B. Metode Isolasi Dan Identifikasi Bakteri 1. Pengertian Isolasi
Isolasi merupakan cara untuk mengambil mikroorganisme yang terdapat di alam dan menumbuhkannya dalam suatu medium buatan. Prinsip dari isolasi mikroba adalah memisahkan satu jenis mikroba dengan mikroba lainnya yang berasal dari campuran bermacam-macam mikroba. Hal ini dapat dilakukan dengan menumbuhkannya dalam media padat sel-sel mikroba akan membentuk suatu koloni sel yang tetap pada tempatnya (Sutedjo, 1996).
Terdapat berbagai cara mengisolasi mikroba, yaitu: a. Isolasi pada agar cawan
Prinsip pada metode isolasi pada agar cawan adalah mengencerkan mikroorganisme sehingga diperoleh individu spesies yang dapat dipisahkan dari organisme lainnya. Setiap koloni yang terpisah yang tampak pada cawan yang telah inkubasi berasal dari satu sel tunggal.
Terdapat beberapa cara dalam metode isolasi pada cawan agar, yaitu: metode gores kuadrat dan metode agar cawan tuang.
Metode gores kuadrat bila dilakukan dengan baik akan menghasilkan isolasi mikroorganisme dimana setiap koloni barasal dari satu sel.
Metode agar tuang berbeda dengan metode gores kuadrat, cawan tuang menggunakan medium agar yang dicairkan dan didinginkan 50ºC, yang kemudian dicawankan. Pengenceran tetap perlu dilakukan sehingga pada cawan yang terakhir mengandung koloni-koloni yang terpisah diatas permukaan atau didalam cawan.
b. Isolasi pada medium cair
Metode isolasi pada medium cair dilakukan bila mikroorganisme tidak dapat tumbuh pada agar cawan (medium padat), tetapi hanya dapat tumbuh pada kultur cair. Metode ini juga perlu dilakukan pengenceran dengan beberapa serial pengenceran. Semakin tinggi pengenceran peluang untuk mendapatkan satu sel semakin besar.
c. Isolasi sel tunggal
Metode isolasi sel tunggal dilakukan untuk mengisolasi sel mikroorganisme berukuran besar yang tidak dapat diisolasi dengan metode agar cawan atau medium cair. Sel mikroorganisme dilihat dengan menggunakan perbesaran sekitar 100x. Kemudian sel tersebut dipisahkan dengan menggunakan pipet kapiler yang sangat halus ataupun micromanipulator, yang dilakukan secara aseptis (Admin, 2008).
Adapun prinsip dari metode cawan ini adalah sel jasad renik yang masih hidup ditumbuhkan pada suatu medium agar, maka sel jasad renik akan berkembang biak dan membentuk koloni yang dapat dilihat langsung dan dihitung dengan mata tanpa menggunakan alat bantu seperti mikroskop dan sebagainya. Metode hitung cawan ini merupakan cara yang paling sensitif untuk menentukan jumlah jasad renik karena beberapa hal yaitu:
1. Hanya sel yang masih hidup yang dihitung 2. Beberapa jasad renik dapat dihitung sekaligus
3. Dapat digunakan untuk mengisolasi dan identifikasi jasad renik kerena koloni yang terbentuk mungkin berasal dari suatu jasad renik yang mempunyai penampakan yang spesifik (Muslim, 2011).
Berikut ini beberapa sifat-sifat koloni pada agar lempeng mengenai bentuk, permukaan dan tepi yaitu:
Bentuk koloni dilukiskan sebagai titik-titik, bulat, berbenang, tak teratur serupa akar dan serupa kumparan.
Permukaan koloni dapat datar, timbul mendatar, timbul melengkung, timbul mencembung, timbul membukit dan timbul berkawah.
Tepi koloni ada yang utuh, ada yang berombak, ada yang berbelah-belah, ada yang berigi, ada yang berbenang-benang dan ada yang keriting (Dwidjoseputro, 2005).
· Sedangkan menurut Nuniek isolasi mikroba dapat dilakukan dengan dua cara yaitu: a. Isolasi mikroba dengan cara penggoresan
Tujuan utama dari penggoresan ini adalah untuk menghasilkan koloni-koloni bakteri yang terpisah dengan baik dari suspensi sel yang pekat. Cara ini lebih menguntungkan bila ditinjau dari sudut ekonomi dan waktu, tapi memerlukan ketrampilan yang diperoleh dengan latihan. Penggoresan yang sempurna akan menghasilkan koloni yang terpisah. Ada beberapa teknik goresan, antara lain :
- Goresan T - Goresan kuadran - Goresan radian
- Goresan sinambung (Nuniek, 2001). b. Isolasi mikroba dengan cara penaburan
Cara penaburan (pour plate) merupakan cara yang kedua di samping penggoresan untuk memperoleh biakan murni dari biakan campuran mikroba. Cara ini berbeda dari cara penggoresan dimana media agar diinokulasi dalam keadaan tetap cair yaitu pada suhu 45ºC, dan demikian pula koloni-koloni akan berkembang di seluruh media, tidak hanya
pada permukaan. Untuk beberapa tujuan hal ini menguntungkan, contohnya dalam mempelajari pertumbuhan koloni streptococcal pada sel-sel darah merah. Supaya koloni yang tumbuh dalam cawan tidak terlalu banyak ataupun sedikit maka contoh diencerkan hingga beberapa kali pengenceran dan ditaburkan pada beberapa cawan (Nuniek, 2001). 2. Identifikasi Bakteri
Identifikasi bakteri meliputi pemeriksaan morfologi, pewarnaan gram, dan uji biokimia antara lain: uji oksidase, uji katalase, uji motilitas, produksi indol, uji TSIA, dan uji gula-gula. Identifikasi bakteri dilakukan dalam beberapa uji antara lain pengamatan morfologi koloni bakteri yang dilakukan setelah mendapatkan biakan murni. Pengamatan ini meliputi warna, bentuk, tepian koloni, ketinggian atau permukaan koloni dan struktur dalam koloni (Jimmo, 2008).
a. Pewarnaan gram bertujuan untuk menentukan apakah bakteri tersebut termasuk di dalam kelompok bakteri gram positif atau kelompok bakteri gram negatif. Cara kerja dari pewarnaan gram yaitu suspensikan bakteri dengan ose, kemudian letakkan pada objek glass dan difiksasi, tetesi dengan larutan gram A yang mengandung kristal violet, kemudian tetesi dengan larutan gram B yang mengandung lugol, tetesi dengan larutan gram C yang mengandung alkohol, dan yang terakhir tetesi dengan larutan gram D yang mengandung safranin.
b. Uji katalase bertujuan untuk mengetahui sifat bakteri dalam menghasilkan enzim katalase. Cara kerja dari uji katalase yaitu dengan menggunakan jarum ose, koloni bakteri secara aseptik diambil dan diletakan pada gelas objek yang bersih. Kemudian diteteskan hydrogen peroksida (H2O2) 3% pada koloni bakteri tersebut. Adanya gelembung-gelembung udara menunjukan tes tersebut positif.
c. Uji oksidase bertujuan untuk mengetahui ada tidaknya enzim oksidase pada bakteri dengan menggunakan paper oksidase yang dapat dilihat perubahan warna yang terjadi pada paper oksidase.
d. Uji motilitas dan uji indol bertujuan untuk mengetahui apakah bakteri tersebut motil atau tidak dan untuk mengetahui produksi indol dari Tryptophane. Uji ini menggunakan media MIO (Motility Indole Ornitin).
e. Uji TSIA (Triple Sugar Iron Agar) bertujuan untuk membedakan jenis bakteri berdasarkan kemampuan memecahkan dextrose, laktosa, sukrosa dan pembebasan sulfida, selain itu uji TSIA berfungsi untuk mengetahui apakah bakteri tersebut menghasilkan gas, H2S atau tidak. Media yang digunakan mempunyai dua bagian, yaitu slant (miring) dan butt (tusuk).
f. Uji gula bertujuan untuk membandingkan kemampuan bakteri dalam mendegradasi gula dan menghasilkan asam organik yang berasal dari tiap-tiap jenis gula, yaitu glukosa, sukrosa, maltosa, arabinosa, manitol dan inositol (Waluyo, 2010).
1. Identifikasi Pemeriksaan Pseudomonas aeruginosa
Untuk identifikasi bakteri Pseudomonas aeruginosa menggunakan media plate MC (mac conkey), media agar ini termasuk kedalam media selektif dan diferensial bagi mikroorganisme. Jenis mikroba tertentu akan membentuk koloni dengan ciri tertentu yang khas apabila ditumbuhkan pada media ini (Melnick, 2012).
Bakteri gram negatif yang tumbuh dapat dibedakan dalam kemampuannya memfermentasi laktosa. Koloni bakteri yang memfermentasi laktosa berwarna merah bata dan dapat dikelilingi oleh endapan garam empedu. Bakteri yang tidak memfermentasikan laktosa biasanya bersifat patogen (Jawetz, 2001).
Pada media MC (mac conkey) koloni Pseudomonas aeruginosa berbentuk sedang, jernih/keruh, smooth, kadang-kadang sedikit kehijauan, keping, tepinya tidak rata, dan tidak menguraikan laktosa.
Gambar 2.5 Bakteri Pseudomonas aeruginosa pada media MC (Bacteriainphotos, 2012)
Uji biokimia Pseudomonas aeruginosa pada media TSIA (Tripel Sugar Iron Agar) dilakukan secara aseptis diinokulasi biakan kuman dari media MC ke media TSIA, diambil 1 ose ditanam pada media TSIA dengan cara digoreskan pada lereng media dan ditusuk pada dasar media. Lalu di inkubasi selama 24 jam pada suhu 37ºC. Pada uji fermentasi gula-gula semua hasilnya negatif (Melnick, 2012).
1. Identifikasi Acinotobacter baumanni
Untuk identifikasi bakteri Acinotobacter baumanni menggunakan media selektif MC (mac conkey). Pada media MC (mac conkey) koloni Acinotobacter baumanni berbentuk kecil, tidak berwarna atau rose, smooth, keruh, dan bulat. Pada saat uji katalase hasilnya positif, tetapi pada uji indol dan mortility (pergerakan) hasilnya negatif (Melnick, 2012).
Gambar 2.8 Bakteri Acinotobacter baumanni pada media MC (Bacteriainphotos, 2012)
Klebsiella dapat tumbuh dengan baik pada media pembenihan seperti pada media MC (mac conkey) pada suhu 37ºC. Ciri-ciri pertumbuhan bakteri pada media MC yaitu memiliki koloni yang besar-besar, smooth, cembung, berwarna merah muda sampai merah bata, dan bersifat mukoid yakni pada saat koloni diambil dengan ose akan kelihatan molor seperti tali atau benang (Jawetz, 2001).
Uji biokimia dilakukan untuk melihat karakteristik bakteri melalui reaksi biokimia, yang biasa dilakukan diantaranya:
a. TSIA (Tripel Sugar Iron Agar)
Digunakan untuk identifikasi bakteri gram negatif batang, untuk melihat kemapuan meragi glukosa, sukrosa atau laktosa.
b. Gula-gula atau karbohidrat
Dilakukan untuk menetukan kemampuan bakteri untuk memfermentasikan beberapa jenis gula-gula seperti glukosa, laktosa, maltose, manitol dan sukrosa. c. SIM (sulfur, indol, motility)
Uji ini untuk mengetahui pergerakan bakteri, produksi indol dan pembentukkan gas H2S.
Gambar 2.10 Bakteri Klebsiella pneumonia pada media MC (Bacteriainphotos, 2012)
