58
III. METODOLOGI PENELITIAN
D. BAHAN DAN ALAT
Bahan utama yang digunakan adalah rendang iradiasi yang memiliki waktu penyinaran yang berbeda-beda (11 November 2006, DIPA 14 Juni 2007, dan no label 14 Juni 2007) yang berasal dari PATIR BATAN, dengan pembanding adalah rendang dengan perlakuan sterilisasi dengan autoklaf sebagai sampel kontrol. Bahan kimia yang dipakai untuk ekstraksi adalah akuades dan kertas saring Whatman no 1. Bahan yang digunakan dalam pengujian proliferasi limfosit dan hemolisis eritrosit yaitu darah manusia dari donor yang sehat. Bahan kimia yang dipakai adalah histopaque (Sigma, USA), RPMI-1640 (Sigma, USA), antibiotik gentamycin,
3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT) (Sigma, USA) dan HCl-isopropanol 0.04N, NaHCO3 anhidrous, EDTA 0,1%, akuabides, PBS (phosphate buffer saline), H2O2 0,5% dan larutan mitogen (LPS dan Pokeweed). Bahan yang digunakan dalam analisis kapasitas antioksidan adalah DPPH• (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazil), metanol, natrium asetat, asam asetat, dan asam askorbat. Bahan yang digunakan dalam pengukuran kadar malonaldehida, yaitu larutan standar 1,1,3,3 tetraetoksipropana (TEP) (Sigma, USA), larutan TBA 0.38 % - TCA 15 % - BHT 0.5 % dalam HCl 0.25 N dingin.
Alat yang digunakan dalam tahap persiapan sampel adalah pisau, mortar, neraca, kain saring, corong, syringe, gelas ukur, gelas piala, tabung sentrifugasi, alat sentrifugasi, tabung eppendorf, dan membran steril 0,20 µm. Alat yang digunakan dalam analisis proliferasi limfosit dan hemolisis eritrosit yaitu tabung vacutainer (berisi K3-EDTA 0,1%), jarum vacutainer, tourniquet, alat sentrifugasi, tabung sentrifugasi steril 15 ml (Corning Nunc), mikropipet Eppendorf 10-100 µl, dan 100-1000 µl, mikrotip,
microtube, syringe, mikroskop, hemasitometer Improved Neubauer (Weber Scientific), lempeng mikrokultur 96 sumur, laminar flow hood, microplate
59
reader, membran sterilisasi 0.20 µm, waterbath, dan inkubator VWR Scientific 370C dengan atmosfer 5% CO2, O2 95% dan RH 96%.Alat yang digunakan dalam analisis kapasitas antioksidan yaitu tabung reaksi, labu takar, gelas piala, pipet Mohr, mikropipet Eppendorf 100-1000 µl, vorteks, kuvet dan spektrofotometer. Alat yang digunakan dalam analisis kadar malonaldehida adalah tabung reaksi, mikropipet Eppendorf 100-1000 µl, labu takar, waterbath, sentrifuse, tabung sentrifuse, kuvet dan spektrofotometer.
E. WAKTU DAN TEMPAT PENELITIAN
Penelitian pengaruh ekstrak rendang iradiasi terhadap proliferasi limfosit dan hemolisis eritrosit, kapasitas antioksidan dan kadar malonaldehida rendang iradiasi dilakukan dari bulan Februari 2008 – April 2009. Penelitian dilaksanakan di laboratorium Biokimia Pangan, Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan, Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor.
F. METODE PENELITIAN
8. Ekstraksi
Rendang iradiasi/non-iradiasi yang masih berada dalam kemasan dibuka secara steril, ditimbang sebanyak 20 gram untuk pengujian pengaruh ekstrak terhadap proliferasi limfosit dan hemolisis eritrosit dan sebanyak 10 gram untuk pengukuran kadar malonaldehida. Rendang kemudian dimasukkan ke air steril dengan perbandingan berat rendang dan jumlah air steril yang digunakan adalah 1:1 (b/v). Kemudian dihancurkan dengan cara digerus sampai halus dengan mortar. Setelah halus, hancuran rendang disaring dengan kain saring dan dimasukkan ke tabung sentrifugasi, kemudian disentrifugasi selama 30 menit 3500 rpm.
60 Setelah disentrifugasi, bagian supernatan dalam tabung sentrifugasi dipisahkan dari minyak yang terdapat di bagian atas tabung sentrifugasi. Bagian supernatan ini kemudian disaring menggunakan kertas saring Whatman no. 1. Supernatan yang lolos kertas saring lalu disaring dengan membran sterilisasi 0,22 µm. Pada pengujian dengan limfosit dan eritrosit ekstrak yang digunakan adalah ekstrak steril, sementara untuk pengujian kapasitas antioksidan dan malonaldehida cukup ekstrak yang dapat lewat kertas saring.
Ekstrak rendang iradiasi/non-iradiasi langsung dilakukan pengenceran bertingkat dengan menambahkan akuades sehingga diperoleh ekstrak dengan tiga variasi konsentrasi yang selanjutnya segera digunakan dalam penelitian.
9. Persiapan Media Kultur Sel (Agustinisari et al., 1997)
Media yang dipergunakan untuk kultur sel adalah RPMI-1640 (telah mengandung L-glutamin). Bubuk RPMI sebanyak 10,42 gram dilarutkan dalam akuabides, sehingga diperoleh 1 liter larutan RPMI-1640. Kemudian ditambahkan 2 gram NaHCO3 sebagai buffer dan 1%
gentamycin sebagai antibiotik untuk mencegah kontaminasi. Campuran larutan tersebut kemudian disterilisasi dengan membran sterilisasi 0,20 µm.
10.Pengujian Ekstrak Rendang Iradiasi terhadap Proliferasi Limfosit Manusia
3.4 Isolasi limfosit darah tepi (Nurrahman et al., 1999)
Darah donor sebanyak 30 ml diambil secara aseptis di klinik Farfa, Dramaga, Bogor oleh seorang dokter. Darah kemudian dimasukkan ke dalam tabung vacutainer steril. Darah tersebut kemudian dipindahkan ke dalam tabung sentrifugasi, pemindahan darah ini dilakukan secara aseptis di dalam laminar hood untuk menjamin keaseptisan proses.
61 Pemisahan limfosit awal dilakukan dengan pemusingan (sentrifugasi) darah 1500 rpm selama 10 menit. Setelah itu, diambil lapisan buffycoat menggunakan mikropipet dan dilewatkan secara hati-hati di atas Histopaque melalui dinding tabung (buffycoat:Histopaque = 2:1).
Setelah itu, dilakukan kembali sentrifugasi 2500 rpm selama 30 menit dan diambil bagian cincin putih dan dicuci dengan penambahan 5 ml larutan media RPMI. Campuran ini kemudian disentrifugasi 1500 rpm selama 10 menit dan dicuci sebanyak dua kali, sehingga didapatkan sel limfosit. Suspensi sel limfosit kemudian dihitung menggunakan haemacytometer dengan pewarnaan biru tripan dan ditepatkan menjadi 2 x 106 sel/ml. Setelah itu ditambahkan serum darah AB sebanyak 10 %.
Rumus perhitungan jumlah sel limfosit menggunakan
haemacytometer yaitu:
Keterangan:
N = jumlah sel limfosit
A = jumlah sel hidup rata-rata per bidang pandang FP = faktor pengenceran
3.2 Serum darah AB (Nurrahman et al., 1999)
Darah dari donor bergolongan AB yang sehat diambil secara aseptis di klinik Farfa, Dramaga, Bogor oleh seorang dokter menggunakan vacutainer darah steril lalu dipindahkan ke dalam tabung sentrifus. Pemindahan darah ini dilakukan di dalam laminar hood untuk menjamin kesterilan proses. Darah tersebut kemudian disentrifugasi selama 30 menit pada 2500 rpm hingga terpisah menjadi tiga bagian. Bagian yang berada di atas yang berwarna kuning diambil menggunakan mikropipet dan bagian darah tidak boleh sampai terambil. Bagian yang sudah dipisahkan lalu
62 dipanaskan dalam waterbath bersuhu 56˚C selama 30 menit lalu disterilkan menggunakan membran steril 0,20 μm.
3.3 Pengujian aktivitas proliferasi limfosit manusia menggunakan spectrophotometer microplate reader (metode MTT), (Meiriana, 2006)
Pada masing-masing sumur ditambahkan sebanyak 20 l ekstrak dengan tiga taraf konsentrasi dan suspensi sel sebanyak 80
l (suspensi sel telah ditambahkan 10% serum terlebih dahulu). Sebagai kontrol negatif (tanpa penambahan sampel), ke dalam setiap sumur dimasukkan suspensi sel sebanyak 80 l dan 20 l RPMI. Untuk kontrol positif, tiap sumur dimasukkan 80 l suspensi sel dan 20 l mitogen (LPS atau Pokeweed). Kultur kemudian diinkubasi pada suhu 37oC (5% CO2, 95% O2) dan RH 96% selama 72 jam.
Enam jam sebelum masa inkubasi berakhir, kultur ditambahkan dengan 10 µl larutan MTT 0.5% yang dilarutkan dalam akuades. Setelah masa inkubasi berakhir, 100 µl HCl-isopropanol 0,04 N ditambahkan pada setiap sumur. Kemudian absorbansi masing-masing sumur diukur menggunakan
spectrophotometer microplate reader pada panjang gelombang 570 nm. Nilai absorbansi hasil pembacaan menggunakan
spectrophotometer microplate reader bersifat proporsional terhadap jumlah sel yang hidup. Indeks Stimulasi (I.S.) dihitung dengan menggunakan persamaan berikut:
I.S. = Absorbansi yang distimulasi dengan ekstrak Absorbansi pada kontrol negatif
Keterangan:
63 11. Pengujian Ekstrak Rendang Iradiasi terhadap hemolisis eritrosit
manusia
4.1 Isolasi eritrosit darah tepi manusia [Nike et al. (1988) dan Zhu et al. (2002)]
Eritrosit diisolasi dari darah perifer laki-laki dewasa sehat. Darah donor diambil sebanyak 7 ml secara aseptis oleh seorang suster di Klinik Farfa Darmaga. Darah kemudian dipindahkan ke dalam tabung vacutainer steril yang berisi antikoagulan agar darah tidak menggumpal. Darah itu kemudian dipindahkan ke dalam tabung sentrifugasi di dalam laminar hood secara aseptis untuk menghindari terjadinya kontaminasi mikroba baik dari udara, ruangan maupun pekerja dan untuk menjaga keaseptisan proses.
Pemisahan eritrosit awal dilakukan dengan sentrifugasi pada 2000 rpm selama 10 menit. Terlihat ada 3 lapisan di dalam tabung. Lapisan yang paling atas berwarna kuning adalah plasma darah, lapisan buffycoat yang terdiri dari leukosit dan platelet berada di tengah, dan di bagian bawah terdapat eritrosit yang menyusun hampir 45% dari total volume darah. Lapisan plasma yang ada di bagian atas dan buffycoat kemudian dibuang. Sebanyak 1 ml sel eritrosit dicuci dengan 5 ml larutan PBS lalu disentrifugasi dengan kecepatan 2000 rpm selama 10 menit. Eritrosit akan mengendap di dasar tabung dan larutan PBS akan berwarna kemerahan. Pencucian dilakukan sebanyak 3 kali hingga larutan PBS menjadi hampir tidak berwarna dan jernih.
Jumlah sel eritrosit dihitung menggunakan haemacytometer
dengan pewarna biru tripan. Sebanyak 100 μl suspensi eritrosit diambil, lalu ditambah dengan PBS sebanyak 1900 μl. Kemudian sebanyak 25 μl suspensi eritrosit yang telah ditambahkan PBS diambil, ditambahkan biru tripan sebanyak 25 μl, diaduk dengan mikropipet, kemudian sel dihitung menggunakan mikroskop pada perbesaran 400x. Kemudian dilakukan pengenceran sehingga
64 diperoleh konsentrasi sel 20x107 sel/ml. Jumlah sel eritrosit yang hidup harus di atas 95% agar dapat digunakan untuk uji.
Rumus perhitungan jumlah sel eritrosit menggunakan
haemacytometer yaitu:
Keterangan:
N = jumlah sel limfosit
A = jumlah sel hidup rata-rata per bidang pandang FP = faktor pengenceran
4.2 Pengujian pengaruh ekstrak terhadap hemolisis eritrosit manusia menggunakan spectrophotometer microplate reader [Nike et al. (1988) dan Zhu et al. (2002)]
Pada pengujian ini digunakan metode sentrifugasi berulang. Sel eritrosit stok dengan konsentrasi 20x107 sel/ml dan sampel disiapkan. Suspensi sel sebanyak 800 μl dimasukkan ke dalam tabung sentrifugasi, kemudian ditambahkan sampel sebanyak 200 μl. Tabung sentrifugasi yang berisi sel dan sampel tersebut kemudian didiamkan dalam inkubator bersuhu 370C selama 10 menit agar larutan dapat bercampur dengan baik. Inkubasi kemudian dilanjutkan di inkubator bersuhu 370C dengan 5% CO2 hingga waktu pengamatan.
Pengamatan dimulai dari jam ke-0. Tabung sentrifugasi kemudian diambil dan disentrifugasi dengan kecepatan 2000 rpm selama 5 menit untuk mengendapkan sel darah merah. Sebanyak 100 μl supernatan diambil dan diplating pada lempeng mikrokultur 96 sumur, lalu diukur absorbansinya menggunakan
spectrophotometer microplate reader pada panjang gelombang 450 nm. Setiap 1 jam dari jam ke-0 hingga jam ke 5, tabung sentrifugasi tersebut diambil dan diperlakukan seperti perlakuan tersebut diatas.
65 Persentase hemolisis dapat dihitung dengan rumus:
%Hemolisis =
Keterangan:
Abs sampel : absorbansi suspensi eritrosit+ ekstrak sampel Abs kontrol (-): Absorbansi suspensi eritrosit + PBS
12. Pengujian Kapasitas Antioksidan (Kubo et al., 2002)
Analisis kapasitas antioksidan dilakukan dengan menggunakan metode DPPH. Sebanyak 4 ml buffer asetat dicampur dengan 7,5 ml metanol dan 400 µl larutan DPPH. Campuran kemudian divorteks. Setelah itu ditambahkan 100 µl sampel atau larutan standar. Larutan kemudian divorteks dan didiamkan selama 20 menit di ruang gelap. Absorbansi diukur pada panjang gelombang 517 nm. Kontrol negatif yang digunakan adalah metanol, sedangkan kontrol positif yang digunakan adalah asam askorbat dengan konsentrasi 0, 50, 100, 250, 500 dan 1000 ppm. Kapasitas antioksidan diperoleh dengan menggunakan perhitungan sebagai berikut :
Kapasitas Antioksidan (%):
13. Pengukuran Kadar Malonaldehida (Seligman et al., 1977)
Sebanyak 2 ml ekstrak sampel dan kontrol yang akan diukur ditambahkan dengan 2 ml larutan HCl 0,25 N yang mengandung 15% TCA, 0,38% TBA dan 0,5% BHT. Campuran tersebut kemudian dipanaskan dalam waterbath suhu 80˚C selama 30 menit kemudian
didinginkan pada suhu ruang. Setelah dingin, sampel kemudian disentrifugasi pada 3000 rpm selama 15 menit. Bagian supernatan dari sampel diukur menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 532 nm. Hasil pengukuran sampel kemudian dibandingkan dengan
66 kurva standar TEP (1,1,3,3-tetraetoksipropana) yang memiliki variasi konsentrasi 0, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, dan 250 pmol/ml.
14. Analisis Statistik
Data-data yang diperoleh dari pengujian proliferasi limfosit, hemolisis eritrosit, pengukuran kapasitas antioksidan maupun pengukuran kadar malonaldehida pada berbagai sampel rendang iradiasi akan dibandingkan dengan data dari sampel rendang kontrol menggunakan pengujian statistik. Analisis statistik yang digunakan adalah ANOVA dengan nilai selang kepercayaan 95% yang diikuti dengan uji Tukey sehingga dapat disimpulkan apakah data rendang iradiasi berbeda nyata dengan rendang kontrol.
