PENGARUH EKSTRAK KELOPAK BUNGA ROSELA
(
Hibiscus sabdariffa
L) TERHADAP PENGHAMBATAN
PROLIFERASI SEL FIBROBLAS KELOID MANUSIA
DISERTASI
IMAM BUDI PUTRA
NIM : 088102007
PROGRAM DOKTOR (S-3) ILMU KEDOKTERAN
FAKULTAS KEDOKTERAN
UNIVERSITAS SUMATERA UTARA
MEDAN
C. Tanaman Rosela ... 23
1.Taksonomi... ... 23
2. Morfologi... ... 23
3. Kandungan kimia dan nilai gizi ... 25
4. Interaksi dengan kolagen, fosfolipid dan proteoglikan. ... 26
5. Ekstrak Hibiscus (Anthocyanin) sebagai induksi apoptosis ... 26
D. Prinsip Pemeriksaan Human TGF-β1 ... 27
E. Prinsip Pemeriksaan dengan Spektrofotometer ... 29
F. Kerangka Teori ... 30
A. Uji Fitokimia Ekstrak Kelopak Bunga Rosela ... 32
1. Desain penelitian ... 32
2. Tempat penelitian ... 32
3. Definisi operasional ... 32
4. Bahan, alat dan cara kerja ... 34
5. Diagram kerja penyiapan ekstrak ... 37
6. Penetapan standardisasi simplisia ... 38
7. Diagram kerja penetapan standardisasi simplisia ... 41
8. Uji fitokimia ekstrak kelopak bunga rosela ... 41
9. Diagram kerja uji fitokimia ... 45
10. Analisis data ... 45
B. Uji Ekstrak Kelopak Bunga Rosela untuk Penghambatan Pertumbuhan Sel Fibroblas Keloid Manusia ... 45
1. Pembuatan kultur primer sel fibroblas keloid manusia ... 45
b. Alat ... 46
d. Definisi operasional variabel apoptosis ... 48
e. Bahan ... 48
E. Waktu Penelitian ... 60
F. Bahan Eksperimen (besar sampel) ... 60
G. Etika penelitian ... 61
BAB IV HASIL PENELITIAN ... 62
A. Hasil Uji Fitokimia ... 62
B. Hasil Uji Penghambatan Pertumbuhan Sel Fibroblas Keloid Manusia ... 64
1. Deteksi apoptosis (Tunel assay) ... 64
2. Pengukuran kadar TGF-β1 ... 66
C. Hasil Uji Sitotoksitas Ekstrak Kelopak Bunga Rosela terhadap Sel Fibroblas Kulit Normal Manusia ... 68
BAB V PEMBAHASAN ... 69
A. Fitoterapi dan Kemoterapi ... 69
B. Standardisasi dan Persyaratan Mutu Simplisia ... 70
C. Uji Fitokimia Ekstrak Kelopak Bunga Rosela ... 73
D. Uji Penghambatan Pertumbuhan Sel Fibroblas Keloid Manusia ... 78
1. Deteksi apoptosis (Tunel assay) ... 78
2. Pengukuran kadar TGF-β1 ... 82
E. Uji Sitotoksitas Ekstrak Kelopak Bunga Rosela terhadap Sel Fibroblas Kulit Normal Manusia ... 84
BAB VI KESIMPULAN DAN SARAN ... 85
A. Kesimpulan ... 85
1. Uji fitokimia ekstrak kelopak bunga rosela ... 85
2. Uji ekstrak kelopak bunga rosela untuk penghambatan pertumbuhan fibroblas terhadap sel fibroblas keloid manusia ... 85
3. Uji sitotoksitas ekstrak kelopak bunga rosela terhadap sel fibroblas kulit normal manusia ... 86
B. Saran ... 86
` DAFTAR PUSTAKA ... 88
DAFTAR TABEL
Tabel 1. Hasil Pemeriksaan Karakterisasi Simplisia Rosela ... 62
Tabel 2. Hasil Uji Fitokimia Ekstrak Kelopak Bunga Rosela ... 63
DAFTAR GAMBAR
Gambar 1. Tanaman Rosela ... 24
Gambar 2. Kerangka Teori ... 30
Gambar 3. Kerangka Konsep ... 31
Gambar 4. Diagram Kerja Penyiapan Ekstrak ... 37
Gambar 5. Diagram Kerja Penetapan Standarisasi Simplisia ... 41
Gambar 6. Diagram Kerja Uji Fitokimia ... 45
Gambar 7. Diagram Deteksi Apoptosis Tunel assay ... 51
Gambar 8. Diagram Pengukuran Kadar TGF-β1 ... 54
Gambar 9. Diagram Kerja Uji Sitotoksisitas ... ` 59
Gambar 10. Diagram Alur Penelitian ... 60
DAFTAR SINGAKATAN
BBT = Bahan Biologik Tersimpan
DMEM = Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium
DNA = Deoxyribonucleic Acid
ECM = Extracelluler Matrix
EDTA = Ethylenediaminetetraacetic Acid
ELISA = Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
FBS = Fetal Bovine Serum
GR = Glutation Redukrase
HAKI = Hak Atas Kekayaan Intelektual
IFN = Interferon
LAP = Latency associated protein
LASER = Light Amplification Stimulated by Emission Radiation
LIPI = Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia
LPPT = Laboratorium Penelitian dan Pengujian Terpadu LTBP = the Latent TGF-β Binding Protein
MMI = Materia Medika Indonesia
MTT = Dimethylthiazol Diphenyl Tetrazolium
OD = Optical Density
PA = Plasminogen Activator
PAI = Plasminogen Activator Inhibitor
PBS = Phospate Buffered Saline
RPMI = Roswell Park Memorial Institue medium
RSUP = Rumah Sakit Umum Pusat
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1. Lembar Penjelasan Kepada Calon Subjek Penelitian ... 95
Lampiran 2. Surat Persetujuan Setelah Penjelasan
(Informed Consent) ... 97
]
Lampiran 3. Surat Keterangan Izin Penelitian ... 98
Lampiran 4. Surat Persetujuan Komisi Etik ... 99
Lampiran 5. Surat Keterangan Hasil Identifikasi/Determinasi
Tumbuhan ... 100
Lampiran 6. Statistik ... 101
HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS
Hasil penelitian ini adalah hasil karya sendiri,
dan semua sumber baik yang dikutip maupun dirujuk
telah saya nyatakan dengan benar.
Nama
: Imam Budi Putra
NIPM
: 088102007
Materai 6000
Tanda Tangan
PENGARUH EKSTRAK KELOPAK BUNGA ROSELA (Hibiscus sabdariffa L) TERHADAP PENGHAMBATAN
PROLIFERASI SEL FIBROBLAS KELOID MANUSIA
ABSTRAK
Latar belakang: Keloid saat ini tidak hanya merupakan masalah bagi penderitanya tetapi juga merupakan masalah bagi dokter karena hingga saat ini belum ada kesepakatan mengenai pemilihan terapi yang tepat dan optimal dalam penanggulangannya, serta terdapat kecenderungan kekambuhan yang tinggi setelah pengobatan. Selain tindakan pembedahan dan bahan kimia sebagai bahan pilihan pengobatan yang potensial, bahan-bahan herbal diharapkan dapat sebagai modalitas terapi yang dapat digunakan. Tanaman rosela (Hibiscus safdariffa L) mempunyai berbagai macam khasiat diantaranya sebagai antioksidan, anti kanker, anti hipertensi, dan anti hiperlipedemia. Atas dasar tersebut ingin diteliti apakah tanaman rosela dapat berkhasiat sebagai pengobatan keloid.
Tujuan penelitian:. 1) Membuktikan apakah ekstrak kelopak bunga rosela dapat menghambat proliferasi sel fibroblas keloid manusia dengan meningkatkan apoptosis, dan menurunkan kadar Transforming Growth Factor-β1 (TGF-β1) pada kultur sel fibroblas keloid manusia. 2) Membuktikan apakah ekstrak kelopak bunga rosela tidak menimbulkan efek sitotoksik.
Metode penelitian: Eksploratif laboratorium dilakukan dengan menetapkan standardisasi simplisia, mengekstraksi kelopak bunga rosela, dan uji fitokimia. Eksperimen laboratorium dilakukan dengan uji penghambatan pertumbuhan sel fibroblas keloid dengan cara mendeteksi apoptosis dan mengukur kadar TGF-β1 secara in vitro. Pengukuran apoptosis dilakukan dengan metode Tunel assay sedangkan pengukuran kadar TGF-β1 dilakukan dengan Enzyme linked immunosorbent assay. Eksperimen laboratorium melakukan uji sitotoksisitas terhadap sel fibroblas kulit normal manusia secara in vitro dilakukan dengan spektrofotometer yang menggunakan Dimethyltiazol
diphenyil tetrazolium. Analisis data dilakukan secara deskriptif, regresi linear, dan anova
satu arah.
353,88pg/ml, 375,66pg/ml, 378,47pg/ml dan 190,20pg/ml. Uji regresi linear menunjukkan bahwa ada hubungan antara penambahan konsentrasi ekstrak kelopak bunga rosela dengan penurunan kadar TGF-β1 pada kultur sel fibroblas keloid manusia (y = 659,37 – 0,550, p <0,001). Dengan kata lain semakin tinggi konsentrasi ekstrak kelopak bunga rosela pada kultur sel fibroblas keloid manusia, semakin rendah kadar TGF-β1 (p<0,05). Hasil uji sitotoksisitas menunjukkan bahwa penambahan konsentrasi ekstrak kelopak bunga rosela pada kultur sel fibroblas kulit normal manusia dengan kadar berturut-turut 1,96µg/ml, 3,91µg/ml, 7,81µg/ml, 15,63µg/ml, 31,25µg/ml, 62,50µg/ml, 125µg/ml, 250µg/ml, 500µg/ml dan 1000µg/ml menunjukkan viabilitas yang secara berturut-turut adalah 91,4%, 89,4%, 94,7%, 90,2%, 89,0%, 91,6%, 93,2%, 99,2%, 94,9% dan 89,7%. Dengan kata lain , ekstrak kelopak bunga rosela tidak toksik terhadap sel fibroblas kulit normal manusia.
Kesimpulan: Hasil uji fitokimia ekstrak kelopak bunga rosela mengandung senyawa aktif golongan tanin, flavonoid, steroid/triterpenoid, dan glikosida. Ekstrak kelopak bunga rosela dapat meningkatkan apoptosis, sehingga mampu menghambat proliferasi sel fibroblas keloid manusia secara in vitro. Semakin tinggi konsentrasi ekstrak kelopak bunga rosela, semakin tinggi terjadinya apoptosis. Ekstrak kelopak bunga rosela mampu menurunkan kadar TGF-β1 sehingga dapat mengurangi kepadatan sel fibroblas keloid manusia secara in vitro. Semakin tinggi konsentrasi ekstrak kelopak bunga rosela maka semakin rendah kadar TGF-β1 pada kultur sel fibroblas keloid manusia. Uji sitotoksisitas menunjukkan bahwa ekstrak kelopak bunga rosela tidak toksik terhadap sel fibroblas kulit normal manusia.
Kata kunci : ekstrak kelopak bunga rosela, keloid, uji fitokimia, apoptosis,
EFFECT of ROSELLE CALYX EXTRACT (Hibiscus sabdariffa L) on
the INHIBITION HUMAN KELOID FIBROBLASTS PROLIFERATION
ABSTRACT
Background: Keloids present not only a problem for the sufferer but also a problem for physicians because until now there is no agreement on the proper selection and optimal therapy in the reduction, and there is a high tendency of recurrence after treatment. In addition to surgery and chemicals as a potential treatment option, herbal ingredients can be expected as a therapeutic modality that can be used. Roselle plants (Hibiscus safdariffa L) have various properties such as antioxidant, anti-cancer, anti-hypertensive and anti hiperlipedemia. On the basis of the roselle plant to be tested whether the treatment can be efficacious as a keloid.
Aims : 1) Proving whether roselle calyx extract inhibits proliferation of human keloid fibroblast cells by increasing apoptosis, and reduce levels of Transforming Growth
Factor-β1 (TGF-β1) on cultured human keloid fibroblasts. 2) Proving whether roselle calyx
extract caused no cytotoxic effects.
Methods: exploratory laboratory by setting standards simplicia, roselle calyx extract and phytochemical test. Laboratory experiments with cell growth inhibition test performed with keloid fibroblast apoptosis detection and measurement of levels of TGF-β1 in vitro. Measurement of apoptosis TUNEL assay was performed by the method of measurement while the levels of TGF-β1 is done by enzyme linked immunosorbent assay. Laboratory experiments to test the cytotoxicity of normal human skin fibroblasts in vitro, performed with a spectrophotometer using tetrazolium diphenyil Dimethyltiazol.Data analysis was performed descriptively, linear regression and one-way ANOVA.
Results: The results of the characteristics of roselle calyx simplicia obtained that the water content of <10% (4.66%), while the monograph simplicia roselle calyx is not in the Materia Medika Indonesia. Phytochemical test results roselle calyx extract containing the active compound group tannins, flavonoids, steroids / triterpenoids and glycosides.Test results of apoptosis by TUNEL assay in human keloid fibroblast cell culture showed that increasing concentrations of roselle calyx extract on cultured human keloid fibroblasts may enhance apoptosis. The addition of roselle calyx extract concentration in a row 1.96µg/ml, 3.91µg/ml, 7.81µg/ml, 15.63µg/ml, 31.25µg/ml, 62.50µg/ml , 125ug/ml, 250ug/ml, 500ug/ml and 1000µg/ml increased apoptosis of 13.22%, 17.66%, 20.43%, 21.85%, 26.17%, 28, 65%, 40.68%, 43.49%, 58.32% and 71.69%. With the linear regression test showed a relationship between the addition of roselle calyx extract concentration with increased apoptosis of human keloid fibroblasts (y = 20.277 +0.060, p <0.001). The higher the concentration of the roselle calyx extract on human keloid fibroblast cell culture, the higher the percentage of apoptosis (p <0.05). At the levels of
TGF-β1 test showed that the addition of roselle calyx extract concentration on cell
cultures of human keloid fibroblasts may reduce levels of TGF-β1. The addition of roselle calyx extract concentration in a row 1.96µg/ml, 3.91µg/ml, 7.81µg/ml, 15.63µg/ml, 31.25µg/ml, 62.50µg/ml , 125µg/ml, 250µg/ml, 500µg/ml, and 1000µg/ml lower levels of
TGF-β1 from 1072.54pg/ml to 741.66pg/ml, 688.98pg/ml, 637.69pg/ml, 638.40pg/ml,
91.4%, 89.4%, 94 , 7%, 90.2%, 89.0%, 91.6%, 93.2%, 99.2%, 94.9% and 89.7%. In other words, roselle calyx extracts are not toxic to normal human skin fibroblasts.
Conclusion: The results of phytochemical extracts of roselle petals contain the active compound classes of tannins, flavonoids, steroids / triterpenoids and glycosides.Roselle calyx extract can enhance apoptosis, there by inhibiting cell proliferation of human keloid fibroblasts in vitro. The higher concentrations of roselle calyx extract the higher occurrence of apoptosis. Roselle calyx extract could reduce levels of TGF-β1 that can decreased density of human keloid fibroblasts in vitro. The higher concentrations of roselle calyx extract the lower levels of TGF-β1. In cell cultures of human keloid fibroblasts. In the cytotoxicity test showed that roselle calyx extracts are not toxic to normal human skin fibroblasts.
