uji MPN sesuai SNI.pdf

Mikrobiologi Praktik

SITUS PEMBELAJARAN PERHITUNGAN MIKROORGANISME

Most Probable Number (MPN) / Angka Paling Mungkin (APM)

January 26, 2014 Posted by indra pradhika 1. Sejarah perkembangan MPN 2. Prinsip metode MPN 3. Cara kerja metode MPN 3.1. Uji pendugaan 3.2. Uji penegasan untuk Coliform 3.3. Uji penegasan untuk Fecal Coliform 3.4. Uji pelengkap untuk E.coli 4. Pemilihan jumlah seri tabung MPN 5. Peluang dalam metode MPN 6. Persyaratan pemilihan kombinasi tabung positif dan pelaporannya 7. Batas­batas perhitungan nilai MPN 8. Menghitung MPN tanpa tabel 9. Aplikasi lain MPN dalam perhitungan bakteri 10. Perhitungan MPN secara otomatis 11. Hubungan MPN dan CFU 11.1. Perbandingan antara MPN dan CFU 11.2. Perbedaan antara MPN dan CFU 11.3. Pengkonversian satuan MPN ke CFU 12. Kesalahan umum MPN 12.1. Kombinasi seri tabung diluar tabel 12.2. Tabung negatif palsu dan positif palsu 13. Tabel MPN Referensi Bab ini membahas secara dalam bagaimana metode MPN/APM tersebut bekerja sehingga dapat menghitung mikroorganisme dari data positif atau negatif  tanpa  menghitung  koloni  yang  tumbuh.  Metode  Angka  Paling  Mungkin  (APM)  disebut  sebagai  metode  Most  Probable  Number  (MPN) dalam penamaan selanjutnya tanpa mengabaikan kaidah penyerapan dalam bahasa Indonesia.

1. Sejarah perkembangan MPN

Metode  MPN  muncul  sekitar  awal  abad  20  sehingga  dikenal  sudah  sangat  lama  di  dalam  ilmu  mikrobiologi.  Estimasi  akurat  dari  tabel  MPN  di publikasikan  oleh  Mc  Crady  pada  tahun  1915  kemudian  dasar  statistik  dari  metode  MPN  dikemukakan  oleh  Halvorson  dan  Ziegler  (1933), Eisenhart dan Wilson (1943) dan Cochran (1950). Pada tahun 1957 Woodward menyarankan tentang pengabaian hasil positif (banyak tabung positif pada pengenceran tinggi dan sebaliknya) yang dapat meningkatkan kesalahan laboratorium dalam tabel MPN. Kemudian De Mann pada tahun 1983 mempublikasikan tentang metode perhitungan tingkat kepercayaan (convidence interval) dalam tabel MPN. Sampai sekarang metode MPN telah menjadi salah satu metode standard untuk menghitung jenis Coliform, Fecal Coliform, Escherichia coli, dan S. aureus. 2. Prinsip metode MPN MPN adalah suatu metode perhitungan mikroorganisme berdasarkan data kualitatif hasil pertumbuhan mikroorganisme pada medium cair spesifik dalam  seri  tabung  untuk  memperoleh  kisaran  data  kuantitatif  jumlah  mikroorganisme  tersebut  (MPN/ml  (g)).  MPN  merupakan  suatu  metode  uji pengenceran  bertingkat  (serial  dilution)  untuk  mengukur  konsentrasi  mikroorganisme  target  dengan  perkiraan.  SNI  01­2332.1  (2006:7) mendeskripsikan  MPN  sebagai  metode  untuk  menghitung  jumlah  mikroba  dengan  menggunakan  medium  cair  pada  tabung  reaksi  yang  pada umumnya setiap pengenceran menggunakan 3 atau 5 seri tabung dan perhitungan yang dilakukan merupakan tahap pendekatan secara statistik. Prinsip utama metode ini adalah mengencerkan sampel sampai tingkat tertentu sehingga didapatkan konsentrasi mikroorganisme yang pas/sesuai

dan  jika  ditanam  dalam  tabung  menghasilkaan  frekensi  pertumbuhan  tabung  positif  “kadang­kadang  tetapi  tidak  selalu”.  Semakin  besar  jumlah sampel yang dimasukkan (semakin rendah pengenceran yang dilakukan) maka semakin “sering” tabung positif yang muncul. Semakin kecil jumlah sampel yang dimasukkan (semakin tinggi pengenceran yang dilakukan) maka semakin “jarang” tabung positif yang muncul. Semua tabung positif yang  dihasilkan  sangat  tergantung  dengan  probabilitas  sel  yang  terambil  oleh  pipet  saat  memasukkannya  ke  dalam  media.  Oleh  karena  itu, homogenisasi sangat mempengaruhi metode ini. Kombinasi kemunculan positif (ya) atau negatif (tidak) ini menggambarkan perkiraan konsentrasi mikroorganisme pada sampel sebelum diencerkan. Perubahan dari data positif atau negatif sampai menghasilkan angka dilakukan dengan proses perhitungan statistik. Jadi nilai MPN adalah suatu angka yang menggambarkan jumlah mikroorganisme yang memiliki kemungkinan paling tinggi. Gambar 1. Kombinasi tabung positif yang didapat adalah 3 tabung positif dari pengenceran 1/10, 2 tabung positif dari pengenceran 1/100 dan 1 tabung positif dari pengenceran 1/1000. Angka MPN yang dihasilkan setelah dicocokkan dengan tabel adalah 150 MPN/g. Asumsi yang diterapkan dalam metode MPN adalah : ­ Bakteri terdistribusi sempurna dalam homogenat sampel. ­ Sel bakteri terpisah­pisah secara individual, tidak dalam bentuk rantai atau kumpulan (bakteri Coliform termasuk E. coli terpisah sempurna tiap selnya dan tidak membentuk rantai). ­ Media yang dipilih telah sesuai untuk pertumbuhan bakteri target dalam suhu dan waktu inkubasi tertentu sehingga minimal satu sel hidup mampu menghasilkan tabung positif selama masa inkubasi pada media tersebut. ­ Jumlah yang didapatkan menggambarkan bakteri yang hidup (viable) saja. Sel yang terluka dan tidak mampu menghasilkan tabung positif tidak akan terdeteksi. ­ Setiap individu tabung memiliki data yang berdiri sendiri (independen). Metode MPN dinilai berdasarkan perkiraan unit tumbuh (Growth Unit / GU) seperti CFU, bukan dari sel individu. Meskipun begitu baik nilai CFU atau MPN dapat menggambarkan seberapa banyak sel individu yang tersebar dalam sampel. FDA BAM appendix 2 (2001) menyatakan bahwa jika dalam MPN menggunakan target mikroorganisme yang dalam preparasi sampel dan pengencerannya tetap menunjukkan sel yang tidak terpisah dan berkelompok,  maka  nilai  MPN  sebaiknya  dapat  dinyatakan  dalam  perkiraan  GU  (Growth  Units)  atau  CFU  (Colony  Forming  Units).  Namun sebagian besar metode MPN digunakan untuk menghitung mikroorganisme target yang benar­benar terpisah individunya seperti Coliform dan E.

coli.

Pemilihan media sangat berpengaruh terhadap metode MPN yang dilakukan. Umumnya media yang digunakan mengandung bahan nutrisi khusus untuk pertumbuhan bakteri tertentu. Misalnya dalam mendeteksi kelompok Coliform dapat menggunakan media Brilliant Green Lactose 2% Bile (BGLB)  broth.  Di  dalam  media  ini  mengandung  lactose  dan  garam  empedu  (bile  salt)  yang  hanya  mengizinkan  untuk  tumbuh.  Jika  terdapat ketidaksesuaian jenis media dan bakteri yang diinginkan maka metode ini akan menghitung bukan bakteri yang dituju. Untuk menghitung Coliform pada tahap pendugaan umumnya menggunakan Lauryl Sulphate Tryptose (LST) broth, sedangkan untuk menghitung E.coli pada tahap konfirmasi diperlukan media EC (Escherichia coli) broth.

USDA/FSIS  (2008:1)  menyebutkan  bahwa  nilai  MPN  sangat  berguna  untuk  menentukan  jumlah  mikroorganisme  dengan  konsentrasi  rendah (<100/g). Metode ini umumnya dipakai untuk menganalisa susu, pangan, air atau tanah yang dimana pada jenis sampel ini terdapat kemungkinan bahan partikulat sampel mampu mengganggu pertumbuhan koloni pada agar.

Beberapa  kelebihan  metode  MPN  yang  diambil  berdasarkan  Oblinger  dan  Korburger  (1975:541)  adalah  (1)  Akurasi  dapat  ditingkatkan  dengan memperbanyak  tabung  yang  digunakan  setiap  pengencerannya.  (2)  Ukuran  (volume)  sampel  yang  cukup  besar  (dibanding  plate  count).  (3) Sensitivitas umumnya cenderung lebih baik pada konsentrasi mikroorganisme yang sedikit daripada plate count. (4) Recovery umumnya lebih baik karena menggunakan media cair, tetapi tetap tergantung partikel sampel yang mungkin dapat mengganggu. (5) Jika medium spesifik yang sesuai dengan pertumbuhan bakteri target dapat dibuat maka perkiraan perhitungan MPN dapat dilakukan berdasarkan medium tersebut.

3. Cara kerja metode MPN

MPN umumnya dilakukan tidak hanya sampai menghasilkan tabung­tabung positif saja, melainkan dilanjutkan dengan berbagai macam uji untuk mengkonfirmasi  tabung  positif.  Prosedur  konfirmasi  tersebut  bertujuan  untuk  meyakinkan  bahwa  data  positif  tersebut  memang  ditimbulkan  oleh mikroorganisme  target.  Meskipun  media  awal  yang  dipakai  di  dalam  tabung  sudah  berfungsi  sebagai  media  selektif.  Terdapat  tiga  tahap  dalam prosedur lengkap metode MPN yaitu uji penduga (presumptive test), uji penegasan (confirmed test) dan uji pelengkap (completed test). Uji penduga dilakukan untuk memperoleh kombinasi tabung positif awal, kemudian uji penegasan digunakan untuk memastikannya. Nilai akhir yang diambil adalah dari hasil uji penegasan dan pelengkap sehingga dimungkinkan mengubah kombinasi tabung yang diperoleh pada uji penduga. Umumnya hanya uji E.coli saja yang sampai tahap uji pelengkap. Uji E.coli yang sesuai standar harus dilakukan sampai tahap akhir yang memerlukan waktu berhari­hari. Jika analisa tidak dilakukan sampai akhir maka belum dapat dinyatakan pasti bahwa tabung positif tersebut mengandung E. coli. Berikut  adalah  Metode  MPN  Coliform,  Fecal Coliform  dan  E.  coli  untuk  analisa  sampel  pangan  yang  diinterpretasikan  berdasarkan  FDA  BAM Ch.4 (2002).

3.1. Uji penduga

§ Larutkan dengan akuades sampai 1L, stok pelarut simpan dalam refrigerator. Larutkan 1,25 ml dari stok pelarut ke dalam 1L H₂O lalu sterilisasi menggunakan autoklaf.

§ Cairkan sampel beku pada suhu 2­5°C selama ≤18 jam atau suhu 45°C selama 15 menit pada waterbath dengan agitasi. Timbang secara aseptis sebanyak 50g.

§ Masukkan sampel ke dalam kontainer blender yang telah disterilisasi. Tambahkan 450 ml butterfield phosphate  diluent  (dihitung  pengenceran pertama ; 50:450 atau 1:9). Kemudian hancurkan selama 2 menit. Volume total yang terdapat pada wadah blender harus menutupi pisau blender. Jika sampel tersedia kurang dari 50g (x) maka pengenceran pertamanya adalah x.9 ml. § Ambil 1 ml homogenat sampel (pengenceran 1/10) dari preparasi sampel lalu masukkan ke 9 ml diluent (pengenceran 1/100). Ambil 1 ml dari tabung pengenceran 1/100 untuk dimasukkan ke 9 ml diluent (pengenceran 1/1000). Pada setiap transfer sampel yang dilakukan, tabung dikocok berayun 25 kali dengan ketinggian ayunan pengocokan 30 cm atau vorteks selama 7 detik. § Siapkan 3 seri tabung MPN berisi masing­masing 10 ml Lauryl Sulphate Tryptose (LST) broth dengan tabung durham didalamnya (total 9 tabung yang dibagi menjadi 3 seri). § Masukkan 1 ml dari pengenceran 1/10 ke 3 tabung pertama, masukkan 1 ml dari pengenceran 1/100 ke 3 tabung kedua, dan masukkan 1 ml dari pengenceran 1/1000 ke 3 tabung ketiga. § Inkubasi semua tabung pada suhu 35±0,5 oC selama 24±2 jam. Amati terbentuknya gas pada tabung durham lalu catat hasilnya. Inkubasi lagi menjadi 48±3 jam tabung yang tidak terbentuk gas. § Interpretasi hasil positif jika media keruh dan terbentuk gas (harus kedua­duanya) pada inkubasi 24±2 jam atau 48±3 jam. Interpretasi hasil negatif jika  tidak  terdapat  pertumbuhan  dan  tidak  terbentuk  gas.  Gas  yang  diproduksi  dapat  terjebak  dalam  tabung  durham  ataupun  berbentuk  buih (effervescence) yang timbul saat dikocok. § Perkiraan konsentrasi berdasarkan tabel yang didapat adalah nilai dugaan adanya Coliform, Fecal Coliform atau E.coli. 3.2. Uji penegasan untuk Coliform § Siapkan tabung berisi 10 ml Brilliant Green Lactose Bile (BGLB) broth dengan tabung durham didalamnya. § Masukkan satu ulasan inokulum dari tiap tabung LST broth yang menghasilkan uji positif ke dalam tiap tabung BGLB broth. § Inkubasi semua tabung pada suhu 35±0,5 oC selama 48±3 jam. § Interpretasi hasil positif jika media keruh dan terbentuk gas (harus kedua­duanya). Interpretasi hasil negatif jika tidak terdapat pertumbuhan dan tidak terbentuk gas. § Tentukan jumlah Coliform (MPN/g atau ml) dengan menghitung tabung positif kemudian cocokkan dengan tabel MPN (tabel 10) berdasarkan dari perhitungan uji dugaan. Perkiraan konsentrasi berdasarkan tabel yang didapat adalah nilai penegasan adanya Coliform. 3.3. Uji penegasan untuk Fecal Coliform dan E.coli § Siapkan berisi masing­masing 10 ml EC broth dengan tabung durham didalamnya § Masukkan satu ulasan inokulum dari tiap tabung LST broth yang menghasilkan uji positif ke dalam tiap tabung EC broth.

§  Inkubasi  semua  tabung  pada  suhu  45,5 oC  (Fecal  Coliform  untuk  pangan  dilakukan  pada  45,5±0,2 oC,  uji  air,  kerang­kerangan  44,5±0,2 oC)

selama 24±2 jam. Amati terbentuknya gas pada tabung durham lalu catat hasilnya. Inkubasi lagi menjadi 48±2 jam tabung yang tidak terbentuk gas. § Interpretasi hasil positif jika media keruh dan terbentuk gas (harus kedua­duanya). Interpretasi hasil negatif jika tidak terdapat pertumbuhan dan tidak terbentuk gas.

§  Tentukan  jumlah  Fecal  Coliform  (MPN/g  atau  ml)  dengan  menghitung  tabung  positif  kemudian  cocokkan  dengan  tabel  MPN  (tabel  10) berdasarkan dari perhitungan uji dugaan. Perkiraan konsentrasi yang didapat berdasarkan tabel adalah nilai penegasan adanya Fecal Coliform dan E. coli. Untuk mengetahui apakah pada tabung EC broth adalah Fecal Coliform atau E. coli maka dilanjutkan uji penegasan untuk E. coli. 3.4. Uji pelengkap untuk E.coli § Tabung positif yang mengandung gas dari EC broth dikocok kemudian inokulasikan ke dalam cawan L­EMB agar dan inkubasi pada 35±0,5 oC selama 18­24 jam. § Interpretasikan sebagai dugaan E.coli jika memiliki ciri­ciri koloni datar, berwarna hitam di tengah koloni dengan atau tanpa warna kilat logam

(metallic  sheen).  Inokulasikan  sampai  5  koloni  tersangka  ke  PCA  dan  inkubasi  pada  35±0,5 oC  selama  18­24  jam  untuk  kultur  uji  penegasan

selanjutnya. § Satu dari lima koloni yang teridentifikasi positif E. coli cukup untuk menyatakan bahwa tabung EC broth tersebut terkonfirmasi positif E. coli. § Uji kultur dugaan dengan uji pewarnaan gram dan morfologi sel. Semua kultur yang mencirikan gram negatif dan sel berbentuk batang pendek selanjutnya diuji dengan tahap selanjutnya. Inokulasikan kembali kultur dugaan tersebut ke media LST lalu inkubasi pada 35±0,5 oC selama 48±2 jam untuk mengkonfirmasi ulang terbentuknya gas. Kemudian kultur sangkaan yang sama dilakukan uji IMViC. § Uji IMViC (uji produksi indole, uji Methyl Red, uji Voges­Proskauer, uji penggunaan Citrate). o Uji produksi indole; uji ini akan membedakan bakteri yang mampu atau tidak mampu memproduksi indole dari Tryptone.

terbentuk  cincin  merah  pada  bagian  atas  tabung  maka  bakteri  dapat  memproduksi  indol  (indol  positif)  dan  bila  terbentuk  cincin  kuning  maka disimpulkan sebagai indol negatif. Jika kultur dugaan adalah E. coli maka seharusnya menunjukkan hasil positif dan sel berbentuk batang pendek. o Uji Voges­Proskauer; uji ini dapat membedakan bakteri yang mampu memproduksi acetylmethyl­carbinol atau tidak. Senyawa tersebut dideteksi dengan penambahan potassium hydroxide yang akan membentuk diacetyl yang bereaksi dengan peptone menghasilkan warna merah. Inokulasikan kultur sangkaan ke MR­VP broth lalu inkubasi pada 35±0,5 oC selama 48±2 jam. Setelah waktu 24 jam pindahkan 1 ml ke dalam tabung kosong (13×100 mm) lalu tambahkan 0,6 ml larutan larutan α­naphthol dan 0.2 ml 40% KOH. Tambahkan beberapa kristal creatine. Kocok kemudian biarkan selama 2 jam. Uji VP dinyatakan positif bila warna berubah menjadi merah. Jika kultur dugaan adalah E. coli maka seharusnya menunjukkan hasil tidak ada perubahan warna / negatif. o Uji Methyl Red; uji ini akan membedakan bakteri yang mampu memproduksi asam dari glukosa dan Methyl Red sebagai indikator penurunan pH .

Inkubasi  kembali  tabung  MRVP  pada  35±0,5 oC  selama  48±2  jam.  Tambahkan  5  tetes  larutan  Methyl  Red  ke  dalam  tabung  MR­VP  broth.

Terbentuknya warna merah menandakan hasil uji positif, sedangkang berwarna kuning menunjukkan hasil negatif. Jika kultur dugaan adalah E. coli maka seharusnya menunjukkan hasil positif.

o Uji penggunaan Citrate ; uji ini akan membedakan bakteri yang mampu menggunakan Citrate sebagai sumber nutrisinya.

Inokulasikan  kultur  sangkaan  ke  medium  Koser’s  Citrate  broth  lalu  inkubasi  pada  35±0,5 oC  selama  96  jam.  Reaksi  positif  jika  terdapat

pertumbuhan media yang berwarna hijau berubah menjadi biru, reaksi negatif jika tidak ada pertumbuhan dan media tetap hijau. Jika kultur dugaan adalah E. coli maka seharusnya menunjukkan hasil tidak ada perubahan warna / negatif.

Interpretasikan hasil uji IMViC dengan tabel berikut.

Kriteria Biotipe 1 Biotipe 2

Morfologi dan gram Batang pendek tidak

berspora Batang pendek tidakberspora

Sifat gram Gram negatiif Gram negatif

Gas pada tabung LST + + Uji indole + ­ Uji MR + + Uji VP ­ ­ Uji Citrate ­ ­ Tabel 1. Karakteristik E. coli pada uji morfologi sel, gram, produksi gas dan IMViC untuk biotipe 1 dan 2.

Hasil  yang  mencirikan  biotipe  1  dan  biotipe  2  disimpulkan  sebagai  E.coli  (positif).  Tentukan  jumlah  E.  coli  (MPN/g  atau  ml)  berdasarkan tabung EC positif yang terkonfirmasi dari uji penegasan berdasarkan tabel MPN (tabel 10).

Uji IMViC juga dapat dilakukan menggunakan test kit seperti API20E.

Uji MPN untuk Coliform dan E.coli selengkapnya dapat mengacu langsung ke BAM dengan alamat : (http://www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm064948.htm)

4. Pemilihan jumlah seri tabung MPN

Telah  diketahui  bahwa  MPN  memiliki  beberapa  pilihan  cara  dalam  perhitungannya  berdasarkan  jumlah  tabung  setiap  serinya  sesuai  tabel  yang tersedia  yaitu  3,  5,  8  dan  10  seri  tabung.  Inti  dari  metode  MPN  adalah  mendapatkan  tingkat  pengenceran  yang  kadang­kadang  tapi  tidak  selalu mengandung mikroorganisme hidup. Alasan inilah yang sangat mempengaruhi pemilihan jumlah seri tabung pada metode MPN tersebut. Menurut ISO 7218 (2007:45) pemilihan konfigurasi seri tabung ini juga dipengaruhi oleh jumlah mikroorganisme yang diperkiraan, persyaratan peraturan yang berlaku, presisi yang dibutuhkan dan pertimbangan praktik lainnya.

Sistem metode MPN yang paling banyak digunakan adalah Symmetric dilution system yaitu metode MPN yang menggunakan banyak tabung secara paralel  setiap  pengencerannya.  Semakin  banyak  jumah  tabung  yang  digunakan  setiap  serinya  maka  semakin  presisi  nilai  yang  dihasilkan. Disarankan untuk menggunakan 5 atau lebih tabung setiap serinya jika menginginkan presisi yang lebih baik (ISO 7218, 2007:45). FDA BAM Ch.4 (2002) menyatakan bahwa 3 seri tabung umumnya digunakan untuk sampel pangan, 5 seri tabung untuk sampel air dan kerang, sedangkan 10 seri tabung dipakai untuk menguji air dalam kemasan (bottled water)  atau  sampel  lain  yang  diperkirakan  jarang  terkontaminasi  (mengandung  sedikit mikroorganisme).

Untuk pengujian air dalam kemasan (bottled water) digunakan metode 10 tabung. Diambil 100 ml sampel air dan inokulasikan masing­masing 10 ml sampel yang tidak diencerkan ke dalam 10 tabung 2x LST (double strength) dan tiap tabung berisi 10 ml media. Tabung diinkubasi pada 35°C. selama 24±2 jam. Jika hasil negatif maka tabung diinkubasi lagi selama 24 jam. Semua tabung positif diuji dengan tahap konfirmasi yaitu dengan menanamkannya  pada  BGLB  menggunakan  jarum  inokulasi.  Kemudian  tabung  diinkubasi  pada  35°C.  selama  48±2  jam.  Hasil  MPN  diketahui menggunakan tabel MPN 10 tabung (tabel 14) (FDA BAM Ch.4, 2002). UNEP/WHO (1996:7) menyarankan jumlah sampel yang diinokulasikan dan jumlah seri tabung yang dipakai untuk analisa berbagai jenis sampel air pada tabel berikut. Jenis sampel 50 ml 10 ml 1 ml 0,1_ml 0,01_ml Air minum olahan (treated dinking water) 1 5 ­ ­ ­ Air minum olahan sebagian (partially treated dinking water) ­ 5 5 5 ­ Air yang dimungkinkan terjadinya kontak langsung (Recreational water) ­ 5 5 5 ­ Sumber air yang dilindungi (Protected­source water) ­ 5 5 5 ­

Air permukaan (Surface water) ­ ­ 5 5 5 Tabel 2. Tabel seri tabung dan volume sampel yang digunakan untuk analisa MPN berbagai jenis sampel air (UNEP/WHO, 1996:7) Menurut USDA/FSIS (2008:3) untuk mengantisipasi jika jumlah mikroorganisme dalam sampel >10 Growth Unit/g (ml) maka disarankan menanam sampel 10 ml pada 3 seri tabung, 1 ml pada 3 seri tabung lalu selanjutnya dilakukan pengenceran sampai 1/104 dan tiap pengenceran ditanam 1 ml pada 3 seri tabung. Gambar 2. Skema penanaman metode MPN yang disarankan oleh USDA/FSIS (2008:3). Jika mengikuti petunjuk ini maka kemungkinan memperoleh tabung positif yang “kadang­kadang tapi tidak selalu” semakin besar.   Banyak metode lain yang dapat diacu untuk analisa MPN Coliform dan atau E.coli. Umumnya terdiri dari beberapa tahap pengujian. Berikut tabel perbandingan metode analisa MPN.

Referensi metode ISO 4831:2006 ISO 7251:2005 AOAC OM_966.24 APHA, AWWA,_WEF 9221

Uji Coliform E.coli Coliform dan_E.coli Coliform dan_E.coli

Matriks Pangan dan pakan Pangan dan pakan Pangan Air

Inokulasi dan jumlah seri tabung Padat : 3×3 seri tabung : 10 ml dari 1/10 pada 3 seri tabung DS 1 ml dari 1/10 pada 3 seri tabung SS 1 ml dari 1/100 pada 3 seri tabung SS Cair : Dari 1,1/10,1/100 Padat : 3×3 seri tabung : 10 ml dari 1/10 pada 3 seri tabung DS 1 ml dari 1/10 pada 3 seri tabung SS 1 ml dari 1/100 pada 3 seri tabung SS Cair : Dari 1,1/10,1/100 3×3 seri tabung : 1 ml dari 1/10 pada 3 seri tabung 1 ml dari 1/100 pada 3 seri tabung 1 ml dari 1/1000 pada 3 seri tabung Air minum : 1×10 seri tabung : @ 10 ml 1×5 seri tabung : @ 20 ml 1×1 seri botol : @ 100 ml Bukan air minum : Sampel diencerkan terlebih dahulu. Uji penduga Coliform dan E.coli LST (DS); 30/37oC ; 24±2 jam LST (SS); 30/37oC ; 24+24±2 jam LST (DS+SS); 37oC ; 24+24±2 jam LST; 35±0,5oC ; 24+24±2 jam LST (DS); 35±0,5oC ; (24±2)+(24±3) jam Uji penegasan Coliform BGLB; 30/37 o_C ; 24+24±2 jam (­) BGLB; 35±0,5 o_C ; 48±2 jam BGLB; 35±0,5oC ; 48±3 jam atau ­ LES Endo Agar ­ Mc Conkey ­ Pewarnaan gram ­ LST

Uji penegasan Fecal Coliform (­) EC broth; 44oC ; 24+24±2 jam EC broth; 45,5±0,02oC ; 48±2 jam EC broth; 45,5±0,2oC ; 24±2 jam Uji pelengkap E.coli (­) Uji indol : peptone water; 44oC ;48±2 jam ­ Pewarnaan Gram ­ Penanaman LST ­ Uji indol ­ Uji methyl red ­ Uji Voges Proskauer ­ Uji penggunaan citrate EC­MUG; 45,5±0,2oC ; 24±2 jam atau ­ Uji GAD (glutamate decarboxylase) ­ Uji Indol Tabel yang digunakan Tabel MPN 3 seri tabung dengan inokulum 0,1 g, 0,01 g, dan 0,001 g. atau 1 g, 0,1 g dan 0,01 g. Tabel MPN 3 seri tabung dengan inokulum 0,1 g, 0,01 g, dan 0,001 g. atau 1 g, 0,1 g dan 0,01 g. Tabel MPN 3 seri tabung dengan inokulum 0,1 g, 0,01 g, dan 0,001 g. Tabel MPN 10 tabung dengan inokulum 10 ml; Tabel MPN 5 tabung dengan inokulum 20 ml; Interpretasi P/A. Catatan : SS : single strength DS : double strength P/A : presence / absence Tabel 3. Tabel perbandingan metode MPN untuk Coliform dan atau E.coli berdasarkan beberapa standard internasional (ISO 4831 (2006), ISO 7251 (2005), AOAC OM 966.24 (2005) dan APHA, AWWA, WEF 9221 (2006)).

Jika  pengujian  Coliform  dan  E.coli  dilakukan  sesuai  standar  baku  maka  memang  diperlukan  tahap  konfirmasi  yang  bertingkat  dan  seringkali membutuhkan  waktu  yang  panjang.  Çakir  et  al.  (2002:1049)  membuktikan  bahwa  tidak  perlunya  dilakukan  beberapa  uji  konfirmasi  saat perhitungan Coliform dan E.coli. Konfirmasi yang dapat diabaikan adalah uji pada BGLB untuk mengkonfirmasi Coliform setelah uji LST dan uji indol untuk mengkonfirmasi E.coli setelah uji MUG. Uji konfirmasi ini tidak memberikan dampak yang signifikan terhadap hasil akhir hitungan. 5. Peluang dalam metode MPN Brown (2001:224) memberi permisalan pembacaan tabung positif untuk kombinasi 3­1­0. Kombinasi ini menghasilkan indeks MPN sebesar 4,3. Angka ini menunjukkan sampel memiliki perkiraan 4,3 ‘organisme’ per gram dengan 95% kemungkinan keberadaannya dengan rentang 0,9 sampai 18,1 ‘organisme’ dengan menggunakan tabel MPN 3 seri. Angka 4,3 hanyalah nilai kemungkinan secara statistik. Gambar 3. Bagan distribusi normal salah satu nilai MPN. FDA BAM appendiks 2 (2001) memberikan informasi bahwa hasil dari metode MPN memiliki derajat kepercayaan karena proses perhitungannya merupakan  hasil  dari  peluang.  Arti  dari  95%  confidence  intervals  dalam  tabel  MPN  adalah  kemungkinan  paling  tidak  95%  rentang  derajat kepercayaan  dari  hasil  akhir  adalah  sesuai  dengan  konsentrasi  yang  sebenarnya.  Di  dalam  tabel  MPN  terdapat  kolom  derajat  kepercayaan (confidence interval) 95% dengan batas bawah (lower limit) dan batas atas (upper limit). Angka ini menunjukkan batas derajat kepercayaan tersebut. Nilai indeks MPN dan derajat kepercayaan dalam tabel dinyatakan dalam dua digit signifikan, misalnya nilai 400 adalah hasil pembulatan antara 395  dan  405.  Tidak  diberikannya  batas  nilai  MPN  untuk  semua  tabung  positif  (3­3­3)  yang  ditandai  dengan  tanda  “>”  adalah  menggambarkan konsentrasi lebih dari nilai MPN untuk kombinasi paling tidak ada satu tabung negatif pada pengenceran tertinggi (3­3­2). Ketidakpastian ini juga dijumpai pada indeks MPN untuk semua kombinasi tabung negatif. (+) (+) (+) Conf. limit Conf. limit 0,1 0,01 0,001 MPN/ml Batas bawah Batas atas 5 3 0 79 22 220 5 3 1 110 34 250 5 3 2 140 52 400 5 3 3 180 70 400 5 3 4 210 70 400

Tabel 4. Contoh potongan tabel MPN 5 seri tabung dengan inokulum 0,1g (ml), 0,01 g (ml) dan 0,001 g (ml). Untuk memahami peranan peluang dalam mendistribusikan sel sehingga menghasilkan tabung positif maka jumlah tabung positif (5­3­1) pada tabel dicoba untuk dirunut dan diilustrasikan kembali dalam proses penanamannya pada gambar berikut (dianggap bahwa nilai MPN/ml sama dengan ‘sel’/ml (GU/ml)). Namun perlu diingat, jumlah sel yang terambil tidak selalu seperti itu, semuanya adalah peluang dan angka yang didapat adalah angka yang kemungkinannya paling besar. Gambar 4. Ilustrasi peluang saat penanaman dan pengenceran pada metode MPN. Satu titik menggambarkan satu ‘sel’ atau growth unit. 6. Persyaratan pemilihan kombinasi tabung positif dan pelaporannya

Seperti  metode  hitungan  cawan,  di  dalam  MPN  juga  memiliki  konsep  pemilihan  jumlah  yang  masuk  dalam  ‘kisaran  hitung’  yaitu  berdasarkan frekuensi  kemunculan  tabung  positif  yang  sebaiknya  kadang­kadang  tapi  tidak  selalu.  Kombinasi  tersebut  dipilih  dari  tiga  tingkat  pengenceran tertentu yang disebut tiga tingkat pengenceran yang signifikan. Syarat umum yang dipakai dalam pemilihan tabung positif adalah : ­ Pilih pengenceran yang memiliki kombinasi tabung kategori 1, jika tidak ada maka pilih kombinasi dari kategori berikutnya yang lebih rendah berturut­turut (2 dan 3) (tabel 9). Atau dengan ketentuan : ­ Pilih pengenceran terendah yang tidak semua tabung menghasilkan tabung positif. ­ Pilih pengenceran tertinggi yang paling tidak memiliki satu tabung positif. ­ Pilih semua pengenceran diantaranya. ­ Kalikan setiap seri tabung yang dipilih dengan pengenceran yang diambil. Misalnya : dari inokulum 1, 0,1, 0,01, 0,001 dan 0,0001 menghasilkan kombinasi tabung positif 5­4­3­1­0 maka dipilih 5­4­3­1­0 bukan 5­4­3­1­0 atau bukan 5­4­3­1­0 sehingga didapat nilai MPN 33/g.

1 g 0,1 g 0,01 g 0,001 g 0,0001 g Kombinasi tabung_positif Nilai MPN/g

5 4 3 1 0 4­3­1 33

Tabel 5. Tabel contoh pemilihan tabung positif berdasarkan syarat yang berlaku.

Gambar 5. Bagan pemilihan tabung untuk kombinasi tabung 5­4­3­1­0.

Tidak semua keadaan menggambarkan kondisi seperti diatas. Dimungkinkan juga mendapatkan semua seri tabung menghasilkan tabung positif dan tidak semua pengenceran menghasilkan tabung positif.

Berikut  contoh  penentuan  tabung  positif  pada  beberapa  kasus  tertentu  berdasarkan  interpretasi  peraturan  SNI  01­2332.1  (2006:8)  dan  ISO  7218 (2007:48).

Gambar 6. Bagan pemilihan tabung untuk contoh A. Dipilih kombinasi tabung 5(1/10)­1(1/100)­0(1/1000). Jika terdapat lebih dari satu seri pengenceran yang memiliki seluruhnya tabung positif, maka pilih pengenceran tertinggi yang menghasilkan seluruh tabung positif dan dua pengenceran berikutnya. Contoh A: 5­5­1­0­0. Jika pada pengenceran tertentu memiliki tabung positif seluruhnya dan pengenceran sebelumnya tidak memiliki seluruh tabung positif, maka dipilih pengenceran yang memiliki semua tabung positif dan dua pengenceran berikutnya. Contoh B: 4­5­1­0­0. Bukan diambil 4­5­1 karena pada pengenceran 1/1 tidak semua tabung positif. Jika pada tingkat pengenceran yang lebih tinggi (dari dua pengenceran berikutnya setelah pengenceran yang memiliki semua tabung positif) masih menghasilkan tabung positif maka yang dijadikan pengenceran paling tinggi yang diambil adalah tingkat pengenceran tertinggi tersebut dan dua pengenceran sebelumnya.

Contoh C: 5­4­4­1­0. Bukan dipilih 4­1­0 karena pada 1/101 tidak seluruh tabung positif. Bukan dipilih 5­4­4 karena pada 1/103 masih terdapat satu

tabung positif. Jika pada tingkat pengenceran tertentu semua menghasilkan tabung negatif tetapi pengenceran selanjutnya masih terdapat tabung positif, maka yang dinyatakan tabung positif (dari pengenceran selanjutnya tersebut) adalah tingkat pengenceran sebelumnya (tabung positif bergeser ke pengenceran sebelumnya). Contoh D. 5­4­4­0­1. Jika pada tingkat pengenceran tertinggi yang dilakukan masih terdapat tabung positif, maka pilih pengenceran tersebut dan dua tingkat pengenceran sebelumnya. Contoh E. 5­5­5­5­2.

Jika  tingkat  pengenceran  tertentu  menghasilkan  tabung  positif  sedangkan  pengenceran  sebelumnya  tidak,  maka  pilih  dua  tingkat  pengenceran sebelumnya dari pengenceran yang memiliki tabung positif tersebut.

Contoh F. 0­0­1­0­0.

Jika pada pengenceran yang lebih tinggi dari pengenceran tertinggi yang ditentukan masih menghasilkan tabung positif, maka tambahkan tabung positif tersebut ke tingkat pengenceran sebelumnya (bergeser menambahkan jumlah tabung positif pengenceran sebelumnya).

Contoh G. 4­4­1­1­0 dipilih menjadi 4­4­2.

Pelaporan  MPN/g  didapat  dari  angka  indeks  MPN  yang  harus  disesuaikan  dengan  seri  tabung  dari  mana  tingkat  pengenceran  tersebut  diambil. Misalnya pada contoh E angka indeks MPN untuk kombinasi 5­5­2 (inokulum 0,1, 0,01 dan 0,001) adalah 540 tetapi karena diambil pengenceran signifikan 0,01, 0,001 dan 0,0001 maka nilai harus dikalikan 10. Begitu pula sebaliknya untuk contoh G yang diambil dari pengenceran signifikan 1, 0,1 dan 0,01 maka nilai 47 harus dibagi 10 menjadi 4,7.

contoh 1 g 0,1 g 0,01 g 0,001 g 0,0001 g Kombinasi_{tabung positif} Angka_indeks MPN Nilai_MPN/g

A 5 5 1 0 0 5­1­0 33 33 B 4 5 1 0 0 5­1­0 33 33 C 5 4 4 1 0 4­4­1 40 40 D 5 4 4 0 1 4­4­1 40 40 E 5 5 5 5 2 5­5­2 540 5400 F 0 0 1 0 0 0­0­1 1,8 0,18 G 4 4 1 1 0 4­4­2 47 4,7 Tabel 6. Tabel contoh pemilihan tabung positif pada beberapa kasus berdasarkan syarat yang berlaku. Angka indeks MPN diambil dari tabel MPN 5 seri tabung dengan inokulum 0,1 g, 0,01 g, dan 0,001 g (SNI 01­2332.1, 2006:8). Sedangkan contoh pemilihan tabung positif untuk 3 seri tabung dapat dilihat pada tabel berikut.

contoh 1 g 0,1 g 0,01 g 0,001 g 0,0001 g Kombinasi_{tabung positif} Angka_indeks MPN Nilai_MPN/g

A 3 3 2 1 0 3­3­2 110 110

B 3 3 3 0 ­ 3­3­0 24 240

C 2 2 1 1 0 1­1­0 0,74 74

E 2 2 0 1 0 2­2­0 2,1 2,1 Tabel 7. Tabel contoh pemilihan tabung positif pada beberapa kasus berdasarkan syarat yang berlaku. Angka indeks MPN diambil dari tabel MPN 3 seri tabung dengan inokulum 1 g, 0,1 g, dan 0,01 g (ISO 7218, 2007:49). 7. Batas­batas perhitungan nilai MPN Batas batas perhitungan MPN ditentukan untuk menghasilkan data yang dapat dipercaya dan presisi. Presisi dari metode MPN dipengaruhi oleh jumlah tabung paralel tiap pengenceran dan koefisien pengencerannya.

Batas  praktik  bawah  dan  atas  dari  prosedur  MPN  adalah  jika  hanya  satu  tabung  dalam  set  deteksi  (jumlah  seri  tabung,  jumlah  tabung, pengencerannya  dll.)  adalah  positif  atau  negatif.  Kisaran  nyata  dari  3  x  5  seri  tabung  adalah  1,8  sampai  1600  partikel  /  unit  volume  (dengan inokulum 0,1 g, 0,01 g, dan 0,001 g; tabel 11). Pada konsentrasi partikel yang sangat rendah suatu metode kuantitatif akan menjadi seperti metode

presence/absence yang menghasilkan data ya atau tidak saja ISO 1348 (2011:25).

Batas  atas  metode  MPN  dilampaui  jika  semua  tabung  dari  semua  pengenceran,  misalnya  3­3­3  menghasilkan  >1100.  Namun  ini  tidak menggambarkan  batas  atas  dari  metode  itu  sendiri  karena  hanya  kesalahan  tingkat  pengenceran  yang  dilakukan.  Pengenceran  yang  cocok  dapat disesuaikan  (digeser).  Oleh  karena  itu  tidak  ada  batas  atas  yang  dapat  diatur  karena  alasan  statistik  sebab  presisi  tidak  tergantung  pada  jumlah partikel  (sel)  yang  dimasukkan  ke  dalam  set  deteksi.  Hal  ini  merupakan  karakteristik  prosedur  MPN  yaitu  presisinya  dapat  ditingkatkan  dengan mengubah konfigurasi set deteksi (ISO 13483, 2011:20). 8. Menghitung MPN tanpa tabel Metode yang telah dijelaskan sebelumnya adalah metode penentuan nilai MPN berdasarkan tabel. Selain menggunakan tabel, FDA BAM apendiks 2 (2010) dan ISO 7218 (2007:46) menyatakan bahwa nilai MPN dapat dicari dengan rumus berikut (Thomas formula) :   MPN/g = (∑ gj) / (∑ tjmj ∑ (tj­gj)mj) (½) ∑ g_j : jumlah tabung positif pada pengenceran yang dipilih ∑ tjmj : jumlah (g/ml) dari sampel dalam semua tabung pada pengenceran yang dipilih ∑ (tj­gj)mj : jumlah (g/ml) dari sampel dalam tabung negatif pada pengenceran yang dipilih Contoh 1 : Didapatkan hasil kombinasi tabung (10/10, 10/10, 4/10, 2/10, 0/10) dari 10 seri tabung dengan inkokulum 0,1, 0,01, dan 0,001. Jika digunakan tabel maka dipilih (10/10, 10/10, 4/10, 2/10, 0/10) yaitu kombinasi 10­4­2 = 70 MPN/g. Namun dalam perhitungan hanya gunakan (10/10, 10/10, 4/10, 2/10, 0/10). Gambar 7. Bagan tabung positif dan negatif 10 seri tabung untuk contoh 1. ∑ gj = 6 6 didapatkan dari 4 tabung positif +2 tabung positif ∑ tjmj = (10 x 0,01) + (10 x 0,001) = 0,11 10 adalah jumlah seri tabung 0,01 dan 0,001 adalah sampel yang dimasukkan (g) ∑ (t_j­g_j)m_j = (6 x 0,01) + (8 x 0,001) = 0,068 6 adalah jumlah tabung negatif pada pengenceran 0,01 8 adalah jumlah tabung negatif pada pengenceran 0,001 MPN/g = 6/(0,068 x 0,11) ½ = 6/0,086 = 70/g

Contoh 2 : Didapatkan hasil kombinasi tabung (5/5, 3/5, 1/5, 0/5) dari 5 seri tabung dengan inkokulum 0,1, 0,01, dan 0,001. Jika digunakan tabel maka dipilih (5/5, 3/5, 1/5, 0/5) yaitu kombinasi 5­3­1 = 110/g. Namun dalam perhitungan hanya gunakan (5/5, 3/5, 1/5, 0/5). Dengan cara yang sama maka MPN/g. = 4 / (0,024 x 0,055)1/2 = 4 / 0,0363 = 110/g 9. Aplikasi lain MPN dalam perhitungan bakteri Prinsip MPN umumnya dikenal di berbagai metode standar adalah sebagai metode fermentasi tabung seri bertingkat. Selain yang telah disebutkan

diatas  konsep  MPN  juga  diterapkan  dalam  perhitungan  bakteri  dengan  nama  Simplate® (BioControl Systems). Metode Simplate®  menggunakan

binary detection technology untuk menghitung mikroorganisme berdasarkan pertumbuhannya pada sumuran (wells) pada permukaan cawan plastik

khusus  yang  telah  disediakan.  Kisaran  perhitungan  normal  menggunakan  84  sumuran.  Sebagian  volume  sampel  (10  ml)  yang  disebarkan  pada cawan  akan  mengisi  sumuran  sedangkan  sisa  volume  sampel  dapat  disingkirkan  di  kapas  penyerap  yang  terletak  di  bagian  pinggir  cawan. Pertumbuhan  yang  terdapat  di  sumuran  yang  diindikasikan  perubahan  warna  (tergantung  media  spesifik  yang  digunakan)  akan  menggambarkan jumlah mikroorganisme pada sampel. Hasil yang diperoleh adalah adanya sumur positif atau negatif. Jumlah angka positif kemudian dibandingkan dengan tabel sehingga diperoleh nilai CFU/g(ml) sampel. Pada prinsipnya metode ini tetap mengadopsi perhitungan kemungkinan dari metode MPN yaitu positif atau negatifnya setiap unit fermentasi. Peningkatan jumlah unit (sumuran) tersebut tentu dapat mempertinggi akurasi dan presisi metode ini.  Data  akhir  juga  bukan  dilaporkan  sebagai  MPN/ml(g)  tapi  diubah  menjadi  CFU/ml(g)  walaupun  dalam  praktiknya  tidak  akan  dijumpai perhitungan koloni pada cawan. Penggunaan metode ini telah divalidasi, contoh salah satunya tedapat di AOAC OM 2005.03 (AOAC,2005 Ch.17, p.36) Detection and Confirmed Quantitation of Coliform and E.coli in Foods. SimPlate Coliform and E.coli Color Indicator. Selain itu, TEMPO® (bioMérieux) juga menggunakan MPN dalam memperoleh hasil perhitungannya. MPN terotomatisasi ini terdiri dari vial yang mengandung medium pada sebuah kartu. Kartu mengandung tiga seri (set) sumuran (wells/vial) yaitu kecil, menengah dan besar masing­masing 16 sumuran dan semua berjumlah total 48 sumuran. Setiap seri diinokulasikan sampel dengan perbedaan setiap set­nya 1/10, seperti halnya metode 3 seri tabung. Artinya metode ini menggunakan seri ‘tabung’ lebih banyak yaitu 16­16­16 yang tentunya dapat meningkatkan akurasi dan presisi hasil perhitungannya. 10. Perhitungan MPN secara otomatis Nilai MPN jika dihitung secara manual akan sangat merepotkan. Oleh karena itu dibangun suatu perhitungan MPN yang telah diprogram pada suatu perangkat  lunak.  Food  and  Drug  Administration  (FDA)  menyediakan  file  perhitungan  MPN  yang  dapat  diunduh  di: (http://www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm109656.htm). Beberapa pehitungan otomatis lainnya dengan nama MPN

Calculator juga dapat di temui di alamat : (http://www.i2workout.com/mcuriale/mpn/). Environmental Protection Agency (EPA) juga membangun

software  untuk  perhitungan  MPN  (MPN  Calculator  Version  3.0)  dengan  mempelajari  manual  pengoperasian  dan  instalasinya  di  alamat  :

(http://www.epa.gov/microbes/MPN_User_Manualvs3.pdf)​. Perhitungan MPN otomatis ini tentu dapat meniadakan penggunaan tabel dan kombinasi tabung yang tidak terdapat pada tabel (kombinasi jarang, misalnya 1­0­3) juga dapat diketahui melalui perhitungan ini. Namun perlu diketahui bahwa sebagian besar metode standar umum MPN (misalnya, FDA BAM, AOAC, ISO, SNI) sampai sekarang masih menggunakan tabel MPN dalam tahap prosedurnya. Gambar 8. Tampilan perhitungan MPN secara otomatis Spreadsheet MPN FDA BAM, Spreadsheet MPN Calculator, dan software MPN Calculator (VB6 version). Contoh perhitungan 3 seri tabung (inokulum 0,1, 0,01 dan 0,001) dengan kombinasi 3­2­1.

11. Hubungan MPN dan CFU CFU dan MPN adalah satuan yang asalnya perhitungannya terpisah walaupun menggambarkan tujuan yang sama yaitu memperkirakan jumlah sel sebenarnya. Kedua satuan ini tidak berhubungan langsung, yang artinya tidak selalu x CFU/ml adalah x MPN/ml walaupun data antara CFU/ml dan MPN/ml menunjukkan korelasi positif. 11.1. Perbandingan antara MPN dan CFU Berikut adalah beberapa hasil perbandingan antara metode hitungan cawan (spread/pour plate pada media agar selektif atau membran filtrasi) dan metode fermentasi tabung berseri/MPN yang diambil dari beberapa publikasi penelitian sebelumnya.

Hildebrandt  dan  Schott  (2001:453)  melaporkan  bahwa  metode  MPN  menghasilkan  data  positif  Listeria  spp.  dan  L.monocytgenes  lebih  banyak dibandingkan  dengan  metode  hitungan  cawan  sehingga  dapat  disimpulkan  bahwa  MPN  lebih  sensitif  dibanding  CFU  dalam  uji  Listeria.  Namun metode  hitungan  cawan  lebih  dipilih  digunakan  secara  rutin  karena  memiliki  produktivitas  yang  sedikit  lebih  baik  dan  variasi  hasil  lebih  kecil. meskipun  begitu  metode  MPN  dapat  dipilih  untuk  studi  epidemiologi  karena  memiliki  detection  limit  (LOD)  yang  jauh  lebih  rendah  dibanding hitungan cawan yaitu sekitar 66% dari batas deteksi hitungan cawan.

Paulsen et al. (2008:376) menyatakan bahwa metode MPN (terotomatisasi) menghasilkan data rata­rata lebih rendah dibandingkan hitungan cawan dengan  metode  yang  bersumber  dari  ISO  dan  hitungan  cawan  dengan  petrifilm  untuk  menghitung  kelompok  Enterobacteiaceae.  Jadi  dapat disimpulkan bahwa metode hitungan cawan lebih banyak mendeteksi Enterobacteiaceae (lebih sensitif) daripada MPN.

Cho  et  al.  (2010:846)  menyebutkan  bahwa  hasil  perhitungan  E.coli  dalam  menentukan  kualitas  air  menggunakan  metode  MPN  menghasilkan konsentrasi lebih besar dibanding hitungan cawan. Namun berbeda dengan perhitungan Enterococci yang menghasilkan metode MPN lebih rendah daripada hitungan cawan.

Kodaka et al. (2006:115) telah membuktikan bahwa metode hitungan cawan dengan penanaman pada dry rehydratable film media (Compact Dry) tidak  memiliki  variasi/perbedaan  yang  signifikan  jika  dibandingkan  dengan  metode  MPN  yang  bersumber  dari  AOAC  untuk  menguji  bakteri Coliform pada daging mentah. Curiale et al. (1991:635) menyatakan bahwa metode penanaman pada dry rehydratable film mempunyai tingkat reprodusibilitas dan repeatabilitas yang sama atau lebih baik jika dibandingkan dengan metode MPN yang bersumber dari AOAC untuk menghitung Coliform dan E.coli. Penelitian ini dilakukan pada berbagai sampel pangan yang diuji oleh 14 laboratorium dalam rangka studi kolaboratif untuk mengadopsi metode ini menjadi metode resmi AOAC. Prosedur MPN mempunyai tingkat keberagaman (variable) data lebih besar dibandingkan dengan hitungan cawan menggunakan membran filtrasi untuk menganalisa jumlah Coliform sehingga metode MPN menghasilkan jumlah rata­rata Coliform lebih besar daripada metode hitungan cawan. Keberagaman  tersebut  tidak  ditentukan  oleh  kesalahan  analis  (human  error)  tetapi  lebih  dipengaruhi  oleh  dasar  perhitungan  metode  MPN  yaitu probabilitas (Gronewold dan Wolpert, 2010:3327). Pada analisa perhitungan bakteri rumen didapatkan data rata­rata jumlah bakteri rumen (pemfermentasi xylane, starch dan pectin) cenderung sama antara metode CFU maupun MPN. Namun metode hitungan cawan memberikan variabel yang lebih kecil yaitu antara 4­5 kali dari metode MPN sehingga nilai CFU memberikan presisi data yang lebih baik (Kajikawa et al. 1990:810). Wohlsen et al. (2006:350) telah melakukan perbandingan berbagai metode resmi untuk mengevaluasi setiap metodenya. Metode­metode yang diuji adalah spread dan pour plate (standard plate count), filtrasi membran, MPN, dan petrifilm untuk menghitung E.coli dan Coliform lain. Dari studi tersebut  dihasilkan  metode  yang  paling  baik  dan  konsisten  adalah  metode  pour  plate  dan  metode  petrifilm.  Metode  lainnya  mengindikasikan tingginya keberagaman data antar perulangan dan rendahnya recovery.

Beberapa literatur diatas menyebutkan hitungan cawan (CFU) menghasilkan data yang lebih presisi (Kajikawa et al. (1990:810),  Wohlsen  et  al. (2006:350) dan Gronewold dan Wolpert (2010:3327)). Kemungkinan kurangnya presisi pada MPN ini disebabkan oleh terkumpulnya hasil pada tabel  MPN  dengan  pembulatan  (dua  angka  signifikan)  yang  cukup  besar  dibandingkan  perhitungan  koloni.  Variabilitas  data  metode  MPN  yang lebih besar dapat diperparah jika kehomogenan sampel tidak diperhatikan dengan baik (sel target masih menggerombol dalam partikel besar sampel) atau adanya tabung positif palsu. Gambar 9. Grafik diatas dapat menjelaskan bahwa metode MPN memiliki keberagaman data yang lebih besar dan hasil rata­rata MPN lebih tinggi dibanding CFU sehingga menjadikan presisi metode MPN lebih rendah. Grafik A adalah data hasil metode MPN (MPN/100ml) yang dibandingkan dengan data jumlah mikroorganisme target yang sebenarnya sedangkan grafik B adalah untuk metode filtrasi membran (CFU/100 ml) (Gronewold dan Wolpert, 2008:3329). 11.2 Perbedaan antara MPN dan CFU

Perbedaan antara CFU dan MPN dapat diringkas pada tabel berikut.

Pembeda MPN CFU (hitungan cawan)

Objek yang dihitung Tabung positif Setiap koloni

Jenis metode Semi kuantitatif Kuantitatif

Metode yang dilingkupi Metode MPN : 3 seri, 5 seri, 8 seri, atau 10 seri tabung. Metode MPN terotomatisasi. Spread/pour plate pada media agar, membran filtrasi, penanaman pada dry rehydratable film, spiral plate count. Dasar perhitungan Teori probabilitas berdasarkan positif­negatif. Presisi kurang. Satu koloni menggambarkan satu “sel” (unit tumbuh). Lebih presisi. Dasar pemilihan

pengenceran Frekuensi tabung positif yangkadang­kadang tetapi tidak selalu. Kisaran jumlah koloni yang memenuhi syarat statistik (25­250, 30­300, <150 dll.) Media pertumbuhan Broth/cair pada tabung. lebih banyak membutuhkan media. Agar/padat pada cawan. lebih sedikit membutuhkan media. Mikroorganisme target Sel bersifat terpisah seperti Coliform, E.coli, enterococci, S.aureus dan Listeria. Mikroorganisme target yang terluka dapat lebih ter­recovery Semua jenis mikroorganisme tergantung media selektif yang dipakai. Penyebab kesalahan atau

positif palsu Bakteri non target yang memilikiciri metabolisme yang sama. Koloni tidak terhitung atauterhitung ganda, antagonisme, kompetisi. Inokulum 10 ml (double strength), 1 ml (single strength) 1 ml (pour plate), 0,1 ml (spread plate) 100 ml (membrane filter) Pengaruh waktu inkubasi Tidak mengubah hasil jika diinkubasi melebihi waktu yang ditentukan. Koloni dapat terus tumbuh jika terlalu lama diinkubasi. Tabel 8. Ringkasan perbedaan MPN dan hitungan cawan (CFU). 11.3 Pengkonversian satuan MPN ke CFU

Apakah  nilai  MPN  dapat  diubah  menjadi  CFU?  Cukup  sulit  untuk  menjawab  pertanyaan  tersebut  karena  terbatasnya  sumber.  Berikut  adalah penjelasan yang diperoleh dari beberapa referensi.

Cho et al. (2010:846) telah mempelajari dan mengevaluasi mengenai korelasi metode MPN (colilert dan enterolert) dan CFU (mE agar dan mTEC agar)  untuk  analisa  E.coli  dan  Enterococci  yang  diukur  pada  setiap  musim  yang  berbeda  dengan  membuat  persamaan  regresi  linier.  Hasil  uji perhitungan  kemudian  dianalisa  dan  dikelompokkan  berdasarkan  musim  pengambilan  sampel.  Bentuk  persamaan  dasar  tersebut  adalah MPN_estimates = a + b x CFU_estimates, atau bentuk persamaan lainnya yaitu MPN_estimates = a + CFUb_estimates dimana a dan b adalah koefisien regresi. Hasil  pengolahan  data  menunjukkan  bahwa  MPN  dan  CFU  mempunyai  korelasi  positif  dengan  nilai  a  dan  b  berbeda­beda  di  setiap  musimnya.

Begitu pula dengan nilai r2  masing­masing  persamaan  di  setiap  musimnya.  Namun  studi  ini  tidak  menjelaskan  mengenai  suatu  rumus  universal

untuk mengubah satuan MPN ke CFU.

Pada  metode  AOAC  983.25  (2005:40)  untuk  uji  total  Coliform,  Fecal  Coliform  dan  E.  coli  di  pangan  menggunakan  metode  filtrasi  membran (Hydrophobic  Grid  Membrane  Filter)  disebutkan  bahwa  hasil  akhir  jumlah  transek  membran  filter  yang  ditumbuhi  koloni  target  dapat  diubah

menjadi MPN dengan rumus MPN = {N loge [N/(N­x)]}, dimana N adalah jumah total transek (kotak) pada membran filter dan x adalah jumlah

transek  yang  terdapat  koloni  bakteri  target  (transek  positif).  Cara  ini  mengindikasikan  bahwa  dari  sebaran  koloni  pada  transek  membran  yang seharusnya dinyatakan sebagai CFU/ml dapat diubah ke MPN/ml. Namun rumus ini hanya telah tervalidasi untuk metode HGMF sesuai rujukan referensi tersebut. Selain itu ditemukan juga rumus yang sama dengan diatas dan dilengkapi tabel pengkonversinya pada apendiks C untuk metode penghitungan Coliform menggunakan metode HGMF (MFHPB­17) yang diterbitkan badan kesehatan dan pangan kanada (Health Product and Food Branch, Canada).

3M  (2004)  merilis  tabel  dan  rumus  konversi  untuk  data  yang  diperoleh  menggunakan  petrifilm  EC  plate  dalam  analisa  E.coli  dan  Coliform. Disebutkan bahwa satuan MPN dapat diubah ke CFU atau sebaliknya dengan rumus (log CFU) = 0,37 + 0,9 x (log MPN). Namun rumus ini juga tidak dapat merepresentasikan semua keadaan dan jenis sampel, dan diperlukan verifikasi lebih lanjut untuk aplikasi yang lebih spesifik. Rumus ini diperoleh saat studi prekolaboratif AOAC dengan menggunakan sampel pangan. Sedangkan metode penggunaan petrifilm (CFU) ini sendiri telah tervalidasi oleh AOAC (AOAC, OM 991.14) yang digunakan sebagai rujukan pengenalan metode dalam rumus tersebut. Namun sama sekali tidak dicantumkan  rumus  konversi  ini  dalam  metode  resmi  AOAC  991.14  yang  telah  diterbitkan,  begitu  pula  dengan  jurnal  sumber  metode  tersebut (J.AOAC vol.74, p.635). Jadi rumus konversi diatas tidak valid jika digunakan untuk semua sampel dan semua kondisi.

perubahan itu dengan suatu rumus yang telah tervalidasi. Jika memang antara CFU dan MPN dapat diubah dengan hasil yang pasti, maka akan dapat ditemukan rumus pengkonversinya dengan mudah di referensi metode resmi internasional. Baik MPN atau CFU sebaiknya diperoleh secara terpisah sesuai  metodenya  masing­masing.  Seperti  analogi  menembak  dengan  busur  panah  tidak  dapat  disamakan  dan  diubah  seperti  menembak  dengan pistol mengenai tingkat akurasi dan presisinya, karena setiap cara memiliki kelebihan dan kekurangannya sendiri.

12. Kesalahan umum MPN

12.1. Kombinasi seri tabung diluar tabel

Berdasarkan prinsip pengenceran pada MPN maka seharusnya atau sebaiknya jumlah tabung positif pada pengenceran lebih pekat akan semakin banyak (1/10>1/100>1/1000), misalnya 5­3­1. Hal ini dikarenakan setiap pengenceraan mengurangi jumlah mikroorgansime target dan akibatnya semakin  kecil  kesempatannya  untuk  membuat  tabung  menjadi  positif.  Namun  seringkali  hasil  yang  didapat  tidak  sesuai  dengan  logika  peluang, seperti kombinasi 5­3­4 yang menghasilkan nilai 210. Bisa saja banyak sel tidak sengaja terambil dan memperbanyak tabung positif di pengenceran selanjutnya atau homogenisasi tidak berlangsung sempurna. USDA/FSIS (2008:2) menyarankan untuk mengulangi analisa jika diperoleh kombinasi tabung yang tidak terdapat dalam tabel (misalnya untuk 3 seri tabung : 0­2­3, 1­2­3, 2­1­3 dll.). Diasumsikan bahwa hasil tersebut mencurigakan karena kontaminasi atau kesalahan praktik lainnya.

Dalam  tabel  MPN  dalam  metode  MPN  yang  diterbitkan  AOAC  (AOAC  OM  966.24,  2005:Ch.17,p5)  mengenai  kombinasi  tabung  seperti  ini diberikan  catatan  khusus.  Misalnya  untuk  kombinasi  0­1­2,  1­3­2,  2­0­3  dll.  Catatan  ini  menyarankan  bahwa  terdapat  aspek  ketidakemungkinan yang tinggi jika mendapatkan kombinasi ini yang mengindikasikan bahwa nilai MPN yang diperoleh dapat lebih rendah dibandingkan konsentrasi sebenarnya.

ISO 7218 (2007:61) menjabarkan tentang pembagian kategori kemungkinan nilai MPN berdasarkan kombinasi tabung positif dari tabel MPN. Nilai MPN yang diperoleh dibagi menjadi empat kategori yaitu kategori 1, kategori 2, kategori 3 dan kategori 0. Kategori 1 memiliki kemungkinan paling tinggi  untuk  diperoleh,  berturut­turut  menurun  sampai  kategori  0.  Disarankan  untuk  ditentukan  terlebih  dahulu  kategori  mana  yang  dinyatakan diterima  (acceptable),  misalnya  hanya  kategori  1,  1  dan  2  atau  1,2,dan  3.  Jika  hasil  MPN  digunakan  untuk  menentukan  keputusan  yang  lebih penting maka sebaiknya dipakai kategori 1 atau 1 dan 2 saja sebagai batas keberterimaan. Sedangkan kategori 0 dapat dipertimbangkan sebagai nilai yang mencurigakan. Tedapat pola mengenai kombinasi tabung dan pengelompokan kategorinya. Semakin baik kategori nilai MPN maka kombinasi tabung positif yang terjadi akan semakin logis (mendekati kenyataan). 12.2. Tabung negatif palsu dan positif palsu Tabung negatif palsu mungkin terjadi jika mikroorganisme target yang terdapat pada tabung gagal menghasilkan indikasi yang disyaratkan metode untuk dinyatakan sebagai tabung positif. Beberapa sebab yang dapat diidentifikasi diantaranya adalah : (1) Terdapat bahan yang dapat mematikan dan menghambat mikroorganisme atau berinterferensi dengan media, misalnya Chlorine pada air. (2) Gagalnya uji penegas dan pelengkap dalam mengidentifikasi  mikroorganisme  terkait  karena  tidak  semua  (100%)  strain  mampu  dideteksi  metabolismenya  dengan  prosedur  tertentu  sehingga tabung  penduga  yang  semula  positif  dinyatakan  menjadi  negatif,  misalnya  pada  metode  ISO  7251:  2005  terdapat  catatan  bahwa  strain  patogen E.coli tidak mampu tumbuh pada suhu 44°C saat dikonfirmasi dengan pada EC broth. (3) Tabung durham dilingkupi atau tenggelam oleh substrat sampel  padat  dari  homogenat  sampel  sehingga  gas  tidak  mampu  terperangkap.  Disarankan  tetap  melihat  pembentukan  gas  dengan  menggoyang tabung sehingga timbul buih (effervescence).

Sedangkan tabung positif palsu dapat disebabkan oleh (1) Terjadinya tabung positif oleh mikroorganisme non target, misalnya menurut Hussong et

al.  (1981:35)  beberapa  strain  Bacillus  spp.  dan  Aeromonas  spp.  mampu  pada  membentuk  gas  pada  tahap  penduga.  Oleh  karena  itu  pellicle

(substansi lengket bakteri; film) tidak boleh terambil saat diinokulasikan lagi pada tahap penegas dan Coliform umumnya tidak membentuk pellicle. (2)  Kontaminasi  oleh  bakteri  lain  termasuk  oleh  isolat  kontrol  uji,  sehingga  disarankan  penanaman  isolat  kontrol  dilakukan  setelah  analisa.  (3) Kontaminasi silang dari tabung yang lain. Oleh karena itu lebih tepat menggunakan inoculation stick sekali buang saat uji penegas jika pembakaran jarum inokulum berkali­kali dirasa kurang menjamin sterilisasi. (4) Masih terdapatnya udara pada tabung durham karena kesalahan preparasi media. Jika terdapat udara pada durham dan tidak timbul buih maka umumnya adalah reaksi negatif. 13. Tabel MPN Tabel MPN berbagai seri tabung dapat dilihat pada tautan berikut : http://mikrobiologipraktik.com/tabel­mpn/     Disusun oleh : Indra Pradhika, 2014 Referensi :

AOAC  (Asociation  of  Official  Analytical  Chemistry).  2005.  AOAC  OM  966.24.  Coliform  Group  and  Escherichia  coli  Microbiological  (MPN) Method. AOAC Official Method of Analysis Microbiological Methods Ch.17:5.

AOAC.  2005.  AOAC  OM  983.25.  Total  Coliforms,  Fecal  Coliforms  and  E.  coli  in  Foods,  Hydrophobic  Grid  Membrane  Filter  Method.  AOAC Official Method of Analysis Microbiological Methods Ch.17:40.

AOAC. 2005. AOAC OM 991.14. Coliform and Escherichia coli Count in Food, Dry Rehydratable Film (PetrifilmTM E.coli/Coliform Count Plate

TM _{and Petrifilm}TM _{Coliform Count Plate} TM_{) Methods. AOAC Official Method of Analysis Microbiological Methods Ch.17:32.}

AOAC. 2005. AOAC OM 2005.03. Detection and Confirmed Quantitation of Coliform and E.coli in Foods. SimPlate Coliform and E.coli Color Indicator. AOAC Official Method of Analysis Microbiological Methods Ch.17:36.

APHA (American Public Health Association), AWWA (American Water Works Association) dan WEF (Water Environtment Federation). 2006. Standard Method for Examination of Water and Wastewater 9221 : Multiple­tube fermentation technique for members of the Coliform group. Brown,  AE,  2001.  Benson  :  Microbiological  Application,  Laboratory  Manual  in  General  Microbiology,  Ed  ke­8.  New  York:  Mc  Graw  Hill Companies.

produk perikanan.

Çakir, I, HB Doğan, E Başpinar, F Kiven, dan AK Halkman. 2002. The need for confirmation in Coliform and E.coli enumeration in food. Turk J Vet & Ani Sci 26:1049­1053.

Cho,  KH,  Han  D,  Park  Y,  Lee  SW,  Cha  SM,  Kang  JH,  dan  Kim  JH.  2010.  Evaluation  of  the  relationship  between  two  different  methods  for enumeration fecal indicator bacteria: colony­forming unit and most probable number. J Env Sci (China) 22(6):846­850.

Curiale, MS, T Sons, D McIver, JS McCallister, B Hasley, D Roblee, dan TC Fox. 1991. Dry rehydratable film for enumeration total Coliform and

Escherichia coli in foods : collaborative study. JAOAC Intl 74(4):635­648.

FDA (Food and Drug Administration). 2001. Bacteriological Analytical Manual Appendix 2: Most probable number from serial dilution. FDA. 2002. Bacteriological Analytical Manual Chapter 4: Enumeration of Escherichia coli and the Coliform bacteria.

Hildebrandt,  G  dan  W  Schott.  2001.  Comparison  of  direct  colony  count  methods  and  the  MPN­method  for  quantitative  detection  of  Listeria  in model and field conditions. Berliner und Münchener tierärztliche Wochenschrift 114(11­12):453­64. Hussong, D, JM Damaré, RM Weiner, dan RR Colwell. 1981. Bacteria associated with false­positive most­probable­number Coliform test results for shellfish and estuaries. Appl Environ Microbiol 41(1): 35–45. ISO (International Standard Organization). 2001. ISO/TR 13843:2001. Water quality – guidance on validation of microbiological methods. ISO. 2005. ISO 7251:2005. Microbiology of food and animal feeding stuffs – horizontal methods for the detection and enumeration of presumptive Escherichia coli – most probable number techniques. ISO. 2006. ISO 4831:2006. Microbiology of food and animal feeding stuffs – horizontal methods for the detection and enumeration of Coliforms – most probable number techniques.

ISO.  2007.  ISO  7218:2007(E)  Microbiology  of  food  and  animal  feeding  stuffs  –  general  requirements  and  guidance  for  microbiological examinations.

Gronewold, AD dan RL Wolpert. 2008. Modeling the relationship between most probable number (MPN) and colony­forming unit (CFU) estimates of fecal coliform concentration. Water Res 42(13): 3327­3334.

Kajikawa, H, Y Nagasaki dan A Abe. 1990. Comparison between colony counting method and most probable number method in enumeration of rumen bacteria fermenting specific substrates. Jpn. Journal Zootech. Sci 61(9): 810­814.

Kodaka,  H,  H  Teramura,  T  Nirazuka,  S  Mizuochi.  2006.  Comparison  of  the  compact  dry  CF  with  the  most  probable  number  method  (AOAC Official Method 966.24) for enumeration of Coliform bacteria in raw meats. J AOAC Intl 89(1): 115­126.

Oblinger JL dan JA Koburger. 1975. Understanding and teaching the most probable number technique. J Milk Food Technol 38(9): 540­545. Paulsen,  P,  C  Borgetti,  E  Schopf,  dan  FJM  Smulders.  2008.  Enumeration  of  Enterobacteriaceae  in  various  foods  with  a  new  automated  most­ probable­number method compared with petrifilm and international organization for standardization procedures. J Food Prot 71(2): 376.

Sutton,  Scott.  2006.  Counting  Colonies.  Pharmaceutical  Microbiology  Forum  Newsletter.  12(9).

http://www.microbiol.org/white.papers/WP.count.colony.htm. [2 Oktober 2009].

UNEP (United Nations Environment Programme) / WHO (World Health Organization).1996 Water quality monitoring – a practical guide to the design and implementation of freshwater quality studies and monitoring programmes, Chapter 10 – Microbiological analyses.

USDA (United States Departement of Agriculture) / FSIS (Food Safety and Inspection Service). 2008. Most probable number procedure and tables. Wohlsen,  T,  J  Bates,  G  Vesey,  WA  Robinson  dan  M  Katouli.  2006.  Evaluation  of  the  methods  for  enumerating  coliform  bacteria  from  water samples using precise reference standards. J compilation 2006 The Society for App Microbiol, Letters in App Microbiol 42: 350–356.

3M.  2004.  3M  petrifilm  E.  coli  count  plate  results  from  most  probable  number  (MPN)  results  conversion  table™. http://www.microlabscr.com/resources/MPN+to+PEC+Conversion+Table+Dec03.pdf. [3 Januari 2013].

About indra pradhika

beginner microbiologist View all posts by indra pradhika Tags: No tags  Categories: Most Probable Number

You can leave a response, or trackback from your own site.

Leave a Reply

Your email address will not be published. Name  Email  Website  Uji Turing Publik Terotomatisasi Penuh untuk membedakan Komputer dan Manusia *

two ×   = 2 Comment  You may use these HTML tags and attributes: <a href="" title=""> <abbr title=""> <acronym title=""> <b> <blockquote cite=""> <cite> <code> <del datetime=""> <em> <i> <q cite=""> <strike> <strong> Post Comment

Mesin Pencari

Untuk Pembaca

Situs ini didedikasikan untuk mempermudah pendidikan di Indonesia dalam bidang ilmu mikrobiologi dan ditujukan untuk mahasiswa, analis dan profesi terkait lainnya. Situs ini dibangun secara profesional dan berisi materi yang lengkap dan valid sehingga dapat meningkatkan kepercayaan pembaca terhadap konten yang disuguhkan. Jika terdapat pertanyaan, dapat diajukan di kolom komentar. Diharapkan untuk para ahli dapat memberi saran jika menemukan kesalahan pada web ini. Semoga bermanfaat. email:pradhikaindra86@gmail.com

Daftar Isi Situs

Kata Pengantar Tentang Penulis Sterilisasi Media Pertumbuhan Mikroorganisme Most Probable Number (MPN) Tabel MPN

Komentar Terbaru

indra pradhika on Tabel MPN ade on Tabel MPN puspa on Sterilisasi indra pradhika on Tabel MPN geo on Tabel MPN

survey

Apakah latar belakang Anda ?  Biologi umum  Bakteriologi  Bioteknologi / Genetika  Farmasi  Pertanian  Peternakan  Teknologi pangan  Kedokteran / Kesehatan  kimia  lainnya    Vote    View Results Apakah profesi Anda ?  pelajar  mahasiswa sarjana  mahasiswa pascasarjana  guru / dosen  peneliti / asisten peneliti  analis / laboran  QA / QC operator

 lainnya    Vote    View Results

tautan Metode Standard Mikrobiologi

FDA BAM microbiology methods ISO/TC 147/SC 4 – Microbiological methods ISO/TC 34/SC 9 – Microbiology Official Methods of Analysis of AOAC INTERNATIONAL Standard Methods APHA AWWA WEF

tautan situs bidang ilmu lain

chem­is­try.org sicencebiotech.net

histat

kami mengucapkan :

atas kunjungan anda

Mikrobiologi Praktik

Theme by W3blog