memiliki inti tidak stabil akan memancarkan sinar-sinar radioaktif agar intinya menjadi stabil. Unsur yang memiliki nomor atom (Z) dibawah 20 akan berada dalam kondisi stabil j ika jumlah netron (N) di dalarn inti sarna dengan jumlah proton (Z), sehingga N/Z· = 1. Untuk nomor atom yang lebih besar, inti yang stabil didapati bila N/Z antara 1 - 1,6, sedangkan unsur yang bernornor atom lebih besar dari 83 tidak ada yang rnemiliki inti stabil, dengan kata lain bersifat radioaktif.
Untuk mendeteksi adanya unsur radioaktif ini dibutuhkan detektor, antara lain:
Pencacah Geiger, Kamar Kabut Wilson, Emulsi Film, dan detektor Sintilasi. Detektor Sintilasi ini lebih sensitif dari pada Pencacah Geiger terutama untuk pemancar ~- yang bertenaga rendah misalnya tritium dan C14 .
~- + U E = 18,6 KeV
6C' 4 -->7 N14 . + 1 ' I r +u E=156KeV
~- = sinar beta o = anti netrino
Aktifitas radioaktif senyawa tersebut biasanya dinyatakan dalarn satuan Currie (Ci), sedangkan satuan sistem 81 nya dinyatakan dalarn Baquerel (Bq).
1 Bq = I partikel per detik
I Ci = 3,7 x
io"
Bq = 2,22 X 1012 dpm (disintegrations per minute) Prinsip dari pengukuran aktifitas radioaktif dengan menggunakan Liquid Scintillation Counter adalah merubah pancaran sinarp-
dengan melewatkan pad" suatu medium organik tertentu (cocktail) sehingga akan dihasilkan suatu kelipan cahaya . Kelipan cahaya ini diterima oleh foto katode yang akan melepaskan elektron. Elektron yang dilepaskan akan masuk pada tabung pelipat ganda foton untuk kemudiar. dirubah menjadi sinyal listrik,Cocktail yang digunakan berfungsi merubah tenaga
p-
menjadi kelipan cahaya yang dapat diterima oleh foto katode. Cocktail berisi 3 komponen yaitu :I.Pelarut
2.Pengelip primer yaitu bahan yang dapat menimbulkan kelip.
3.Pengelip sekunder yaitu pengelip kedua yang memiliki panjang gelombang cocok dengan detektor foto katode.
Persyaratan yang diperlukan untuk pemilihan bahan cocktail adalah : l.Dapat melarutkan sampel dengan baik.
2.Dapat menangkap tenaga
p-.
3.Angka hasil kuantum pendamya tinggi, yaitu dapat merubah tenaga menjadi kelipan cahaya secara effisien.
4.Mempunyai kelipan cahaya dengan panjang gelombang yang dapat terdeteksi oleh tabung pelipat ganda foton (photo multiplier).
Data hasil pengukuran dapat dinyatakan dalam counter per menit (cpm) atau disintegrasi per rnenit (dprn). Untuk menghitung dpm rnaka terlebih dahulu harus diketahui efisiensi pengukuran (E).
E = cpm/dpm x 100 %
Harga dpm tetap, tidak tergantung pada media yang digunakan untuk melarutkan sampel, sedangkan harga cpm berubah-ubah tergantung besamya quenching (pemadaman) yang disebabkan oleh senyawa yang ada di dalam larutan maupun pelarutnya sendiri.
