MAKALAH PEWARNAAN JARINGAN
DISUSUN OLEH : Maria Theresa Diana
UNIVERSITAS MOHAMMAD HUSNI THAMRIN
BAB I PENDAHULUAN A. Latar Belakang
Histoteknik adalah metoda membuat sajian dari spesimen tertentu melalui suatu rangkaian proses hingga menjadi preparat histologi yang baik dan siap untuk dianalisis. Spesimen dapat berasal dari manusia dan hewan. Preparat yang baik dapat digunakan untuk mempelajari peran sel/jaringan dalam keadaan fisiologis atau patologis, mempelajari perubahan sel/jaringan akibat suatu perlakuan pada penelitian, dan alat bantu diagnosis penyakit. Preparat yang baik dapat memberikan hasil yang akurat untuk menjawab pertanyaan riset. Untuk mencapai tujuan tersebut, preparat harus dapat memberikan gambaran tentang bentuk, besar, dan susunan sebagaimana sel/jaringan itu hidup.
Kebanyakan jaringan didapati tidak berwarna, sehingga tidak banyak yang dapat dilihat di bawah mikroskop. Agar dapat dilihat dibawah mikroskop, kebanyakan sediaan harus diwarnai. Oleh sebab itu, telah dirancang pewarnaan jaringan agar berbagai unsur jaringan jelas terlihat dan dapat dibedakan. Bahan warna mewarna berbagai jaringan, kurang lebih secara selektif.
Hematoksilin dan Eosin adalah metode pewarnaan yang banyak digunakan dalam dalam pewarnaan jaringan sehingga ia di perlukan dalam diagnosa medis dan penelitian. Hematoksilin adalah bahan pewarna yang sering digunakan pada pewarnaan histoteknik, ia merupakan ekstrak dari pohon yang diberi nama logwood tree. Hematoksilin bekerja sebagai pewarna basa, artinya zat ini mewarnai unsur basofilik jaringan. Hematoksilin memulas inti dan strukutur asam lainnya dari sel (seperti bagian sitoplasma yang kaya RNA dan matriks tulang rawan) menjadi biru.
Eosin bersifat asam. Ia akan memulas komponen asidofilik jaringan seperti mitokondria, granula sekretoris dan kolagen. Tidak seperti hematoksilin, eosin mewarnai sitoplasma dan kolagen menjadi warna merah muda (Junquera, 2007).
B. Tujuan
Makalah ini di buat penulis dengan tujuan agar mahasiswa/i, tenaga kesehatan atau tenaga medis dapat memahami berkaitan tentang pewarnaan jaringan.
C. Rumusan Masalah
Bagaimana cara pelaksanaan pewarnaan jaringan sitohistoteknologi?
BAB II PEMBAHASAN A. PENGERTIAN
Kebanyakan jaringan didapati tidak berwarna, sehingga tidak banyak yang dapat dilihat di bawah mikroskop. Agar dapat dilihat dibawah mikroskop, kebanyakan sediaan harus diwarnai. Oleh sebab itu, telah dirancang pewarnaan jaringan agar berbagai unsur jaringan jelas terlihat dan dapat dibedakan. Bahan warna untuk mewarnai berbagai jaringan, kurang lebih secara selektif
Jaringan dibentuk oleh dua komponen yang saling berinteraksi yaitu sel dan matriks ekstrasel. Matriks ekstrasel terdiri atas banyak jenis molekul, dan
kebanyakan diantaranya sangat rumit dan membentuk struktur kompleks, seperti serabut dan membrane basal. Fungsi matriks ekstrasel ini adalah sebagai
penunjang mekanis bagi sel-sel, mengangkut nutrient ke sel-sel, dan membawa katabolit dan produk sekresi. Walaupun menghasilkan matriks ekstrasel, sel tersebut di pengaruhi dan kadang di atur oleh molekul-molekul matriks. Sehingga terdapat semacam interaksi intensif antara sel-sel dan matriks.
Setiap jaringan dibentuk oleh beberapa jenis sel dan secara khas oleh asosiasi sel dan matriks ekstrasel yang spesifik. Asosiasi yang khas ini akan mempermudah pengenalan sejumlah besar subtype jaringan. Kebanyakan organ dibentuk oleh kombinasi beberapa jenis jaringan, kecuali susunan saraf pusat, yang hampir seluruhnya terdiri atas jaringan saraf. Kombinasi yang tepat dari jaringan-jaringan tersebut memungkinkan berfungsinya setiap organ dan organisme secara keseluruhan.
Ukuran sel dan matriksnya yang kecil menyebabkan histology bergantung pada penggunaan mikroskop. Kemajuan di bidang kima, biologi molecular, fisiologi, imunologi dan patologi serta interaksi di antara bidang-bidang tersebut sangat penting untuk memperoleh pengetahuan yang lebih baik dibidang bilogi jaringan.
Pembiasaan dengan alat dan metode setiap cabang ilmu sangat penting untuk memahami topic pembelajaran dengan baik, sehingga makalah ini akan membahas beberapa metode yang di pakai dalam mempelajari sel dan jaringan.
B. KOMPONEN HISTOTEKNIK Larutan pengawet
Pengawetan (fiksasi) adalah stabilisasi unsur penting pada jaringan sehingga unsur tersebut tidak terlarut, berpindah, atau terdistorsi selama prosedur selanjutnya. Fiksasi yang benar adalah dasar dari semua preparat yang baik. Efek fiksasi terhadap jaringan yang diproses adalah menghambat proses pembusukan dan autolysis, pengawetan jaringan, pengerasan jaringan, pemadatan koloid, diferensiasi optik, dan berpengaruh terhadap pewarnaan. Sejumlah faktor akan mempengaruhi proses pengawetan yaitu dapar, penetrasi, volume pengawet, konsentrasi, interval waktu, suhu, dan jenis larutan pengawet.
Cara melakukan pengawetan jaringan ada 2 macam, yaitu supravital/intravital atau merendam dalam larutan pengawet. Merendam dalam larutan pengawet adalah yang paling sederhana dan sering dilakukan.
Pemrosesan jaringan
Setelah jaringan diawetkan, jaringan harus diproses menjadi bentuk yang dapat diiris dengan mikrotom. Biasanya pengirisan dikerjakan dengan parafin (suatu jenis lilin).
Langkah utama pemrosesan jaringan adalah dehidrasi dan pembeningan. Jaringan tertentu memiliki struktur yang berbeda dengan kebanyakan jaringan lainnya.
Jaringan yang mengandung kalsium (tulang) atau jaringan yang keras (kulit) akan menjalani proses tertentu sebelum proses dehidrasi.
Adapun pemrosesan jaringan terdiri atas:
Pemotongan dan persiapan jaringan untuk pemulasan
untuk mempelajari struktur sel dan organisasinya dalam jaringan maka jaringan harus difiksasi dan dibuat potongan, dipulas dengan zat pewarna dan kemudian diobservasi dengan mikroskop cahaya. Hal ini dilakukan dengan tahapan- tahapan berikut:
1. Mendapatkan Jaringan
Jaringan harus diduga tumor atau kelainan
Jaringan harus sudah difikasasi sebelum 6 jam setelah kematian, bisa terjadi maserasi
Pemotongan menggunakan pisau tajam ukuran biasanya (1,5x1x0,5) cm3
Mendapatkan Jaringan
Harus segera dimasukkan ke dlm larutan fiksasi (Volume 40x) selama 1 malam
Tidak boleh dicuci dengan air (terjadi perubahan tekanan osmotik
Tidak boleh disimpan dalam NaCl 0,9 % -maserasi
Tidak boleh dibekukan-pembentukan kristal es dlm sitoplas
Jaringan berbentuk tulang harus didekalsifikasi agar lunak dg HCl 0,5 %
2. Fiksasi
Organ sediaan dicuci dengan larutan NaCl 0,9% Suatu bahan kimia yang mengandung bahan fiksatif pada pH 7,0 ditambahkan kejaringan. Bahan fiksatif yang paling umum digunakan adalah formaldehida dengan kosentrasi 4%. (umumnya, pengenceran dibuat dari larutan stok formalin. Yaitu formaldehida 37% atau 40%). Formaldehida berikatan dengan beberapa protein dan membentuk ikatan silang. Kemudian mendenaturisi protein lainnya, namun tidak berinteraksi dengan lipid. Efek keseluruhan adalah untuk mempekeras jaringan dan menginaktvikasi enzim, yang mencegah degradasi jaringan.
Manfaat Fiksasi :
Sel & jar keadaannya seperti hidup
Membunuh Bakteri
Mematikan sel secara serentak
Mengeraskan jaringan
Melindungi sel dari prosesselanjutnya
Mempermudah pengecatan
Melindungi sel/jar dari autolysis dan putrefaction
3. Pencucian (washing)
Setelah difiksasi, dilakukan pencucian dengan menggunakan alkohol 70%
yang berguna untuk menghilangkan larutan fiksasi dari jaringan.
4. Dehidrasi
Langkah ini dilakukan setelah proses pencucian selesai, dengan menggunakan alkohol bertingkat dimulai dari alkohol 70%, 80%, 96%. dan berakhir pada kosentrasi 100%. Proses ini dilakukan secara bertahap dengan tujuan meminimalkan kerusakan jaringan.
Proses penarikan air secara aktif dari dalam jaringan Proses Dehidrasi
Untuk memudahkan proses infiltrasi parafin ke dalam jaringan menggunakan alkohol dari konsentrasi rendah-tinggi
Lamanya waktu tergantung pada :
Besar kecilnya jaringan
Konsentrasi jaringan
Macam zat fiksasi yang dipakai
Sifat clearing agent yang dipakai
Contoh Proses Dehidrasi
alkohol 70%... 1 hari
alkohol 80%... 1 hari
alkohol 90%... 1 hari
alkohol 95% ... 1 hari
alkohol 95% ... 1 hari
alkohol 100% ... 1 hari
alkohol 100% ... .1 hari
Alkohol dapat dimurnikan kembali dengan cuprisulfat (CuSO4) Cuprisulfat-putih (tak mengandung air) akan berubah menjadi biru (mengandung air). Ganti cuprisulfat beberapa kali hingga warnanya tetap putih walaupun telah disimpan beberapa hari.
Cuprisulfat yang telah bewarna biru karena mengandung air dapat di hilangkan airnya dengan cara memanaskan.
5. Penjernihan (clearing)
Penjernihan dilakukan dengan menggunakan xylol 1, dan xylol 2
Selanjutnya potongn ditepatkan dalam pelarut organic seperti xlena atau toluena, yang menggantikan alcohol. Lilin tidak larut dalam alcohol. pelarut tersebut disebut bahan penjernih karena jaringan sering kali terlihat tampak sangat jelas saat dipendam dalam bahan penjernih, akhirnya jaringan diimpregnasi dengan lilin panas yang larut dalam jenis pelarut ini.
6. Infiltrasi
Proses infiltrasi dilakukan di dalam oven dengan suhu 56oC, menggunakan perbandingan parafin 1, 2, dan 3 masing-masing selama ± 2 menit. Proses ini dimaksudkan untuk menghindari perubahan lingkungan yang sangat mendadak terhadap jaringan tersebut.
7. Penanaman (embedding)
Jaringan ditempatkan dalam lilin parafin hangat pada suatu cetakan.
Embedding dilakukan dlm oven dgn suhu 58-60ºC.
Pada pendinginan selanjutnya lilin akan mengeras dan lembaran jaringan dapat dipotong.
Proses Embedding
Impregnation.
proses penggantian larutan toluen dengan parafin cair
Blocking.
Memasukkan jaringan ke dalam parafin cair - dipadatkan (menurunkan suhu parafin)-dicetak
Trimming.
Meratakan/merapikan jaringan yg telah diblock parafin dengan menggunakan pisau atau langsung dengan mikrotome, sehingga pada saat pemotongan didapatkan potongan bentuk jaringan yang baik.
8. Pemotongan (sectioning)
Penyayatan atau pemotongan dilakukan dengan memotong blok parafin yang telah ditempelkan pada holder kemudian dipasang pada mikrotom, lalu mikrotom diputar sampai blok parafin yang berisi organ tadi terpotong menjadi pita-pita parafin dengan ukuran ketebalan 10-20 µm.
Sectioning adalah proses pemotongan jar dengan mikrotom-ukuran sangat tipis 4-10 µ-tembus cahaya saat diperiksa dg mikroskop
Diperhatikan :
Pisau harus tajam
Blok jaringan harus dingin
Ketebalan pemotongan harus disesuaikan dengan jenis jaringan Proses Sectioning
Dinginkan pada lemari es / cold plate - akan terlepas dari cetakan bloknya dan tempatkan pada hold mikrotome untuk dipotong (ketebalan 3 – 5 µ) -membentuk lembaran pita
9. Perekatan (mounting)
Potongan lilin diletakkan pada kaca objek mikroskop Proses Mounting
Obyek glass diberi albumin agar Jar menempel dg baik
Dimasukkan ke dalam water bath suhu 30 0C - lembaran pita tidak melipat
Bila sudah menempel dikeringkan/ diriskan (Bisa dg Hot Plate)
Stretching tissue in warm water.
10. Penempelan (affiksing)
Penempelan dilakukan dengan mengambil beberapa pita paraffin yang telah terpotong dengan menggunakan skapel, kemudian dimasukkan ke dalam water bath ( 40-50 oC) ± 2 menit, hal ini bertujuan agar jaringan tidak berlipat, lalu di tempelkan pada objek glass yang telah diolesi albumin secukupnya
11. Dimasukkan kembali ke dalam xylol 1 dan xylol 2 hal ini bertujuan untuk meghilangkan paraffin yang masih ada pada jaringan
12. Redehidrasi
Langkah ini dilakukan dengan menggunakan alkohol dimulai dari alkohol absolute hingga 70 %.
13. Pewarnaan (staining)
Pewarna yg digunakan semua berbahan dasar air, sayatan jaringan masih penuh dengan parafin yang tidak dapat menerima lar. Pewarna, sehingga lilin
harus dilarutkan dan diganti dgn air agar zat warna mampu menembus potongan jaringan. Dengan cara Potongan ditempatkan dalam alkohol dengan konsentrasi yg semakin menurun dan terakhir hanya air. Sehingga sediaan diatas kaca objek dpt diwarnai, sedian yang sudah diwarnai dikeringkan dan ditutup dengan kaca penutup.
Tujuan :
Jaringan terlihat tampak nyata
Dapat membedakan bagian-bagian jaringan Berdasarkan waktu :
Direct Staining, molekul zat warna langsung ditangkap oleh jaringan, misalnya Eosin
Indirect Staining, molekul zat warna baru bisa ditangkap oleh jaringan jika menggunakan zat perantara yang disebut Mordant, misalnya Haematoxyline menggunakan Potasium Alum sebagai mordantnya.
14. Penutupan (mounting)
Dari xylol jaringan kemudian ditutup dengan cover glass setelah ditetesi dengan Canada balsam terlebih dahulu.
15. Diiberi label dan di amati di bawah mikroskop.
Alat dan Bahan
1. Jaringan yang akan dibuat menjadi preparat 2. Formalin 10%
3. Alkohol 70%, 80%, 95%, 100%
4. Xylol 5. Parafin
6. Wadah cetakan (kayu segi empat) 7. Microtome knife
8. Waterbath (suhu diatur 45-500C) 9. Kaca Objek
10. Albumin (putih telur + gliserin) 11. Larutan Hematoxylin
12. Larutan Eosin 13. Deck Glass 14. Label
Cara Kerja
1. Persiapan Jaringan
- Persiapkan jaringan yang akan dijadikan preparat
- Potong jaringan sekitar 1cm x 1cm untuk memudahkan fiksasi, sehingga cairan fiksasi dapat menyerap sampai ke seluruh jaringan.
2. Tahap Fiksasi/Pengawetan
- Rendam jaringan yang sudah dipersiapkan tadi ke dalam cairan Formalin 10% selama 24 jam
- Hal yang harus diperhatikan dalam proses fiksasi jaringan histologi:
a. Tebal irisan : jangan terlalu tebal (1cm x 1cm) supaya mempermudah penyerapan cairan fiksatif merata ke seluruh jaringan.
b. Volume cairan fiksatif : harus sampai dapat merendam seluruh bagian jaringan
c. Jenis cairan fiksatif yang digunakan.
- Pasca fiksasi, jaringan yang keras mendapat perlakuan khusus, yaitu : a. Tulang: dekalsifikasi dengan formic acid 8%.
b. Kulit: teknik lendrum cuci dengan air kran mengalir atau alkohol 90% atau Fenol 4% dalam akuades selama 1 -3 hari. Jenis cairan fiksatif :
c. Formalin
- Yang digunakan adalah bentuk monomer: dibuat dengan menetralkan/alkalis larutan
- Mengakibatkan crosslink protein
- Dapat berupa: Formal saline, formal calcium, 10% neutral buffered formalin, buffer formalin sukrosa
d. Bouin
- Mengandung asam pikrat, meledak kalau kering - Mudah dikenali saat pemotongan warna kuning - Mempunyai daya penetrasi yang cepat dan merata - Jaringan mengalami pengerutan
e. Zenker Formol (Cairan Helly) - Mengandung merkuri klorida
- Daya fiksasinya cepat dan kuat, tetapi kecepatan penetrasinya berkurang setelah meresap sejauh beberapa milimeter pertama dan potongan jaringan yang melebihi ketebalan 5 mm pada umumnya cenderung untuk menjadi keras (rapuh), overfixed di bagian pinggir sementara di bagian tengah menjadi lunak karena underfixed
- Fiksatif ini sangat baik untuk fiksasi sumsum tulang dan limpa, mitokondria.
f. Etanol
- Untuk Cytological fixatives
- Yang biasa digunakan: Etanol 95%
- Digunakan untuk Pap test, swab
- Mempertahankan antigenisitas cocok IHC g. Larutan Carnoy
- Mengawetkan substansia Nissl dan glikogen - Daya penetrasi yang cepat
