ANALISIS KUANTITATIF MIKROORGANISME
FAKULTAS TEKNOLOGI INDUSTRI PERTANIAN
UNIVERSITAS PADJADJARAN
Firna Apriliani Shafira (240210140022)
Departemen Teknologi Industri Pangan Universitas Padjadjaran, Jatinangor
Jalan Raya Bandung-Sumedang Km. 21, Jatinangor, Sumedang 40600 Telp. (022) 7798844, 779570 Fax. (022) 7795780 Email: firnashaf@gmail.com
ABSTRACT
Quantitative analysis of microorganism for food is important thing to do for knowing the quality of the food, next processing for the food and approximating shelf life of the food. This quantitative analysis has some kind of methode such as MPN (Most Probable Number), Petroff Hausser, Plate Count etc. All of the tubes showing positive result in MPN method. In water (MPN), showing microorganism between 11000 / mL - 24000 / mL. Total microorganism of fresh milk that using Petroff hauser method is more than 1.85 x 106 / mL. For the plate count, microorganism that found in tofu and water is below 30 and between 30-300 colony.
Key words : plate count, petroff hauser, most probable number (MPN), microorganism
PENDAHULUAN
Analitis kuantitatif mikroorganisme pada bahan pangan dapat dilakukan dengan metode cawan, metode MPN (most probable number), hitungan mikroskopik langsung, dan metode turbidimetri (kekeruhan) dengan menggunakan spektofotometer. Analisis kuantitatif mikrobiologi pada bahan pangan penting dilakukan untuk mengetahui mutu bahan pangan dan proses yang akan diterapkan pada bahan pangan tersebut. (BPOM RI, 2008).
Penghitungan bakteri dapat dilakukan dengan hitungan mikroskopis langsung (direct microscopis count) dan metode hitungan tak langsung (indirect count) dengan hitungan cawan, baik dengan metode penyebaran maupun metode penuangan. Penghitungan bakteri secara langsung memiliki banyak kelemahan yaitu tidak dapat membedakan sel mati dan sel hidup, selain itu penghitungannya rumit karena sel bakteri sangat kecil dan berjumlah banyak sehingga semakin menyulitkan penghitungan. (Marta, G. 2009).
Praktikum kali ini, dilakukan
praktikum perhitungan jumlah bakteri
dengan metode Petroff Hauser, metode
agar cawan, dan metode MPN.
Prinsip dari perhitungan jumlah bakteri dengan metode Petroff Hauser adalah dengan menentukan jumlah sel rata-rata tiap petak (ruangan) yang telah diketahui volumenya dan alat tersebut dapat ditentukan jumlah sel mikrobia tiap cc nya (Jutono dkk, 1980).
Prinsip dari metode perhitungan mikroorganisme dengan metode agar cawan adalah jika sel jasad renik yang masih hidup ditumbuhkan pada medium agar, maka sel jasad renik tersebut akan berkembang biak dan membentuk koloni yang dapat dilihat langsung dan dihitung dengan mata tanpa menggunakan mikroskop. Dasar perhitungannya adalah dengan membuat suatu seri pengenceran sampai 10-5,
kemudian dari setiap pengenceran diinokulasikan ke medium agar cawan. Koloni yang tumbuh dihitung dengan menggunakan Colony Counter.
Standard Plate Counts (SPC) sebagai berikut (Fardiaz.1992) :
1. Cawan yang dipilih dan dihitung adalah yang mengandung jumlah koloni antara 30-300.
2. Beberapa koloni yang bergabung menjadi satu merupakan satu kumpulan koloni yang besar dimana jumlah koloninya diragukan dapat dihitung sebagai satu koloni.
3. Satu deretan rantai koloni yang terlihat suatu garis tebal dihitung sebagai satu koloni.
Metode MPN digunakan untuk menghitung jumlah mikroorganisme di dalam sampel yang berbentuk cair, jika sampel dalam bentuk padatan, maka harus dibuat suspensinya terlebih dahulu. Perhitungan dilakukan berdasarkan jumlah tabung yang positif. Tabung yang dinyatakan positif yaitu tabung yang ditumbuhi oleh jasad renik setelah inkubasi pada suhu dan waktu tertentu. Tabung dinyatakan positif jika larutan berubah warna menjadi keruh (kekeruhan) dan timbul gas di dalam tabung durham yang diletakkan pada posisi terbalik di dalam tabung reaksi. Metode ini berdasarkan atas pengenceran. Larutan yang mengandung sel-sel mikroorganisme diencerkan terus menerus, akhirnya akan diperoleh suatu larutan dimana tidak dijumpai sel lagi yaitu dikatakan steril (Buckle dkk, 1985).
Output metode MPN adalah nilai MPN. Nilai MPN adalah perkiraan jumlah unit tumbuh (growth unit) atau unit pembentuk koloni (colony forming unit) dalam sampel. Namun, pada umumnya nilai MPN juga diartikan sebagai perkiraan jumlah individu bakteri. Satuan yang digunakan, umumnya per 100 mL atau per gram. Metode MPN memiliki limit kepercayaan 95 persen sehingga pada setiap nilai MPN, terdapat jangkauan nilai MPN terendah dan nilai MPN tertinggi (Lim, 1998).
METODOLOGI
Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan pada praktikum ini adalah tahu, air keran gedung 4 pertanian, susu segar, NaCl-fis, alkohol,
media PCA (Plate Count Agar), media LBDS (Lactose Broth Double Strength), media LBSS (Lactose Broth Single Strength), akuades dan neutral red.
Alat yang digunakan pada
Pembuatan Media LBDS (Lactose Broth Double Strength) dan LBSS (Lactose Broth Single Strength)
Ditimbang LBDS dan LBSS masing – masing sebanyak 7,8 gram. LBDS dilarutkan kedalam 600 ml akuades sedangkan LBSS 300 ml akuades. Kemudian keduanya dipanaskan selama 5 menit dan didinginkan. Ditambahkan neutral red sampai larutan berwarna merah. Uji Penduga / MPN (Most Probable Number)
Dimasukan media LBSS kedalam 6 tabung reaksi (kecil) dan LBDS kedalam 3 tabung rekasi (besar), dimana masing – masing tabung sudah berisikan tabung durham secara terbalik. Lalu dimasukkan sampel sebanyak 0,1 ml ke dalam 3 tabung reaksi berisi LBSS , 1 ml ke dalam 3 tabung reaksi LBSS yang lain dan 10 ml sampel ke dalam 3 tabung reaksi berisi LBDS. Sampel diinkubasi selama 48 jam dengan suhu 37°C kemudian diamati. . Nilai MPN dapat dihitung sebagai berikut:
MPN contoh = Nilai MPN dari tabel x
1
pengencerantabung tengah
Perhitungan Jumlah Bakteri Petroff Hauser
Petroff-Hauser, celah yang ada harus semuanya terpenuhi oleh kultur bakteri. Bagian tengah Petroff-Hauser lalu ditutup dengan cover glass. Petroff-Hauser lalu diamati di bawah mikroskop.
Metode Cawan
Pada proses pertama para dilakukan pengenceran hingga 10-5 terlebih dahulu.
Larutan pengencer yang digunakan adalah NaCl fisiologis. Setelah pengenceran dimasukan 1 ml sampel ke dalam tabung rekasi yang pertama 10-1, kemudian dari
tabung reaksi yang pertama dimasukkan ke tabung rekasi yang kedua 10-2, begitu
selanjutnya sampai didapatkan 10-5 . Masing
- masing sampel dengan pengenceran 10-3 ,
10-4 , dan 10-5, dimasukkan ke dalam cawan
petri. Setelah itu ditambahkan media PCA (Plate Count Agar) ±15 ml. Kemudian goyangkan secara mendatar dengan membentuk angka delapan. Setelah itu di inkubasikan secara terbalik di dalam inkubator dengan suhu 35-37 °C selama 48 jam. Perhitungan pada metode cawan yaitu sebagai berikut.
Koloni per ml atau per gram = Jumlah koloni per cawan x Berdasarkan hasil pengamatan, semua
tabung menunjukkan hasil yang positif. Kelompok 4, 9 dan 10 didapatkan jumlah mikroorganisme sebanyak 24000/mL. Sedangkan kelompok 10 sebanyak 11000/mL. Bakteri yang mungkin terdapat pada sampel air ini yaitu bakteri Esherihia coli dan Entereobacter aerogenes. Berdasarkan SNI 7388-2009 jumlah maksimal cemaran mikroba pada air adalah APM koliform < 2/100 ml, ALT akhir (30º C 72 jam) 1 x 105 koloni//ml. Hasil ini
menunjukan bahwa data pengamatan telah sesuai dengan literatur.
Perubahan warna, kekeruhan dan pembentukan gas (gelembung udara) yang terjadi pada tabung durham merupakan indikator adanya mikroorganisme. Nilai MPN didapatkan dari kombinasi jumlah Perbedaan dari kedua karateristik ini adalah komposisi yang digunakan didalam melakukan pengenceran, bila pada SS digunakan sebanyak x gram per 1 L, maka untuk DS digunakan 2 kali lipat dari yang digunakan oleh SS. Sehingga konsentrasi pada media LB-DS lebih pekat dibandingkan media LB-SS.
Gelembung udara yang dihasilkan pada tabung durham disebabkan oleh adanya aktivitas dari mikroorganisme yang tumbuh pada tabung tersebut. Aktivitas yang dilakukan merupakan respirasi, sehingga dapat dilihat hasil dari respirasi mikroorganisme tersebut berupa gelembung gas.
Sedangkan kekeruhan yang terjadi hanya pada permukaannya saja disebabkan karena adanya mikroorganisme yang bersifat aerob, yaitu mikroorganisme yang dapat hidup dengan suplai oksigen.
Metode MPN memiliki keuntungan dan kekurangan. Salah satu dari keuntungan dari metode ini yaitu dapat dibuat sangat peka dengan penggunaan volume inokulum contoh yang lebih besar dari 1.0 ml/tabung. Sedangkan kekurangan dari metode ini yaitu dibutuhkan banyak pengulangan untuk diperoleh hasil yang teliti serta valid sehingga dibutuhkan banyak biaya dan waktu. Metode ini banyak digunakan untuk menghitung bakteri patogen dalam jumlah sedikit yang terdapat dalam bahan pangan. Perhitungan Jumlah Bakteri Petroff Hauser
Tabel 2. Tabel Hasil Pengamatan Metode Petroff Hauser
Ke l
Rata-Rata Koloni
Jumlah Bakteri
/ ml
Gambar
1 7,4 1,85 x
106
2 42,4 10,7 x 106
3 13.8 3.45 x 106
4 374,8 93,7 x 106
5 24,4 6,10 × 106
6 46,8 11,7 x 106
7 42,8 10,7 × 106
8 34,6 8,65 × 106
9 12,2 3,05 × 106
10 134,4 33,6 × 106
Sampel yang digunakan pada praktikum petroff hauser adalah susu segar. Berdasarkan hasil pengamatan, rata – rata mikrorganisme yang didapatkan pada susu yaitu ≥ 1,85 x 106/ml. Standar Nasional
Indonesia (SNI) Tahun 2000 telah menetapkan Batas Maksimun Cemaran Mikroba dalam susu segar dan susu pasteurisasi, untuk jumlah bakteri total pada susu segar 1 x 106 dan untuk susu
pasteurisasi < 3 x 104. Untuk koliform pada
susu segar 2 x 101 MPN/gram dan untuk
koliform pada susu pasteurisasi <0,1 x 101
MPN/gram.
Hasil pada praktikum melebihi batasan yang telah ditetapkan oleh SNI. Jumlah koloni yang terkandung dalam bahan pangan seharusnya tidak lebih dari standar. Hal ini dapat disebabkan oleh berbagai faktor baik pada saat pemanenan ataupun pada saat akan diolah, seperti: - Kehigienisan rendah
- Kontaminasi dari udara / lingkungan - Masa simpan yang terlalu lama
Petroff-Hauser. Ruang hitung dalam Petroff-Hauser terdiri dari 9 kotak besar dengan luas 1 mm². Satu kotak besar di tengah, dibagi menjadi 25 kotak sedang dengan panjang 0,2 mm. Satu kotak sedang dibagi lagi menjadi 16 kotak kecil. Dengan demikian satu kotak besar tersebut berisi 400 kotak kecil. Tebal dari ruang hitung ini adalah 0,1 mm. Sel bakteri yang tersuspensi akan memenuhi volume ruang hitung tersebut sehingga jumlah bakteri per satuan volume dapat diketahui. Bakteri di amati dan di hitung pada lima titik yang berbeda, yakni pada titik di setiap ujung (kanan, kiri, atas dan bawah) dan titik di bangian tengah-tengah. Enterobacteriaceae (E. coli) dan Staphylococcus (Volk dan Wheeler, 1993).
Keuntungan metode Petroff Hauser adalah cepat mendapatkan hasil dari penelitian yang dilakukan. Kerugian metode Petroff Hauser, yaitu sel mati tidak dapat dibedakan dengan sel hidup, sel-sel mikroorganisme berukuran sangat kecil sukar dilihat di bawah mikroskop sehingga tidak terhitung dan jumlah sel dalam
1 16 koloni 5 koloni 5 koloni 1,6x 104
2 2 koloni 1 koloni 0 koloni 2,0x 103
3 4 koloni 2 koloni 0 koloni 4,0x 103
6 251 koloni
bakteri 233 kolonibakteri 13 kolonibakteri 2,5x105
7 1 koloni
Sampel yang digunakan adalah tahu (kelompok 1 & 6) dan air (kelompok 2, 3, 7 dan 8). Berdasarkan hasil pengamatan, didapatkan mikroorganisme dengan rata-rata di bawah 30 koloni, tetapi pada kelompok 6 didapati mikroorganisme dengan rentang 30-300 koloni. Jumlah mikroorganisme tertinggi ada pada sampel tahu yaitu dengan nilai SPC 2,5 x 105.
Sedangkan nilai terendah ada pada sampel air yaitu 0.
Hasil praktikum sampel air dengan literatur yang ada sudah sesuai, yaitu jumlah mikroorganisme dari praktikum berada dibawah standar yang telah ditetapkan. Namun pada sampel tahu terdapat perbedaaan hasil dengan literatur.
Menurut Dwidjoseputro (1989), air tanah mangandung zat-zat anorganik maupun zat-zat organik yang merupakan tempat yang baik bagi pertumbuhan dan perkembangan mikroorganisme (kehidupan mikroorganisme). Mikroorganisme yang autotrof merupakan penghuni pertama dalam air yang mangandung zat-zat anorganik. Sel-sel yang mati merupakan bahan organik yang memungkinkan kehidupan mikroorganisme yang heterotrof. Temperatur juga ikut menentukan populasi mikroorganisme di dalam air. Pada temperature sekitar 30oC merupakan
temperatur yang baik bagi kehidupan bakteri pathogen yang berasal dari hewan maupun manusia. Eschericia coli, Enterrobacter aerogenes, dan Citrobacter fruendii.
Metode hitungan cawan merupakan cara yang paling sensitif untuk menentukan jumlah jasad renik karena beberapa hal, mempunyai kelemahan-kelemahan sebagai berikut: (Fardiaz,1992)
1. Hasil perhitungan tidak menunjukan jumlah sel yang sebenarnya, karena
beberapa sel yang berdekatan mungkin membentuk satu koloni.
2. Medium dan kondisi inkubasi yang berbeda mungkin menghasilkan nilai yang berbeda. pada bahan pangan dapat dilakukan dengan metode cawan, metode MPN (most probable number) dan perhitungan dengan petroff hauser.
Berdasarkan hasil pengamatan metode MPN (air keran), semua tabung menunjukkan hasil yang positif. Kelompok 4, 9 dan 10 didapatkan jumlah mikroorganisme sebanyak 24000/mL. Sedangkan kelompok 10 sebanyak 11000/mL. Hasil ini sudah sesuai dengan literatur.
Rata – rata mikroorganisme yang didapatkan pada sampel susu segar dengan metode penggunaan petroff hauser yaitu ≥ 1,85 x 106/ml. Hasil ini melebihi batasan
yang telah ditetapkan oleh SNI.
Mikroorganisme yang dihasilkan pada metode cawan dengan sampel air dan tahu rata – rata berkisar di bawah 30 koloni, tetapi pada kelompok 6 (tahu) didapati mikroorganisme dengan rentang 30-300 koloni. Hasil praktikum sampel air sudah sesuai, sedangkan pada sampel tahu terdapat perbedaaan hasil dengan literatur.
DAFTAR PUSTAKA
Badan Standardisasi Nasional. Susu. 1998. SNI 01-3141-1998 . Jakarta
Badan Standardisasi Nasional. Tahu. 1998. SNI 01 3142 - 1998. Jakarta
Buckle, K. A. et al., 1985. Ilmu Pangan,.Penerjemah Hari Purnomo, Adiono,
UI Press, Jakarta.
Dwidjoseputro, D., 1989. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Malang : Djambatan. Fardiaz, S. 1992. Mikrobiologi Pangan 1.
PT Gramedia. Jakarta.
Jutono, J., Soedarsono, S., Hartadi, S., Kabirun, S., Suhadi, D., Soesanto. 1980. Pedoman Praktikum Mikrobiologi Umum. Departemen Mikrobiologi Fakultas Pertanian UGM. Yogyakarta.
Lim D. 1998. Microbiology. Ed ke-2. New York: McGraw-Hill.
Marta, G. 2009. Perhitungan Bakteri dengan Metode Cawan. Available
online at :
http://gyamarta21.wordpress.com/ta g/perhitungan-bakteri/ (diakses pada tanggal 26 Mei 2016)
Sukarminah, E., D. Sumanti, dan I. Hanidah. 2010. Mikrobiologi Pangan. Universitas Padjadjaran. Jatinangor
