SPEKTROFOTOMETRI DERIVATIF ULTRAVIOLET
UNTUK ESTIMASI KADAR FLAVONOID TOTAL
EKSTRAK MENIRAN
YUDI PRAYUDI HERDIANA
DEPARTEMEN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2007
ABSTRAK
YUDI PRAYUDI HERDIANA. Spektrofotometri Derivatif Ultraviolet untuk Estimasi Kadar Flavonoid Total Ekstrak Meniran. Dibimbing oleh LATIFAH KOSIM DARUSMAN dan MOHAMAD RAFI.
Flavonoid merupakan salah satu golongan senyawa mayor aktif yang terdapat dalam meniran (Phyllanthus niruri L) dan banyak digunakan sebagai antioksidan,
imunostimulan, antiinflamasi, dan sebagainya. Dalam rangka kendali mutu produk obat herbal meniran dan penjaminan khasiatnya, maka diperlukan nilai kadar flavonoid total sebagai penanda golongan senyawa aktif pada meniran. Spektrofotometri derivatif ultraviolet (SDUV) telah dikembangkan dalam penelitian ini untuk menentukan kadar flavonoid total dari ekstrak meniran tanpa proses isolasi dan penambahan reagen pembentuk warna. Metode ini dilakukan berdasarkan pengukuran jarak puncak dari
baseline (Dz) pada spektrum UV derivat ke-3 di panjang gelombang 356 nm dengan
kondisi optimum kecepatan penyapuan 200 nm/menit, orde penghalusan 3, dan jumlah jendela 91. Estimasi kadar flavonoid total yang diperoleh dari metode SDUV sebesar 1.85 %b/b dengan kurva kalibrasi memiliki koefisien korelasi sebesar 0.9982. Selain itu ditentukan pula kadar flavonoid total menggunakan metode referensi, yaitu metode AlCl3 dan diperoleh kadarnya sebesar 2.10 %b/b dengan kurva kalibrasi memiliki koefisien korelasi sebesar 0.9987. Uji statistik antara metode SDUV dengan metode AlCl3 memperlihatkan hasil uji F yang tidak berbeda nyata dan uji t memperlihatkan hasil yang
ABSTRACT
YUDI PRAYUDI HERDIANA. Ultraviolet Derivative Spectrophotometry for Estimation of Total Flavonoid Content in Meniran Extract. Supervised by LATIFAH KOSIM DARUSMAN and MOHAMAD RAFI.
Flavonoids is one of the major active constituent in meniran (Phyllanthus niruri L)
and has been widely used as antioxidant, immunostimulant, antiinflamatory agent, etc. For the quality control of meniran as herbal medicine and to guarantee its effect, total flavonoid content as an active compound in meniran is needed. In this study, ultraviolet derivative spectrophotometry (UVDS) was developed to estimate total flavonoids content in meniran extract without prior isolation and addition of chromogenic reagent. This method was based on measurement of the distance of peak from the baseline (Dz) of third derivative spectra at wavelength 356 nm with optimum parameter such as scan speed 200 nm/minutes, smoothing order 3, and number of point window 91. The estimated total flavonoids content obtained from UVDS method was 1.85% w/w with linearity of the calibration curve showed correlation coefficient of 0.9982 as evaluated by the least square regression method. The total flavonoids content obtained using AlCl3 method as reference methods was 2.10% w/w with linearity of the calibration curve showed correlation coefficient of 0.9987. Statistical test between UVDS and AlCl3 method showed no significant difference in F-test at 95% confidence level while t-test
SPEKTROFOTOMETRI DERIVATIF ULTRAVIOLET
UNTUK ESTIMASI KADAR FLAVONOID TOTAL
EKSTRAK MENIRAN
YUDI PRAYUDI HERDIANA
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada
Departemen Kimia
DEPARTEMEN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2007
Judul Skripsi : Spektrofotometri derivatif ultraviolet untuk estimasi kadar flavonoid total ekstrak meniran
Nama : Yudi Prayudi Herdiana NIM : G44202050
Menyetujui:
Pembimbing I, Pembimbing II,
Prof. Dr. Latifah K. Darusman, M.S. Mohamad Rafi, S.Si. NIP 130536681 NIP 132321454
Mengetahui:
Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut Pertanian Bogor
Prof. Dr. Ir. Yonny Koesmaryono, M.S. NIP 131473999
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala karunia-Nya, sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan September 2006 sampai Mei 2007 ini adalah Spektrofotometri Derivatif Ultraviolet untuk Estimasi Kadar Flavonoid Total Ekstrak Meniran.
Penulis mengucapkan terima kasih kepada Prof. Dr. Ir. Latifah K. Darusman, MS dan Mohamad Rafi, S.Si selaku pembimbing atas segala arahan serta perhatiannya selama penelitian dan penulisan skripsi ini. Terima kasih kepada Pusat Studi Biofarmaka yang telah membantu pendanaan penelitian ini melalui dana penelitian payung Pusat Studi Biofarmaka. Terima kasih penulis ucapkan kepada kedua orang tua tercinta atas segala kasih sayang dan didikan yang diberikan serta kepada semua kakak saya tercinta untuk kebersamaan dan kasih sayangnya. Penghargaan dan terima kasih penulis sampaikan kepada Om Eman, Mbak Salina, Zaim, Mas Heri, Ibu Nunuk, Ndi, Ibu Enung, Bapak
Ridwan, Bapak Manta, dan Bapak Kosasih atas bantuan dan semangat yang diberikan kepada penulis.
Ungkapan terima kasih juga disampaikan untuk Tri, Ari, Maya, Away, Yogi, Obie, Woro, Henny, Miranti, Geril, Dias, Nita, Mirah, Boy, Echa dan teman-teman Kimia angkatan 39 atas kebersamaan, semangat, bantuan, dan dorongannya.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Juli 2007
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Garut pada tanggal 8 Agustus 1984 dari ayah Mohammad Mahbub, BA dan ibu A. Siti Rodiah. Penulis merupakan putra kelima dari lima bersaudara.
Tahun 2002 penulis lulus dari SMA Negeri 1 Leles dan pada tahun yang sama lulus seleksi masuk IPB melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI). Penulis memilih Departemen Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam.
Selama mengikuti perkuliahan, penulis menjadi asisten mata kuliah Spektroskopi pada tahun ajaran 2005/2006, Kimia Analitik I pada tahun ajaran 2006/2007, Kimia Analitik III pada tahun ajaran 2006/2007. Tahun 2004 penulis melaksanakan Praktik Lapangan di PT Coca-Cola Bottling, Sumedang.
DAFTAR ISI
Halaman DAFTAR TABEL ... ix DAFTAR GAMBAR ... ix DAFTAR LAMPIRAN ... ix PENDAHULUAN ... 1 TINJAUAN PUSTAKA Meniran ... 1 Flavonoid ... 2 Spektrofotometri Ultraviolet ... 2Spektrofotometri Derivatif Ultraviolet (SDUV) ... 3
BAHAN DAN METODE Bahan dan Alat ... 4
Metode Penelitian ... 4
HASIL DAN PEMBAHASAN Uji Fitokimia Flavonoid ... 6
Pengukuran Flavonoid Total dengan Metode AlCl3 ... 6
Penentuan Kondisi Optimum SDUV ... 6
Estimasi Kadar Flavonoid Total dengan Metode SDUV ... 7
Perbandingan Metode SDUV dengan MetodeAlCl3... 8
SIMPULAN DAN SARAN Simpulan ... 8
Saran ... 8
DAFTAR PUSTAKA ... 8
DAFTAR TABEL
Halaman
1 Kadar flavonoid total sampel meniran menggunakan metode AlCl3 ... 6
2 Estimasi kadar flavonoid total sampel meniran menggunakan metode SDUV ... 8
3 Hasil uji statistik metode SDUV dan AlCl3 ... 8
DAFTAR GAMBAR
Halaman 1 Bentuk tanaman meniran ... 12 Rumus struktur umum flavonoid ... 2
3 Instrumen spektrofotometer ... 3
4 Spektrum UV dan turunannya ... 3
5 Macam-macam amplitudo dalam SDUV ... 4
6 Kurva standar kuersetin ... 6
7 Spektrum serapan standar kuersetin 25 ppm dan sampel setara 25 ppm flavonoid total ... 6
8 Spektrum turunan ketiga (a) dan keempat (b) dari standar kuersetin dan sampel meniran ... 7
9 Spektrum sampel dengan berbagai kecepatan penyapuan ... 7
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman 1 Diagram alir penelitian ... 122 Penetapan kadar flavonoid total menggunakan metode AlCl3 ... 13
3 Pemilihan orde turunan, penghalusan, dan jumlah jendela optimum ... 14
4 Perbandingan kecepatan penyapuan dan pengukuran sampel ... 14
5 Spektrum-spektrum untuk estimasi kadar flavonoid total pada kondisi optimum ... 16
PENDAHULUAN
Industri farmasi di Indonesia telah dan sedang mengembangkan obat herbal komersial dari ekstrak tanaman yang biasa digunakan oleh masyarakat sebagai obat tradisional (Naik et al. 2004). Agar terjamin
khasiatnya, maka diperlukan kontrol kualitas yang efektif dan efisien terhadap obat herbal yang dihasilkan tersebut. Salah satu kontrol kualitas yang penting dilakukan adalah penentuan kadar senyawa atau golongan senyawa mayor aktif dalam obat herbal seperti flavonoid total pada ekstrak meniran (Phyllanthus niruri L). Meniran diketahui
mempunyai aktivitas antiinflamasi, diuretik, dan imunostimulan sehingga banyak digunakan sebagai obat kanker, radang usus, dan buang air berlebih serta meningkatkan stamina. Selain itu meniran juga mempunyai aktivitas antioksidan yang cukup tinggi dengan IC50 sebesar 3.589 ppm menggunakan
metode DPPH (2,2-difenil-1-pikril-hidrazil) (Herdiana et al. 2006).
Beberapa metode analisis kadar flavonoid total yang biasa dilakukan pada tumbuhan diantaranya adalah spektrofotometri sinar tampak konvensional (Depkes RI 2000), kromatografi gas (KG) (Bankova et al. 1992),
kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) (Oliveira et al. 2001), dan elektroforesis
kapiler (Arce et al. 1998; Dadakova et al.
2001). Metode KG, KCKT, dan elektroforesis kapiler dapat memberikan hasil pengukuran yang akurat tetapi membutuhkan peralatan yang relatif mahal serta waktu analisis yang relatif lama. Teknik spektrofotometri sinar tampak konvensional dengan pewarna tertentu lebih sering digunakan untuk analisis flavonoid total karena lebih sederhana dan lebih mudah penggunaannya. Kelemahan dari teknik ini adalah tidak dapat mendeteksi semua jenis flavonoid serta tidak dapat digunakan dalam contoh dengan matriks yang kompleks (Chang et al. 2002). Oleh karena
itu, diperlukan suatu metode analisis yang lebih cepat, mudah, dan murah tanpa perlu dilakukan isolasi senyawa sasaran untuk estimasi kadar flavonoid total, yaitu metode spektrofotometri derivatif ultraviolet (SDUV). Metode tersebut kemudian dibandingkan dengan metode yang biasa dilakukan untuk menentukan kadar flavonoid total, yaitu metode spektrofotometri sinar tampak konvensional dengan pewarna AlCl3.
Teknik SDUV merupakan pengembangan dari spektrofotometri UV konvensional. Teknik ini digunakan untuk
penentuan jumlah senyawa kimia yang memiliki matriks yang kompleks dan tidak membutuhkan teknik persiapan contoh seperti isolasi senyawa sasaran. Selain itu metode SDUV lebih mudah dilakukan dan memiliki kelebihan antara lain dapat meningkatkan pemisahan pita serapan dari spektrum yang tumpang tindih, menentukan panjang gelombang pemisahan senyawa sasaran dari spektrum yang kompleks, dan mengurangi gangguan yang disebabkan penghamburan dan serapan senyawa lain (Popovic et al.
2000). Tujuan penelitian ini adalah mengembangkan teknik SDUV dalam penggunaannya untuk estimasi kadar flavonoid total ekstrak meniran.
TINJAUAN PUSTAKA
MeniranMeniran (Phyllanthus niruri L) adalah tanaman semak yang memiliki tinggi antara 30-100 cm ini memiliki daun majemuk yang berseling berbentuk bulat telur dengan ujung tumpul dan pangkal membulat (Gambar 1). Bunga berwarna putih menggantung dekat tangkai anak daun dengan buah berbentuk bulat berwarna hijau keunguan. Akar tunggang dengan batang berdiameter 3 mm berwarna hijau dan licin tak berambut. Di Jawa tanaman ini disebut meniran tetapi ditempat lain disebut gasau madungi (Ternate), child pick a back (Inggris), kilanelli (India) dan ye xia zhu (Cina).
Gambar 1 Bentuk tanaman meniran. Tanaman yang biasa digunakan seluruh bagiannya ini memiliki kandungan kimia seperti saponin, flavonoid, garam kalium, dan filantiona (Depkes 2001). Khasiat lain dari
tanaman ini adalah sebagai diuretik, ekspektoran, dan banyak digunakan sebagai obat haid teratur, batu ginjal, mulas serta sakit kuning.
Flavonoid
Flavonoid merupakan suatu senyawa yang temasuk dalam golongan polifenol yang terdapat di dalam kebanyakan tumbuhan, tersebar di dalam biji, kulit buah atau kulit, daun, dan bunga.Kerangka dasar senyawa ini meliputi dua cincin benzena yang berada di sebelah cincin tiga karbon (Gambar 2). Flavonoid dalam tumbuhan jarang ditemukan dalam bentuk tunggal tetapi dalam bentuk campuran. Flavonoid merupakan golongan senyawa yang larut dalam air. Flavonoid dalam tumbuhan terikat sebagai glikosida dan aglikon. Oleh karena itu analisis flavonoid lebih baik dengan memeriksa aglikon. Penggolongan jenis flavonoid dalam jaringan tumbuhan mula-mula didasarkan pada telaah sifat kelarutan dan reaksi warna. Golongan flavonoid, yaitu antosianin, proantosianin, flavonol, flavon, glikoflavon, biflavonil, kalkon, auron, flavonon, dan isoflavon. Flavonoid mengandung sistem aromatik yang terkonjugasi sehingga mununjukkan pita serapan kuat pada daerah spektrum UV dan spektrum tampak. Flavonoid dapat dipisahkan dengan kromatografi (Harborne 1996).
Gambar 2 Rumus struktur umum flavonoid. Efek flavonoid terhadap organisme sangat banyak sehingga dapat menjelaskan mengapa tumbuhan yang mengandung flavonoid dipakai dalam pengobatan tradisional. Flavonoid telah banyak digunakan dalam produk farmasi, kosmetik, dan makanan, baik sebagai senyawa murni maupun sediaan herbal (misalnya ekstrak) dengan aktivitas biologis tertentu. Flavonoid sering bertindak sebagai senyawa pereduksi yang menghambat banyak reaksi oksidasi, baik secara enzim maupun nonenzim. Selain itu flavonoid juga bertindak sebagai penampung radikal hidroksi dan superoksida sehingga dapat melindungi lipid membran terhadap reaksi yang merusak.
Aktivitas antioksidannya dapat menjelaskan mengapa flavonoid tertentu merupakan komponen aktif tumbuhan yang digunakan secara tradisional untuk mengobati gangguan fungsi hati (Robinson 1995). Keadaan stres oksidatif (ketidakseimbangan antara radikal bebas dan antioksidan) membawa pada kerusakan oksidatif mulai dari tingkat sel, jaringan hingga ke organ tubuh menyebabkan terjadinya percepatan proses penuaan dan munculnya penyakit (Sauriasari 2006). Selain dapat mencegah rusaknya sel hidup dalam tubuh, antioksidan juga mencegah terbentuknya peroksida dan kerusakan dalam makanan seperti ketengikan akibat teroksidasinya bahan pangan yang banyak mengandung lemak (Hadisusilo et al.
1999). Menurut Achmad et al. (1990),
flavonoid mempunyai bioaktivitas sebagai antialergi, antihepatotoksik, antitumor, fitohormon, antioksidan, estrogenik, dan insektisida.
Preparasi sampel untuk analisis kadar flavonoid total menggunakan metode KCKT adalah sampel harus diekstrak menggunakan soklet dengan pelarut metanol selama lima jam kemudian disaring. Sebagian filtrat lalu diambil untuk dipisahkan menggunakan kolom silika C18 yang dielusi dengan metanol. Untuk analisis kuantitatif, filtrat kemudian diukur menggunakan KCKT dengan teknik isokratik dan dielusi menggunakan metanol : air (7:3) pada laju 1 ml/menit dan deteksi pada 339 nm (Oliveira
et al. 2001).
Preparasi sampel menggunakan metode elektroforesis kapiler dilakukan dengan menghidrolisis sampel terlebih dahulu, yaitu sampel dicampurkan dengan larutan asam askorbat lalu ditambahkan metanol dan HCl. Setelah itu larutan tersebut dipanaskan selama dua jam (90oC). Larutan tersebut
setelah dingin kemudian dinetralkan menggunakan NaHCO3. Larutan asam
tungstofosfat kemudian ditambahkan pada larutan tersebut lalu disaring menggunakan saringan fibre glass. Kolom SPE (RP-18)
digunakan untuk mengisolasi kuersetin dengan laju alir 15 ml/menit (sebelum kolom tersebut dipakai harus dicuci menggunakan metanol lalu dengan air) (Dadakova et al..
2001).
Spektrofotometri Ultraviolet
Spektrofotometri adalah metode analisis zat berdasarkan interaksi materi dengan radiasi elektromagnetik (Khopkar
1990). Dasar dari spektrofotometri UV-VIS adalah absorpsi. Absorpsi dalam daerah ultraviolet dapat menyebabkan eksitasi elektron yang meliputi transisi elektron π, σ,
n, d, f, dan transfer muatan. Panjang
gelombang serapan merupakan perbedaan ukuran tingkat-tingkat energi dari elektron yang tereksitasi. Oleh karena itu puncak absorpsi (λmaks) dapat dihubungkan dengan
jenis-jenis ikatan yang ada dalam spesies. Sumber radiasi yang dipancarkan dan seberapa besar radiasi yang diserap oleh larutan harus memenuhi hukum Lambert Beer. Hukum Lambert Beer menyatakan bahwa fraksi penyerapan sinar tidak bergantung pada intensitas sumber cahaya tetapi sebanding dengan banyaknya molekul yang menyerap (Sudjadi 1985). Dari hukum Beer dapat diketahui hubungan antara transmitan, tebal cuplikan, dan konsentrasi adalah A = ε c b, dengan ε adalah absortivitas molar, c adalah konsentrasi, dan b adalah tebal sel.
Spektrofotometer adalah suatu instrumen yang digunakan untuk mengukur energi secara relatif jika energi tersebut ditransmisikan, direfleksikan atau diemisikan sebagai fungsi dari panjang gelombang. Instrumen ini terdiri atas beberapa komponen pokok, yaitu sumber radiasi, wadah sampel, monokromator (prisma atau grating), dan detektor (Gambar 3). Prinsip kerja alat tersebut secara umum adalah sebagai berikut: suatu berkas radiasi dilewatkan melalui larutan dengan panjang gelombang tertentu akan diserap (absorpsi) secara selektif dan radiasi lainnya akan diteruskan (transmisi) lalu ditangkap oleh detektor sebagai sinyal listrik yang bisa diukur.
Gambar 3 Instrumen spektrofotometer.
Spektrofotometri Derivatif Ultraviolet (SDUV)
SDUV merupakan kombinasi dari spektrofotometri ultraviolet dan kemometrik yang memerlukan peralatan optik, elektronik, dan metode matematika untuk menghasilkan spektrum turunan (Owen 1996). Kelebihan
metode SDUV antara lain kemampuannya dalam meningkatkan pemisahan pita serapan dari spektrum yang tumpang tindih, mendeteksi dan menentukan panjang gelombang pemisahan senyawa sasaran dari spektrum yang kompleks, dan mengurangi gangguan yang disebabkan penghamburan dan serapan senyawa lain (Popovic et al.
2000). Proses isolasi dan preparasi senyawa aktif yang biasanya diperlukan untuk prosedur analisis kualitatif dan kuantitatif di dalam sistem yang kompleks dapat dihindari karena karakteristik SDUV tersebut.
O’Haver (1979) menyatakan bahwa SDUV merupakan suatu pengukuran spektrum yang berasal dari rata-rata perubahan absorbans dengan panjang gelombang. Spektrofotometri derivatif dirumuskan sebagai berikut (Skujins 1986):
d
λ
dA
= 1 2 1 2λ
-λ
A
-A
dengan A adalah absorbans dan λ adalah panjang gelombang (nm). Alur hubungan antara dA/dλ terhadap nilai λ menghasilkan alur spektrum turunan pertama. Nilai alur spektrum turunan pertama digunakan untuk menentukan d2A/dλ2 yang apabila dialurkan
terhadap λ maka akan menghasilkan alur spektrum turunan kedua. Proses ini terus berulang dengan semakin meningkatnya orde turunan, untuk n turunan maka dibuat alur hubungan antara dnA/dλn terhadap λ (Skujins
1986).
Gambar 4 Spektrum UV dan turunannya. Gambar 4 memperlihatkan spektrum UV dan turunannya. Spektrum turunan orde
sumber cahaya prisma/ grating sampel data yang terbaca detektor Absorbans Absorbans Derivatif 1 Derivatif 2 Derivatif 3 Derivatif 4
pertama berawal dan berakhir dengan nilai absorbans nol, bernilai nol pada λ yang sama dengan λmaks orde nol serta mempunyai
puncak positif dan negatif. Hal inilah yang menjadi karakteristik untuk spektrum turunan ganjil seperti turunan ketiga, kelima, dan seterusnya. Spektrum turunan orde kedua mempunyai puncak negatif pada λ yang sama dengan λmaks orde nol sedangkan turunan
keempat mempunyai puncak positif pada λ yang sama dengan λmaks orde nol (Owen
1996).
Kemampuan untuk menemukan puncak absorpsi pada orde turunan yang lebih tinggi sangat ditentukan oleh rasio sinyal dengan derau (S/N) pada data spektrum asli. Hal yang tidak diinginkan adalah penurunan S/N dengan semakin meningkatnya orde turunan (Owen 1996). Dalam penurunan spektrum yang terpenting adalah meminimalkan derau tanpa mengurangi informasi yang ada. Proses penghalusan spektra (smoothing) yang kemudian dilakukan
variasi jumlah jendela (number of point window) digunakan untuk mengurangi
pengaruh derau tersebut (Popovic et al. 2000).
Namun proses penghalusan data yang terlalu tinggi akan mengakibatkan penyimpangan spektrum dengan menurunkan intensitas dan pemisahan spektrum (Owen 1996).
Analisis kuantitatif spektrum turunan juga menaati hukum Lambert-Beer yang dirumuskan sebagai berikut (Owen 1996): Spektrum orde nol : A = ε b c Turunan pertama : dλ dA = dλ dε bc Turunan ke-n : n dλ A n d = n dλ ε n d bc dengan A adalah absorbans, λ adalah panjang gelombang, ε adalah absortivitas molar, c adalah konsentrasi, dan b adalah tebal sel. Spektrum orde nol menunjukkan konsentrasi analat sebanding dengan absorbans pada panjang gelombang tertentu tetapi pada spektrum turunan konsentrasi analat sebanding dengan amplitudo.
Gambar 5 Macam-macam amplitudo dalam SDUV.
Gambar 5 memperlihatkan macam-macam amplitudo dalam SDUV yaitu DL (amplitudo
puncak ke puncak yang panjang), Ds
(amplitudo puncak ke puncak yang pendek), dan Dz (amplitudo dari garis nol). Kurva
kalibrasi diperoleh dengan memilih amplitudo yang memberikan linearitas terbaik (Skujins 1986).
Metode SDUV telah banyak diaplikasikan untuk analisis kuantitatif senyawa aktif dalam obat maupun sediaan herbal seperti hidrokuinon (Garcia et al 2005),
losartan (Ansari et al. 2004), reserpin (Singh et al. 2004; Rachmanti 2006), teofilin (Agustina 2006), terfenadin (Yanti 2006), yohimbin (Astuti 2006), flavonoid total dalam tanaman dari Brazil (Rolim
et al. 2005), asetaminofen (Burns et al. 2005),
dannordiazepam (Moustafa 2005).
BAHAN DAN METODE
Bahan dan Alat
Bahan-bahan yang digunakan adalah sediaan herbal ekstrak meniran Pusat Studi Biofarmaka sebagai sediaan farmasi yang dianalisis, standar kuersetin, etanol, heksametilentetramina, aseton, HCl, etil asetat, serbuk Mg, amil alkohol, AlCl3, asam
asetat glasial, metanol, dan akuades.
Alat-alat yang digunakan adalah neraca analitik, spektrofotometer UV-Vis 2800 Hitachi, piranti lunak UV solution versi 2.0,
alat pemanas, rotarievaporator, dan alat-alat kaca.
Metode Penelitian
Metode penelitian yang digunakan dalam penelitian ini adalah metode eksperimental yang terdiri atas uji fitokimia flavonoid, tahap pengukuran flavonoid total menggunakan metode AlCl3 (Depkes 2000),
dan pengembangan metode analisis flavonoid total menggunakan SDUV.
Uji Fitokimia Flavonoid
Analisis flavonoid dari ekstrak meniran yang terdapat dalam kapsul dilakukan dengan mengambil ekstrak lalu ditambahkan air secukupnya dan dipanaskan selama lima menit. Setelah itu ditambahkan serbuk Mg, 0.2 ml HCl pekat dan beberapa tetes amil alkohol kemudian larutan dikocok dan dibiarkan memisah. Flavonoid ditandai dengan terbentuknya warna merah cokelat pada lapisan amil alkohol.
Pengukuran Flavonoid Total dengan Metode AlCl3 (Depkes 2000)
Ekstrak ditimbang sebanyak 100 mg lalu dimasukkan ke dalam labu alas bulat. Sistem hidrolisis ditambahkan ke dalamnya, yaitu 1 ml larutan 0.5% b/v heksametilentetramina, 20 ml aseton, dan 20 ml larutan 25% HCl dalam air. Hidrolisis dilakukan dengan pemanasan sampai mendidih selama 30 menit. Campuran hasil hidrolisis disaring ke dalam labu takar 100 ml. Residu hidrolisis ditambah 20 ml aseton untuk dididihkan kembali selama 10 menit. Penambahan aseton dan pendidihan ini dilakukan sebanyak dua kali. Filtrat dikumpulkan ke dalam labu takar. Setelah labu takar dingin maka volume ditepatkan sampai 100 ml dan dikocok hingga tercampur sempurna. Filtrat hasil hidrolisis dalam labu takar diambil sebanyak 20 ml, dimasukkan ke dalam corong pisah dan ditambahkan 20 ml akuades. Setelah itu dipartisi dengan 15 ml etilasetat dan dilanjutkan dengan 10 ml etilasetat sebanyak dua kali. Fraksi etilasetat dikumpulkan ke dalam labu takar 50 ml kemudian ditepatkan dengan etilasetat sampai 50 ml. Prosedur ini dilakukan sebanyak lima kali ulangan.
Pemeriksaan spektrofotometri diawali dengan memindahkan 10 ml larutan fraksi etilasetat ke dalam labu takar 25 ml kemudian ditambahkan 2 ml larutan 2 g AlCl3 dalam
100 ml larutan asam asetat glasial 5% v/v (dalam metanol). Larutan asam asetat glasial 5% v/v ditambahkan secukupnya sampai tepat 25 ml. Sebagai standar digunakan kuersetin murni dengan konsentrasi 2, 4, 6, 8, dan 10 ppm kemudian diukur pada λmaks 370.8 nm.
Pengembangan Metode Analisis Flavonoid Total dengan SDUV
Preparasi sampel dan larutan standar untuk penentuan kondisi optimum
Sampel meniran dengan kadar flavonoid totalnya telah diketahui dari metode AlCl3 kemudian ditimbang dan dibuat
konsentrasinya setara 25 ppm flavonoid total. Setelah itu sampel tersebut dimasukkan ke dalam labu alas bulat. Sistem hidrolisis ditambahkan ke dalamnya, yaitu 1 ml larutan 0.5% b/v heksametilentetramina, 20 ml aseton, dan 20 ml larutan 25% HCl dalam air. Hidrolisis dilakukan dengan pemanasan sampai mendidih selama 30 menit. Campuran hasil hidrolisis kemudian disaring. Residu hidrolisis ditambah 20 ml aseton untuk dididihkan kembali sebentar. Penambahan
aseton dan pendidihan ini dilakukan sebanyak dua kali. Filtrat hasil penyaringan kemudian digabungkan lalu diuapkan menggunakan
rotarievaporator untuk menghilangkan pelarut aseton. Setelah pelarut asetonnya
hilang hasilnya kemudian dilarutkan menggunakan etanol lalu dimasukan ke dalam labu takar setelah itu ditera menggunakan etanol sampai 100 ml.
Larutan stok standar kuersetin 100 ppm dibuat dengan cara ditimbang serbuk kuersetin sebanyak 5 mg lalu dimasukkan ke dalam gelas piala kemudian dilarutkan dengan etanol setelah itu dimasukan ke dalam labu takar 50 ml lalu ditera menggunakan etanol. Sebanyak 6.25 ml dari larutan tersebut diambil untuk dimasukkan ke dalam labu takar 25 ml, setelah itu ditera sampai 25 ml menggunakan etanol.
Penentuan kondisi optimum SDUV
Parameter kondisi optimum yang dikerjakan adalah kecepatan penyapuan (scan speed), orde turunan (derivative order), penghalusan (smoothing), dan jumlah jendela
(number of point window).
Larutan standar dan sampel ekstrak meniran setara 25 ppm diukur serapannya pada panjang gelombang 200-600 nm menggunakan spektrofotometer UV-Vis Hitachi 2800. Spektrum standar dan sampel yang diperoleh digabungkan ke dalam satu tampilan (overlay).
Parameter yang dilakukan untuk optimasi adalah mencari kecepatan penyapuan terbaik (100, 200, 400, dan 800 nm/menit) yang diikuti dengan memasukan variasi orde turunan 1, 2, dan 3, variabel penghalusan 2, 3, dan 4, serta jumlah jendela 7, 9, 11,...,99. Tujuan dari optimasi ini adalah untuk mendapatkan puncak spektrum standar dan sampel meniran yang berhimpit.
Estimasi kadar flavonoid total dalam sampel
Sampel meniran ditimbang untuk dibuat larutan setara 15 ppm flavonoid total yang diekspresikan sebagai kuersetin. Larutan sampel diukur serapannya pada panjang gelombang 200-600 nm. Kurva standar yang dibuat, yaitu 5, 10, 15, 20, dan 25 ppm dengan mengencerkan larutan stok standar 100 ppm. Konsentrasi flavonoid total dalam sampel ditentukan dengan memasukkan nilai amplitudo sampel ke dalam persamaan garis kurva standar pada kondisi yang optimum.
HASIL DAN PEMBAHASAN Uji Fitokimia Flavonoid
Penelitian ini dimulai dengan melakukan uji fitokimia flavonoid terlebih dahulu, yaitu untuk mengetahui apakah sampel yang akan digunakan tersebut terdapat flavonoid atau tidak. Dari hasil uji tersebut terdapat lapisan berwarna merah cokelat pada lapisan amil alkohol. Hal ini menandakan bahwa sampel meniran tersebut mengandung flavonoid.
Pengukuran Flavonoid Total dengan Metode AlCl3 (Depkes 2000) Pengukuran flavonoid total ini dimulai
dengan melakukan hidrolisis terhadap sampel. Hal ini bertujuan flavonoid dalam bentuk
glikosida (flavonoid yang masih terikat dengan gugus gula) dapat terurai menjadi flavonoid dalam bentuk aglikon (flavonoid tunggal) karena analisis flavonoid akan lebih baik jika berada dalam bentuk aglikonnya (Harborne 1996).
Prinsip dari metode pewarnaan ini adalah AlCl3 membentuk kompleks asam yang stabil
dengan C-4 gugus keto, lalu dengan C-3 atau C-5 gugus hidroksil dari flavon dan flavonol. Selain itu AlCl3 juga membentuk kompleks
asam yang labil dengan gugus ortodihidroksil pada cincin A atau B dari flavonoid (Chang et al. 2002) sehingga akan mempunyai serapan maksimum pada panjang gelombang 370.8 nm.
Lampiran 2 memperlihatkan kenaikan nilai absorbans seiring dengan semakin tingginya konsentrasi standar. Persamaan garis yang diperoleh adalah y = 0.0528 +
0.011x dengan koefisien korelasi sebesar
0.9987 (Gambar 6). Kadar flavonoid total yang didapatkan dari metode ini mempunyai rerata sebesar 2.10 %b/b (Tabel 1).
y = 0,011x + 0,0528 R2 = 0,9974 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0 5 10 15 Konsentrasi (ppm ) Ab s o rb a n s
Gambar 6 Kurva standar kuersetin.
Tabel 1 Kadar flavonoid total sampel meniran menggunakan metode AlCl3
Sampel Kadar flavonoid (%b/b)
1 2.16 2 2.20 3 2.05 4 2.09 5 2.01 Rerata = 2.10 Batas galat = 0.10
Penentuan kondisi optimum SDUV
Serapan sampel pada orde nol tidak dapat langsung digunakan untuk mengukur
kadar flavonoid totalnya. Hal ini dikarenakan di dalam serapan sampel tersebut tidak sepenuhnya merupakan komponen flavonoid melainkan banyak senyawa lain seperti alkaloid, tanin dan lain-lain yang dapat mengakibatkan serapannya berbeda dengan standar. Gambar 7 memperlihatkan walaupun sampel tersebut diukur dalam keadaan setara 25 ppm flavonoid akan tetapi mempunyai puncak serapan yang berbeda dengan standar kuersetin 25 ppm.
Penentuan kondisi optimum yang meliputi orde turunan, penghalusan, jumlah jendela dan kecepatan penyapuan (nm/menit) ini adalah untuk mencari keadaan standar dan sampel yang memiliki konsentrasi sama dalam keadaan berhimpit pada kisaran panjang gelombang tertentu. 2 0 0 3 0 0 4 0 0 5 0 0 6 0 0 n m 0 . 0 0 . 5 1 . 0 1 . 5 2 . 0 2 . 5 3 . 0
Gambar 7 Serapan standar kuersetin 25 ppm ( ) dan sampel setara 25 ppm flavonoid total ( ). Penghalusan dan jumlah jendela yang optimum diperlukan untuk mengatasi efek derau yang diakibatkan oleh matriks sampel dengan semakin besarnya orde turunan. Apabila orde turunan terlalu rendah, derau sulit dibedakan dari analat di dalam spektrum yang kasar sedangkan apabila terlalu tinggi, maka dapat mengakibatkan berkurangnya intensitas dan resolusi spektrum (Brereton 2003). Kondisi optimum orde turunan, penghalusan dan jumlah jendela yang dipilih adalah turunan 3, penghalusan 3 dan jumlah
jendela 91 pada panjang gelombang 356 nm (Lampiran 3). Kondisi tersebut dipilih setelah mendapatkan spektrum standar dan sampel yang berhimpit (Gambar 8), lalu hasilnya dibandingkan dari bentuk spektrum dan linieritasnya yang paling tinggi. Panjang gelombang yang dipilih tersebut untuk mengukur amplitudo adalah pada 356 nm karena panjang gelombang tersebut merupakan puncak yang menandakan terjadinya serapan oleh komponen flavonoid di dalam sampel. 2 0 0 3 0 0 4 0 0 5 0 0 6 0 0 n m - 0 .0 0 0 0 5 0 .0 0 0 0 0 0 .0 0 0 0 5
(a) 2 0 0 3 0 0 4 0 0 5 0 0 6 0 0 n m -0 .0 0 0 0 5 0 .0 0 0 0 0 0 .0 0 0 0 5 0 .0 0 0 1 0 (b)
Gambar 8 Spektrum turunan ketiga (a) dan keempat (b) dari standar kuersetin dan sampel meniran. Perbandingan kecepatan penyapuan antara 100, 200, 400, dan 800 nm/menit, ternyata kecepatan 800 nm/menit terlihat sangat berbeda bentuk spektrum yang dihasilkannya sehingga tidak dipilih (Gambar 9). Berbeda dengan kecepatan 800 nm/menit, ternyata kecepatan 100, 200, dan 400 terlihat tidak berbeda antara satu dengan yang lain.
2 0 0 3 0 0 4 0 0 5 0 0 n m - 0.00005 - 0.00004 - 0.00003 - 0.00002 - 0.00001 0.00000 0.00001 0.00002 0.00003 0.00004 0.00005 0.00006
Gambar 9 Spektrum serapan sampel dengan kecepatan penyapuan 100 ( ), 200 ( ), 400 ( ) dan 800 nm/menit ( ).
Walaupun pada saat mencari keadaan sampel dan standar yang berhimpit pada kecepatan penyapuan 100, 200, dan 400 nm/menit terlihat hampir sama akan tetapi ketika pengukuran sampel dengan dimasukannya parameter optimasi (turunan, orde penghalusan dan jumlah jendela) ternyata pada 400 nm/menit terlihat ada beberapa konsentrasi yang berada diluar rentang konsentrasi kurva standar sehingga kecepatan tersebut tidak dipilih. Kecepatan penyapuan yang dipilih untuk estimasi kadar flavonoid total ini adalah 200 nm/menit karena nilai konsentrasi yang dihasilkan tidak berbeda nyata secara statistik dengan 100 nm/menit (Lampiran 4), dan memerlukan waktu yang lebih singkat. Kecepatan penyapuan artinya kecepatan interval pembacaan data panjang gelombang per satuan menit sehingga semakin besar nilai kecepatan penyapuan maka semakin banyak informasi yang hilang sedangkan apabila kecepatan penyapuan terlalu kecil maka waktu yang diperlukan untuk pengukuran terlalu lama.
Amplitudo yang dipilih yaitu Dz, yaitu
jarak antara puncak ke baseline. Hal ini
dikarenakan puncak serapan yang dihasilkan hanya terdapat satu puncak saja (Lampiran 5) sedangkan untuk mengukur DL dan Ds
diperlukan puncak serapan yang lebih dari satu.
Estimasi Kadar Flavonoid Total dengan Metode SDUV
Spektrum dari sampel setelah diukur pada kondisi optimum menghasilkan rerata estimasi kadar flavonoid total sebesar 1.85 %b/b (Tabel 2). Persamaan garis yang diperoleh adalah y = 0.074x + 0.015 dengan koefisien korelasi sebesar 0.9982 (Lampiran 4). Nilai kemiringan memberi informasi tentang kepekaan suatu metode. Metode SDUV mempunyai kemiringan yang kecil, artinya perubahan konsentrasi menyebabkan perbedaan pembacaan yang tidak terlalu besar. Titik potong terhadap sumbu y
(intersep) menunjukkan adanya pengaruh
matriks pada larutan blanko. Pengaruh matriks akan mempengaruhi kemampuan metode untuk mengukur konsentrasi yang terkecil (limit deteksi). Metode ini memberikan estimasi kadar flavonoid dengan batas galat (tingkat kepercayaan 95%) 0.08 %b/b. %SBR yang dihasilkan adalah 4.29 %. Nilai %SBR tersebut menurut AOAC termasuk dalam kategori sedang.
Standar kuersetin
Tabel 2 Estimasi kadar flavonoid total sampel meniran menggunakan metode SDUV
Sampel Kadar flavonoid %b/b
1 1,87 2 1,79 3 1,83 4 1,93 5 1,73 6 1,93 Rerata = 1,85 Batas galat 0.08
Perbandingan Metode SDUV dengan MetodeAlCl3
Hasil analisis estimasi kadar flavonoid total menggunakan SDUV dibandingkan secara statistika dengan metode AlCl3 sebagai
metode referensi menggunakan uji t dan uji F
(Lampiran 6 dan Tabel 3). Hasil uji F
memperlihatkan bahwa kedua metode tersebut tidak berbeda nyata akan tetapi pada uji t
kedua metode tersebut berbeda nyata dengan tingkat kepercayaan 95 %. Nilai t
hitung yang didapat adalah 5.2461 lebih besar daripada t tabel sebesar 2.262. Perbedaan
konsentrasi yang berbeda nyata dari kedua metode tersebut bisa diakibatkan karena matriks yang terdapat dalam sampel masih sangat kompleks sehingga serapan flavonoid pada kondisi optimum menjadi terhambat. Kemungkinan lain bisa diakibatkan karena di dalam meniran tersebut terdapat senyawa-senyawa flavonoid selain kuersetin yang bisa menggeser serapan maksimumnya (Gambar 7). Hal tersebut bisa menghasilkan serapan yang tidak identik antara sampel dengan standar sehingga penentuan kondisi optimumnya menjadi kurang tepat. Validasi metode tidak dapat dilakukan karena kedua metode memberikan hasil yang berbeda nyata secara statistik.
Tabel 3 Hasil uji statistik metode SDUV dan metode AlCl3
SIMPULAN DAN SARAN
SimpulanRerata estimasi kadar flavonoid total yang diperoleh menggunakan metode SDUV adalah 1.85 %b/b yang diukur dengan amplitudo Dz pada panjang gelombang 356
nm dengan kondisi optimum kecepatan penyapuan 200 nm/menit, orde turunan 3, penghalusan 3, dan jumlah jendela 91. Uji statistik antara metode AlCl3 dan SDUV
memperlihatkan hasil uji F yang tidak
berbeda nyata dengan nilai F hitung 0.9625,
sedangkan uji t memperlihatkan hasil yang
berbeda nyata dengan nilai t hitung 5.2461. Pemilihan kondisi optimum belum memberikan hasil yang baik.
Saran
Perlu dilakukan penentuan kondisi optimum lebih lanjut seperti jenis ekstraksi, pemilihan pelarut, dan waktu ekstraksi yang lebih tepat terhadap sampel meniran tersebut, sehingga menghsilkan ketelitian dan sensitifitas lebih baik untuk dilakukan validasi matode.
DAFTAR PUSTAKA
Achmad SA, EH Hakim, Makmur. 1990. Flavonoid dan phyto medica, kegunaan dan prospek. Phyto Medica 1:120-127.
Agustina I. 2006. Metode cepat untuk kuantifikasi teofilin dalam sediaan farmasi secara spektrofotometri derivatif ultraviolet [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.
Ansari M, Kazemipour M, Baradaran M, Jalalizadeh H. 2004. Derivative spectrophotometric method for determination losartan in pharmaceutical formulations. J Pharm Biomed Anal
30:1183-1189.
Arce L, Rios A, Valcarcel M. 1998. Determination of anticarcinogenic polyphenols present in green tea using capillary electrophoresis coupled to a flow injection system. J Chromatogr A 872:
113-120.
Astuti W. 2006. Metode cepat untuk penentuan kadar yohimbin dalam
Parameter
statistika Metode SDUV
Metode AlCl3 Persamaan y=0.074x+0.015 y=0.011x+0.0528
Koefisien korelasi 0.9982 0.9987
Kadar flavonoid
total (%b/b) 1.85 2.10
Uji F 0.9625
Pausinystalia yohimbe dan produk
komersialnya secara spektrofotometri derivatif ultraviolet [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.
Bankova V, Christov R, Stoev G, Popov S. 1992. Determination of phenolics from propolis by capillary gas chromatography. J Chromatogr 307:
150-153
.
Brereton RG. 2003. Data Analysis for the Laboratory and Chemical Plant.
Chichester: John Wiley & Sons.
Burns DT, Tungkananuruk N, Kasemsumran S. 2005. Derivative spectrophotometric determination of acetaminophen by the Formation of [Fe(II)-(2,2'-bipyridyl)3]2+.
Chem Anal (Warsaw) 50: 475
Chang CC, Yang MH, Wen HM, Chern JC. 2002. Estimation of total flavonoid content in propolis by two complementary colorimetric methods. J Food Drug Anal
10: 178-182.
Dadakova E, Prochazkova E, Krizek M. 2001. Application of micellar electrokinetic capillary chromatography for quantitative analysis of quercetin in plant materials.
Electrophoresis 22: 1573-1578.
Depkes. 2000. Penentuan Standar Umum Ekstrak Tumbuhan Obat. Jakarta: Depkes
RI.
Depkes. 2001. Inventaris Tanaman Obat Indonesia (1). Jakarta : Badan Penelitian
dan Pengembangan Kesehatan.
Garcia PL, Santoro MIRM, Hackman ERMK, Singh AK. 2005. Development and validation of a HPLC and a UV derivative spectrophotometric methods for determi-nation of hydroquinone in gel and cream preparations. J Pharm Biomed Anal 39:
764-768.
Hadisusilo S, Komalasari L, Kosela S. 1999. Uji Aktivitas Antioksidan Biji Kluwek.
Seminar Nasional Kimia Bahan Alam.
M46: 371-377.
Harborne J B. 1996. Metode Fitokimia. Edisi Kedua. Padmawinata dan Soediro,
penerjemah. Bandung : ITB. Terjemahan dari: Phytochemicals Method.
Herdiana YP, Pagudiharto G, Siman MH, Febrianti R, Zamri RJ. 2006. Daya Antioksidan Ekstrak Tumbuhan Meniran (Phyllanthus niruri Linn), Daun Sendok
(Plantago major Linn) dan Som Jawa
(Talinum paniculatum (jack) Gaertn)
dengan Metode Tiosianat dan DPPH [laporan PKMP]. Bogor: IPB.
Khopkar SM. 1990. Konsep Dasar Kimia Analitik. Saptorahardjo A, penerjemah. Jakarta: UI Press. Terjemahan dari: Basic Concepts of Analytical Chemistry.
Moustafa NM. 2005. Direct derivative spectrophotometric determination of nordiazepam in presence of its degradation product. J Saudi Pharm 13: 333-338.
Naik GH, Priyadarsini KI, Mohan H. 2004. Evaluating the antioxidant activity of different plant extracts and herbal formulations. Res Chem Intermed 31:
145-151
.
Oliveira BH, Nakashima T, Filho JDS, Frehse FL. 2001. HPLC analysis of flavonoid in
Eupatorium Littorale. J Braz Chem Soc
12: 243-246.
Owen T. 1996. Fundamentals of UV-visible Spectroscopy. Waldbronn:
Hewlett-Packard.
O’Haver TC. 1979. Potential clinical applications of derivative and wavelength modulation spectrometry. Clin Chem 25:
1548-1553.
Popovic GV, Pfendt LB, Stefanovic VM. 2000. Analytical application of derivative spectrophotometry. J Serb Chem Soc 6:
457-472.
Rachmanti WD. 2006. Metode cepat untuk kuantifikasi reserpin dalam obat dan ekstrak Rauwolfia serpentina secara
spektrofotometri derivatif ultraviolet (UV) [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.
Robinson T. 1995. Kandungan Organik Tumbuhan Tinggi. Ed ke-6. Padmawinata
Terjemahan dari The Organic Constituent of Higher Plants.
Rolim A et al. 2005. Total flavonoids
quantification from O/W emulsion with extract of Brazilian plants. Int J Pharm
308: 107-114.
Sauriasari R. 2006. Mengenal dan menangkal radikal bebas. www.hmetro.com.my/Curre-nt_News/HM/Sunday/Kesihatan/20060205 132221/Article/indexs_html - 52k
.
Singh DK, Srivastava B, dan Sahu A. 2004. Spectrophotometry determination of Rauwolfia Alkaloids:Estimation of reserpine in pharmaceuticals. Anal Sci
20:571-573.
Skujins S. 1986. Application of UV-Visible Derivatif Spectrophotometry.
Steinhauser-tasse: Varian AG.
Sudjadi. 1985. Penentuan Struktur Senyawa Organik. Jakarta: Ghalia Indonesia.
Yanti N. 2006. Metode cepat analisis terfenadin dalam sediaan farmasi secara spektrofotometri derivatif ultraviolet [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.
Lampiran 1 Diagram alir penelitian
Ekstrak meniran
Uji Fitokimia
Flavonoid
Ekstrak hasil
hidrolisis
Hidrolisis
Metode AlCl
3Metode SDUV
Lampiran 2 Penetapan konsentrasi flavonoid total menggunakan metode AlCl3 Data absorbans kurva standar kuersetin
Standar kuersetin (ppm) Absorbans
2 0.077 4 0.095 6 0.117 8 0.141 10 0.164 y = 0.011x + 0.0528 R2 = 0.9974 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0 5 10 15 Kons e ntras i (ppm ) A b so rb an s
Kurva standar kuersetin
Data konsentrasi flavonoid total dalam simplisia kapsul meniran
sampel bobot simplisia (gram) absorbans flavonoid (ppm) %b/b
1 0.1004 0.148 8.6545 2.16 2 0.1003 0.150 8.8364 2.20 3 0.1009 0.144 8.2909 2.05 4 0.1008 0.150 8.8364 2.09 5 0.1009 0.142 8.1091 2.01 Rerata = 2.10 Simpangan Baku = 0.0779 ket: bobot simplisia yang ditimbang: 1 = 0.1004 g 4 = 0.1008 g
2 = 0.1003 g 5 = 0.1009 g 3 = 0.1009 g
Contoh perhitungan pada sampel 1: y = bx + a y = 0.011x + 0.0528 0.148 = 0.011x + 0.0528 x = 8.6545 ppm %b/b = [flav. total]ppm x 10 ml x 100/20 x 50/10 x 100% bobot simplisia (mg) = 8.6545 mg/1000ml x 10 ml x 25 x 100 % 100.4 mg = 2.16 %b/b
Batas galat (selang kepercayaan 95%) = n SB t × = 5 0.0779 2.776× = 0.10 %b/b
Simpangan Baku Relatif (%SBR) = 100
x SB × = 100 10 . 2 0779 . 0 × = 3.71 %
Lampiran 3 Pemilihan orde turunan, penghalusan, dan jumlah jendela optimum turunan Penghalusan jendela jumlah λ (nm) persamaan garis regresi
3 3 85 356.0 y = 0.0785x+0.0375 0.9979 87 356.0 y = 0.076x + 0.04 0.9986 89 356.0 y = 0.0745x+0.0325 0.9978 91 356.0 y = 0.073x+0.025 0.9992 4 85 356.5 y = 0.0785x+0.0325 0.9983 87 356.5 y = 0.0755x+0.0525 0.9984 89 356.5 y = 0.074x+0.03 0.9989 91 356.5 y = 0.074x+0.01 0.9981
Lampiran 4 Perbandingan kecepatan penyapuan dan pengukuran sampel • Kecepatan penyapuan 100 nm/menit
Data amplitudo kurva standar
Standar standar kuersetin (ppm) amplitudo
1 5 0.375 2 10 0.750 3 15 1.150 4 20 1.500 5 25 1.825 y = 0,073x + 0,025 R2 = 0,9985 0 0,5 1 1,5 2 0 5 10 15 20 25 30 Konsentrasi (ppm) A m pl it ud o
kurva standar kuersetin Data kadar flavonoid total sampel meniran
Sampel amplitudo konsentrasi (ppm) %b/b 1 1.000 13.3562 1.88 2 0.950 12.6712 1.79 3 0.975 13.0137 1.84 4 1.000 13.3562 1.89 5 0.975 13.0137 1.83 6 1.050 14.0411 1.98 Rerata = 1.87 Simpangan Baku = 0.0655
Lanjutan Lampiran 4
Batas galat (selang kepercayaan 95%) =
n SB t × = 6 0655 . 0 571 . 2 × = 0.07 %b/b
Simpangan Baku Relatif (%SBR) = ×100
x SB = 100 87 . 1 0655 . 0 × = 3.50 %
• Kecepatan penyapuan 200 nm/menit Data amplitudo kurva standar
Standar standar kuersetin (ppm) Amplitudo
1 5 0.350 2 10 0.775 3 15 1.150 4 20 1.525 5 25 1.825 y = 0,074x + 0,015 R2 = 0,9965 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 2 0 5 10 15 20 25 30 Konsentrasi (ppm) A m pl it udo
Kurva standar kuersetin Data kadar flavonoid total sampel meniran
sampel amplitudo konsentrasi (ppm) %b/b
1 1.000 13.3108 1.87 2 0.950 12.6351 1.79 3 0.975 12.9730 1.83 4 1.025 13.6486 1.93 5 0.925 12.2973 1.73 6 1.025 13.6486 1.93 rerata = 1.85 Simpangan Baku = 0.0794 Batas galat (selang kepercayaan 95%) =
n SB t × = 6 0794 . 0 571 . 2 × = 0.08
Simpangan Baku Relatif (%SBR) = ×100
x SB = 100 85 . 1 0794 . 0 × = 4.29 %
Uji t dan uji F antara kecepatan penyapuan 100 dan 200 nm/menit S1 (SB kecepatan penyapuan 100 nm/menit) = 0.0655 S2 (SB kecepatan penyapuan 200 nm/menit) = 0.0794
Lanjutan Lampiran 4 F hitung = 2 2 200) sc (SB 100) sc (SB = 2 2 ) 0794 . 0 ( ) 0.0655 ( = 0.6805
F tabel untuk n-1 pada selang kepercayaan 95% = 5.050 F hitung < F tabel (tidak berbeda nyata)
S =
)
2
(
)
1
(
)
1
(
2 1 2 2 2 2 1 1−
+
−
+
−
n
n
s
n
s
n
= 0.0728 t hitung = 2 1 2 11
1
)
(
n
n
s
x
x
+
−
=6
1
6
1
0728
.
0
)
85
.
1
87
.
1
(
+
−
= 0.4784t tabel untuk n1+n2-2 = 10 pada selang kepercayaan 95% = 2.228 t hitung < t tabel (tidak berbeda nyata)
Lampiran 5 Spektrum-spektrum untuk estimasi kadar flavonoid total pada kondisi optimum 2 0 0 3 0 0 4 0 0 n m - 0 . 0 0 0 0 5 - 0 . 0 0 0 0 4 - 0 . 0 0 0 0 3 - 0 . 0 0 0 0 2 - 0 . 0 0 0 0 1 0 . 0 0 0 0 0 0 . 0 0 0 0 1 0 . 0 0 0 0 2 0 . 0 0 0 0 3 0 . 0 0 0 0 4 0 . 0 0 0 0 5
Gambar spektrum serapan sampel ulangan 1
2 0 0 3 0 0 4 0 0 n m - 0 . 0 0 0 0 5 - 0 . 0 0 0 0 4 - 0 . 0 0 0 0 3 - 0 . 0 0 0 0 2 - 0 . 0 0 0 0 1 0 . 0 0 0 0 0 0 . 0 0 0 0 1 0 . 0 0 0 0 2 0 . 0 0 0 0 3 0 . 0 0 0 0 4 0 . 0 0 0 0 5
Lanjutan Lampiran 5 2 0 0 3 0 0 4 0 0 n m - 0 . 0 0 0 0 5 - 0 . 0 0 0 0 4 - 0 . 0 0 0 0 3 - 0 . 0 0 0 0 2 - 0 . 0 0 0 0 1 0 . 0 0 0 0 0 0 . 0 0 0 0 1 0 . 0 0 0 0 2 0 . 0 0 0 0 3 0 . 0 0 0 0 4 0 . 0 0 0 0 5
Gambar spektrum serapan sampel ulangan 3
2 0 0 3 0 0 4 0 0 n m - 0 . 0 0 0 0 5 - 0 . 0 0 0 0 4 - 0 . 0 0 0 0 3 - 0 . 0 0 0 0 2 - 0 . 0 0 0 0 1 0 . 0 0 0 0 0 0 . 0 0 0 0 1 0 . 0 0 0 0 2 0 . 0 0 0 0 3 0 . 0 0 0 0 4 0 . 0 0 0 0 5
Gambar spektrum serapan sampel ulangan 4
2 0 0 3 0 0 4 0 0 n m - 0 . 0 0 0 0 5 - 0 . 0 0 0 0 4 - 0 . 0 0 0 0 3 - 0 . 0 0 0 0 2 - 0 . 0 0 0 0 1 0 . 0 0 0 0 0 0 . 0 0 0 0 1 0 . 0 0 0 0 2 0 . 0 0 0 0 3 0 . 0 0 0 0 4 0 . 0 0 0 0 5
Lanjutan Lampiran 5
2 0 0 3 0 0 4 0 0 n m - 0 . 0 0 0 0 5 - 0 . 0 0 0 0 4 - 0 . 0 0 0 0 3 - 0 . 0 0 0 0 2 - 0 . 0 0 0 0 1 0 . 0 0 0 0 0 0 . 0 0 0 0 1 0 . 0 0 0 0 2 0 . 0 0 0 0 3 0 . 0 0 0 0 4 0 . 0 0 0 0 5Gambar spektrum serapan sampel ulangan 6 Ket : sampel standar 5 ppm standar 10 ppm standar 15 ppm standar 20 ppm standar 25 ppm
Lampiran 6 Penentuan uji t dan uji F antara metode SDUV dengan metode AlCl3 S1 (SB metode AlCl3) = 0.0862 S2 (SB metode SDUV) = 0.0784 F hitung = 2 2 SDUVf) metode (SB AlCl3) metode (SB = 2 2 ) 0794 . 0 ( ) 0779 . 0 ( = 0.9625
F tabel pada selang kepercayaan 95% = 5.192 F hitung < F tabel (tidak berbeda nyata) S =
)
2
(
)
1
(
)
1
(
2 1 2 2 2 2 1 1−
+
−
+
−
n
n
s
n
s
n
= 0.0787 t hitung = 2 1 2 11
1
)
(
n
n
s
x
x
+
−
=6
1
5
1
0787
.
0
)
85
.
1
10
.
2
(
+
−
= 5.2461t tabel pada selang kepercayaan 95% = 2.262 t hitung > t tabel (berbeda nyata)
