38 BAB IV
METODE PENELITIAN 4.1 Jenis Penelitian
Jenis penelitian yang dilakukan merupakan jenis penelitian eksperimental digunakan untuk mengetahui sitotoksisitas dari umbi bawnag dayak terhadap sel MCF-7 dan sel vero menggunakan metode MTT assay sekaligus identifikasi senyawa aktivitas antikanker menggunakan fraksinasi bertingkat dengan fraksi etanol umbi bawang Dayak (Eleutherine palmifollia L.).
4.2 Bahan Uji
Bahan uji yang diujikan merupakan fraksi etanol dari umbi bawang Dayak (Eleutherine palmifollia L.) dari hasil penelitian sebelumnya (Ula, 2019) yang diperoleh dengan cara fraksinasi bertingkat, dimana serbuk umbi bawang Dayak diekstraksi menggunakan pelarut n-heksan, kemudian diekstraksi dengan etil asetat, dan diekstraksi lagi dengan etanol. Proses fraksinasi bertingkat dapat dilihat pada Lampiran 3.
4.3 Objek Penelitian dan Lokasi Penelitian
Sel kanker yang digunaan adalah sel kanker payudara MCF-7 yang didapatkan di Lab. Parasitilogi Fakultas Kedokteran Universitas Muhammadiyah Malang. Uji yang dilakukan terhadap sel kanker dengan metode MTT assay dilakukan di Laboratorium Parasitologi Universitas Gajah Mada Yogyakarta
4.4 Bahan dan Alat Penelitian
Di bawah ini adalah bahan serta alat yang akan igunakan dalam melakukan penelitian ini:
4.4.1 Bahan Skrinning Fitokimia
1. Umbi Eleutherine palmifollia L. (Palangkaraya) 2. Pelarut Etanol (Bratachem)
3. N-heksan (Bratachem)
4. Asam sulfat 10% (Bratachem)
5. Anisaldehida Asam Sulfat (Bratachem) 6. Dragendorff (Bratachem)
7. FeCl3 1% (Bratachem) 8. KOH 10% (Bratachem) 4.4.2 Bahan untuk Kontrol Positif
Doxorubicin Actavis 10 mg (Powder for injection) 4.4.3 Bahan untuk Pembuatan Media
1. Aquabides steril (for Analytical Laboratory) 2. HCl
3. NaHCO3 (Pro analisis) 4. NaOH
5. Aquadest
6. Fetal Bovine Serum (FBS)
7. Penisilin-streptomisin (Steril Filtered A) 8. Phospate bufferr saline
1x
9. Tripsinn EDTA 0,25%
10. Sodium Dedosil Sulfat (SDS) 10% dalam 0,1 N HCl
11. Dimmethyl Sulfoxida (DMSO)
12. Media Kultur (MK) (DMEM / M199) 13. Kultur sel kanker
payudara (sel MCF-7) dan sel vero
14. MTT 5mg / ml PBS (50 mg MTT dan 10 ml Phosphate Bufferr Saline (PBS))
4.4.4. Alat-alat Penelitian
1. LAF (Gelman Sciences) 2. Conical tube
(BIOLOGIX) 3. Cryo tube (IMEC) 4. Magnetic stirrer
(AccuPlate) 5. Culture dish
6. Sentrifuge (JANETZKI T5)
7. Pipet Pasteur steril
8. Tangki nitrogen cair (Thermolyne Bio Cane 47)
9. Mikropipet (WWRbrand) 10. Hemositometer
(SUPERIOR W- Germany)
11. Mikroskop inverted (Aziovert 25)
12. Inkubator CO2 (HERA Cell)
13. Yellow tip dan blue tip (BIOLOGIX)
14. 96 well plate (BIOLOGIX) 15. ELISA reader
(Microplate Reader Benchmark)
16. Eppendorf
17. Botol Duran 500 ml (SCHOTT DURAN)
4.5 Variabel Penelitian
Berikut ini variabel penelitian yang dilakukan : 4.5.1 Variabel Bebas
Variabel bebas yang dibuat dalam penelitian ini adalah konsentrasi uji fraksi etanol Eleutheria palmifollia yaitu 2000 μg/ml, 1000 μg/ml , 500 μg/ml , 250 μg/ml , 125 μg/ml, 62, 5 μg/ml , 31,25 μg/ml.
4.5.2 Variabel Tergantung
Pada penelitian ini yang menjadi variabel tergantung adalah absorbansi sel hidup dan persentase dari aviabilitas sel hidup.
4.6 Metode Penelitian
Berikut ini metode penelitian yang digunakan : 4.6.1 Rancangan Penelitian
Rancangan penelitian yang dilakukan adalah :
1. Mempersiapkan sampel untuk penelitian fraksi umbi Eleutheria pallmifolia L.
dengan menggunakan pelarut etanol.
2. Pengujian sitotoksisitas fraksi dengan umbi Eleutheria pallmifolia L.
metode MTT assay.
3. Pada pengujian aktivitas fraksi etanol umbi Eleutheria pallmifolia L. terhadap sel kanker MCF-7 dan sel vero sebagai pembanding untuk melihat selektifitas dari fraksi etanol umbi Eleutheria pallmifolia L. secara in vitro dengan metode MTT assay yang direplikasi sebanyak 3x dan dibagi dalam tiga kelompok perlakuan, seperti tercantum dalam tabel berikut.
Tabel IV.1 Kelompok perlakuan terhadap kultur sel kanker MCF-7 dalam tiap percobaan
Kelompok Perlakuan Konsentrasi
Kelompok Uji Dengan fraksi etanol umbi Eleutherine palmifolia L. dengan konsentrasi (2000 μg/ml
; 1000 μg /ml ; 500 μg/ml ; 250 μg/ml ; 125 μg/ml ; 62,5 μg/ml ; dan 31,25 μg/ml).
Kontrol Positif Dengan Doxorubicin dengan konsentrasi (50 μg/ml, 25 μg/ml, 12,5 μg/ml, 6,25 μg/ml, 3,125 μg/ml ; 1,5625 μg/ml dan 0,78125 μg/ml)
Kontrol negative
Kontrol media DMEM dan MI99 Kontrol sel Sel MCF-7 dan Sel Vero
4.6.2 Kerangka Operasional
Gambar 4.1 Skema Kerangka Konseptional
Biakan di letakan di mikrowell dengan kerapatan 104 sel/sumuran
Kelompok uji Kontrol media Kontrol sel Kontrol positif
0,78125μg/ml 1,5625 μg/ml
50 μg/ml 6,25 μg/ml 3,125 μg/ml
12,5 μg/ml 25 μg/ml
Di inkubasi 24 jam
Diberi tambahan reagen MTT assay 100 μg/sumuran
Dilakukan inkubasi 3-6 jam pada suhu 37°C
Ditambahkan stopper 100 μl SDS 10% dalam 0,1 N HCl
Dilakukan inkubasi 1 malam di tempat yang gelap
ELISA reader 31,25 μg/ml
62,5 μg/ml 125 μg/ml 250 μg/ml 500 μg/ml
2000 μg/ml.
1000 μg/ml
4.7 Identifikasi Golongan Senyawa dengan Kromatografi Lapis Tipis
Dilakukan penimbangan ekstrak kental fraksi etanol umbi bawang dayak sebanyak 0,05 gram kemudian ditambahkan dengan 2 ml n-heksana dan diultrasonik hingga larut. Setelah itu, filtrat di totolkan 5 µl pada fase diam.
Pada uji KLT ini menggunakan:
Fase diam : Kiesel gel GF 254
Fase gerak : n-heksana - Etil Asetat -Asam formiat (6 : 4 : 1 tetes) Penampak Noda
- Terpenoid : Anisaldehida – asam sulfat - Alkaloid : Dragendorff
- Polifenol : Besi (III) Klorida 1 %
- Flavonoid : Uap Amonia atau Asam Sulfat 10%
- Antrakuinon : Larutan Kalium Hidroksida 5-10% dalam etanol 4.8 Prosedur Kerja
Berikut adalah prosedur kerja yang dilakukan untuk melakukan penelitian ini.
4.8.1 Pembuatan Fraksi Bahan Uji
Bahan uji pada penelitisn ini adalah hasil fraksinasi umbi bawang dayak dengan menggunkan metode fraksinasi bertingkat yang menggunakan pelarut yang berbeda yaitu pelarut n-heksan, etil asetat, dan etanol. Bahan dari fraksi etanol umbi bawang dayak diperoleh dari penelitian sebelumnya (Ula, 2019). Prosedur pembutan fraksi dapat dilihat pada lampiran.
4.9. Pembuatan Media 4.9.1. Pembuatan Media Cair
1. Dipersiapkan media bubuk RPMI / DMEM / MEM yang hendak digunakan.
2. Dipersiapkan 950 ml aquabides steril di beker gelas 1 liter di LAF.
3. Dituangkan media bubuk dalam aquabides steril di gelas beker, aduk dengan batang pengaduk hingga homogen.
4. Dilakukan pembilasan pada bagian dalam pembungkus media bubuk dengan menggunakan aquabides, cairan bilasan dituang ke gelas beker (no. 3)
5. Diberi tambahan 2,2 g NaHCO3 pada tiap liter media yang akan dibuat, ratakan dengan cara diaduk.
6. Diberi tambahan aquabides steril ad volumee 1 liter.
7. Dilakukan pengadukan dengan menggunakan magnetik stirer pada semua media padat serta NaHCO3 hingga larut.
8. Dilakukan adjust pH (dengan harga 0,2 - 0,3 dibawah pH 7,0-7,4) dengan dilakukan penambahan NaOH atau HCl 1 N ke dalam larutan.
9. Difiltrasi media menggunakan filter 0,2 mikron, ditampung dalam botol berskala S 500 ml.
10. Dilakukan penandaan dan simpanS media di kulkas dengan suhu 4 °C.
4.9.2 Pembuatan Media Kultur
1. Dicairkan 10% FBS dan 2% penisilin-streptomisin pada suhu kamar sebelum digunakan.
2. Disiapkan botol berskala volum 100 ml.
3. Diambil FBS 10 ml, tuang ke dalam botol
4. Diambil dan dituang penisilin-streptomisin 1ml ke botol berskala 5. Diambil Amphotericyn B 0,5 ml
6. Ditambahkan DMGM (MCF-7) ke dalam botol ad 100 ml
7. Beri label di botol MK ( nama media, tanggal pembuatan, expied date, nama pembuat )
8. Disimpan MK pada temperature 1 sampai 8°C, sehingga dapat bertahan sampai 1 bulan.
4.9.3 Penumbuhan Sel
1. Disiapkan 3 ml medium kultur yang sesuai dengan sel, dimasukkan kedalam conycal tube yang sudah steril
2. Diambil cryo tube yang berisi sel dari tangki nitrogen atau freezer (- 80°c) lalu dicairkan pada suhu kamar (digenggam) sampai suspensi sel mencair dengan sempurna
3. Diambil dengan menggunkaan mikropipet suspensi sel sebanyak 1 ml yang sudah mencair ke medium kultur yang sudah dibuat
4. Ditutup rapat conical tube kemudian di sentrifuge 2000 rpm selama 3’
5. Disemprot conical tube serta tangan + handskoon dengan alcohol 70%.
dalam LAF
6. Dibuka conical tube lalu buang supernatant ke pembuangan
7. Ditambahkan medium kultur yang baru 4 ml ke dalam conical tube, resuspensi sampai homogen
8. Diambil 2 ml suspensi sel lalu pindahkan ke dalam cell culture dish, homogenkan
9. Dilakukan penambahan medium kultur sampai 7 ml lalu homogenkan 10. Dilakukan pengamatan kondisi sel dibawah mikroskop inverted
11. Diberi penandaan, kemudian simpan sel dalam inkubator CO2 suhu 37°C.
4.9.4 Penggantian Media
1. Disiapkan di dalam conycal tube PBS dan medium kultur
2. Dibuang medium kultur yang lama di dalam dish dengan dihisap pelan menggunakan pipet Pasteur
3. Ditlakukan penuangan PBS 3 ml kedalam dish, gerakan secara berputar untuk mencuci sel ke kanan dank e kiri Dituang kembali PBS dengan pipet Pasteur
4. Dituang medium kultur 7 ml kedalam dish yang didalamnya terdapat sel, homogenkan
5. Dilakukan pengamatan kondisi sel dibawah mikroskop inverted
6. Diletakkan sel didalam incubator CO2 semalaman dan amati keesokan harinya
4.9.5 Panen Sel
1. Diambil sel dari inkubator CO2, diamati kondisinya. Panen sel dapat dilakukan ketika sel telah mengalami 80% konfluen
2. Dilakukan pembuangan medium kultur dengan pipet Pasteur yang bebas kontaminan.
3. Dilakukan pencucian sel menggunakan PBS (volume PBS ½ volume media awal)
4. Dilakukan penambahan tripsin EDTA 0,25% diratakan kemudian dilakukan inkubasi selama 3 menit
5. Dilakukan penambahan medium ±5 ml untuk menon-aktifkan tripsin agar sel terpisah
6. Dilakukan pengamatan kondisi sel di bawah mikroskop inverted 7. Dilakukan resuspensi kembali jika antar sel masih ada yang menempel 8. Dipindahkan ke dalam conycal tube sel yang sudah terlepas satu persatu 4.9.6 Perhitungan Sel
1. Dilakukan pengambilan sel dari inkubator CO2 lalu dilakukan pengamatan keadaan sel.
2. Dilakukan pembuangan medium kultur dengan pipet Pasteur steril 3. Dicuci sel menggunakan PBS (volume PBS ½ volume media awal 4. Dilakukan penambahan tripsin EDTA 0,25% merata lalu dilakukan
inkubasi selama 3 menit
5. Dilakukan penambahan medium ±5 ml guna untuk menon-aktifkan tripsin agar sel terpisah
6. Diamati kondisi sel di mikroskop inverted
7. Dilakukan resuspensi kembali jika sel masih tersisa dan menempel satu sama lain
8. Sel yang sudah lepas dipindahkan ke dalam conical tube steril lalu ditambah medium kultur 2 sampai 3 ml selanjutnya sel di resuspensi 9. Dilakukan pengambilan panenan sel sebanyak 10 µl pipet kedalam
hemositometer
10. Dihitung sel yang sudah berada di hemositometer dibawah mikroskop inverted
11. Dilakukan perhitungan sel dengan cara sebagai berikut :
Gambar 4.2 Perhitungan sel (CCRC,2014)
1. Sel dihitung di 4 kamar hemositometer. Sel yang terlihat gelap (mati) dan sel yang terletak dibatas luar di sebelah atas dan disebelah kiri tidak dihitung. Sel di batas kanan dan batas bawah dihitung.
2. Jumlah sel dihitung setiap ml dengan rumus dibawah.
𝑗𝑢𝑚𝑙𝑎ℎ 𝑠𝑒𝑙 𝑡𝑒𝑟ℎ𝑖𝑡𝑢𝑛𝑔/𝑚𝑙
= 𝛴𝑠𝑒𝑙 𝑘𝑎𝑚𝑎𝑟 𝐴 + 𝛴𝑠𝑒𝑙 𝑘𝑎𝑚𝑎𝑟 𝐵 + 𝛴𝑠𝑒𝑙 𝑘𝑎𝑚𝑎𝑟 𝐶 + 𝛴𝑠𝑒𝑙 𝑘𝑎𝑚𝑎𝑟 𝐷
4 𝑥 104
3. Jumlah total sel yang dibutuhkan dilakukan perhitungan.
4. Volume hasil dari panenan sel yang dibutuhkan dilakukan perhitungan (dalam bentuk ml) dengan rumus seperti berikut :
𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒 𝑝𝑎𝑛𝑒𝑛𝑎𝑛 𝑠𝑒𝑙 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑑𝑖𝑡𝑟𝑎𝑛𝑠𝑓𝑒𝑟
= 𝑗𝑢𝑚𝑙𝑎ℎ 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑠𝑒𝑙 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑑𝑖𝑝𝑒𝑟𝑙𝑢𝑘𝑎𝑛 𝑗𝑢𝑚𝑙𝑎ℎ 𝑠𝑒𝑙 𝑡𝑒𝑟ℎ𝑖𝑡𝑢𝑛𝑔/𝑚𝑙
5. Dilakukan pengambilan volume hasil dari panenan sel dipindah ke conical tube baru kemudian dilakukan penambahan media kultur
hingga total volume yang dibutuhkan
Cara perhitungan jumlah volume yang dibutuhkan yaitu setiap sumuran yang digunakan akan dilakukan pengisian 100 μl media kultur yang berisi sel, jadi jumlah volume yang dibutuhkan untuk menanam sel = 100 μl x 100 sumuran = 10 ml.
4.10. Pembuatan Larutan Induk dan Larutan Uji
Berikut adalah pembuatan larutan induk dan larutan uji dalam penelitian ini 4.10.1. Pembuatan Larutan Induk
Konsentrasi larutan induk yang akan dibuat untuk penelitian adalah 200.000 ppm. Caranya sebagai berikut :
1. Dilakukan peninmbangan ekstrak bawang dayak fraksi etanol 20 mg 2. Dilakukan pelarutan dengan DMSO sebanyak 100 µl
3. Selanjutnya divortex ad homogen
4.10.2. Pembuatan Larutan Uji Untuk Sel MCF-7
Larutan uji dibuat dengan konsentrasi sebagai berikut : 2000 µg/ml; 1000 µg/ml; 500 µg/ml; 250 µg/ml; 125 µg/ml; 62,5 µg/ml; 31,25 µg/ml. Dilakukan penegenceran bertingkat untuk membuat larutan uji, sebagai berikut :
a. (20 µl / 1000 µl) x 200.000 µg/ml = 2000 µg/ml b. (500 µl / 1000 µl) x 2000 µg/ml = 1000 µg/ml c. (500 µl / 1000 µl) x 1000 µg/ml = 500 µg/ml d. (500 µl / 1000 µl) x 500 µg/ml = 250 µg/ml e. (500 µl / 1000 µl) x 250 µg/ml = 125 µg/ml f. (500 µl / 1000 µl) x 125 µg/ml = 62,5 µg/ml g. (500 µl / 1000 µl) x 62,5 µg/ml = 31,25 µg/ml
Pada pembuatan larutan uji, jumlah baku induk yang dipipet masing-masing diadkan dengan menggunakan media kultur ad volume 1000 µl. Kelompok yang akan dilakukan ujin berisi media kultur, sel MCF-7, dan juga senyawa lalu dilakukan inkubasi dengan incubator CO2 5% dengan waktu 24 jam pada temperature 37°C.
4.10.3. Pembuatan Larutan Uji untuk Sel Vero
Untuk membuat konsentrasi larutan 2000 µg/ml ; 1000 µg/ml ; 500 µg/ml ; 250 µg/ml ; 125 µg/ml ; 62,5 µg/ml ; 31,25 µg/ml. Dilakukan penegenceran bertingkat untuk membuat larutan uji untuk sel vero, sebagai berikut:
a. (20 µl / 1000 µl) x 200.000 µg/ml = 2000 µg/ml b. (500 µl / 1000 µl) x 2000 µg/ml = 1000 µg/ml c. (500 µl / 1000 µl) x 1000 µg/ml = 500 µg/ml d. (500 µl / 1000 µl) x 500 µg/ml = 250 µg/ml e. (500 µl / 1000 µl) x 250 µg/ml = 125 µg/ml f. (500 µl / 1000 µl) x 125 µg/ml = 62,5 µg/ml g. (500 µl / 1000 µl) x 62,5 µg/ml = 31,25 µg/ml
Pada kelompok uji berisi media kultur, sel MCF-7 dan senyawa uji kemudian diinkubasi pada inkubator CO2 5% pada suhu 37ºC selama 24 jam.
Kelompok uji di tambahkan sampai ad 1000 µl menggunakan media kultur.
4.10.4. Pembuatan Kontrol Positif (Doxorubicin) untuk Sel MCF-7
Sediaan doxorubicin yang digunakan 10mg/5 ml dengan konsentrasi 2000 ppm. Konsentrasi larutan kontrol positif yang dibuat yaitu, 100 µg/ml ; 50 µg/ml, 25 µg/ml ; 12,5 µg/ml ; 6,25 µg/ml ; 3,125 µg/ml ; 1, 5625 µg/ml. Dilakukan penegenceran bertingkat untuk membuat kontrol positif, sebagai berikut:
a. (25µl / 1000 µl) x 2000 µg/ml = 50 µg/ml b. (500 µl / 1000 µl) x 50 µg/ml = 25 µg/ml c. (500 µl / 1000 µl) x 25 µg/ml = 12,5 µg/ml d. (500 µl / 1000 µl) x 12,5 µg/ml = 6,25 µg/ml e. (500 µl / 1000 µl) x 6,25 µg/ml = 3,125 µg/ml f. (500 µl / 1000 µl) x 3,125 µg/ml = 1,5625 µg/ml g. (500 µl / 1000 µl) x 1,5625 µg/ml = 0,78125 µg/ml
Pada pembuatan kontrol positif, jumlah baku induk yang dipipet masing- masing diadkan dengan menggunakan media kultur hingga volume mencapai 1000 µl. Kontrol positif berisi media kultur, sel MCF-7, dan juga kontrol positif yaitu senyawa doxorubicin kemudian dilakukan inkubasi dengan menggunakan incubator CO2 5% dengan waktu 24 jam pada temperature 37°C.
4.10.5. Pembuatan Kontrol Positif (Doxorubicin) untuk Sel Vero
Sediaan doxorubicin yang digunakan 10mg/5 ml dengan konsentrasi 2000 ppm. Konsentrasi larutan kontrol positif yang dibuat yaitu, 100 µg/ml ; 50 µg/ml ; 25 µg/ml ; 12,5 µg/ml ; 6,25 µg/ml ; 3,125 µg/ml ; 1, 5625 µg/ml. Dilakukan penegenceran bertingkat untuk membuat kontrol positif, sebagai berikut:
a. (50 µl / 1000 µl) x 2000 µg/ml = 100 µg/ml b. (500 µl / 1000 µl) x 100µg/ml = 50 µg/ml c. (500 µl / 1000 µl) x 50 µg/ml = 25 µg/ml d. (500 µl / 1000 µl) x 25 µg/ml = 12,5 µg/ml e. (500 µl / 1000 µl) x 12,5 µg/ml = 6,25 µg/ml f. (500 µl / 1000 µl) x 6,25 µg/ml = 3,125 µg/ml g. (500 µl / 1000 µl) x 3,125 µg/ml = 1,5625 µg/ml
Pada pembuatan kontrol positif, jumlah baku induk yang dipipet masing- masing diadkan dengan menggunakan media kultur hingga volume mencapai 1000 µl. Kontrol positif berisi media kultur, sel MCF-7, dan juga kontrol positif yaitu
senyawa doxorubicin kemudian dilakukan inkubasi dengan menggunakan incubator CO2 5% dengan waktu 24 jam pada temperature 37°C.
4.11. Rancangan Penempatan 96-Well Plate
4.11.1. Larutan Uji Untuk Sel MCF-7 dan Kontrol Positif
Keterangan Warna
Orange : Fraksi n-Heksana Biru : Fraksi Etil Asetat Hijau : Fraksi Etanol
Ungu : Kontrol Positif (Doxorubicin) Kuning : Kontrol Sel
Abu-Abu : Kontrol Medium
4.11.2. Larutan Uji Untuk Sel Vero dan Kontrol Positif
Keterangan Warna
Orange : Fraksi n-Heksana Biru : Fraksi Etil Asetat Hijau : Fraksi Etanol
Ungu : Kontrol Positif (Doxorubicin) Kuning : Kontrol Sel
Abu-Abu : Kontrol Medium
4.12. Uji Sitotoksisitas dengan Metode MTT
1. Diambil sel dari incubator CO2 lalu amati kondisinya 2. Dipanen sel berdasarkan protocol panen
3. Total sel dihitung dan dilakukan pengenceran menggunakan MK sesuai dengan keperluan sesuai dengan protokol perhitungan sel
4. Ditransfer sel ke sumuran. Tiap sumuran sebanyak 100 µl 5. Dikosongkan 3 sumuran sebagai kontrol medium
6. Diamati keadaan sel dibawah mikroskop inverted
7. Sel diinkubasi semalaman di inkubator CO2 supaya sel kembali dalam keadaan normal setelah panen
8. Perlakuan sel dengan sampel hanya boleh dilakukan apabila setelah sel kembali pulih. Apabila setelah di inkubasi semalaman sel belum pulih maka dilanjutkan inkubasi kembali
9. Apabila sel sudah kembali normal dilakukan pembuatan seri konsentrasi sampel untuk perlakuan berdasarkan dengan protocol saat preparasi sampel
10. Dilakukan pengambilan plate yang didalamnya sudah terdapat sel dari incubator CO2
11. Dimasukan masing masing seri konsentrasi sampel kedalam sumuran yang berisi sel
12. Selanjutnya sumuran disimpan di dalam incubator CO2 selama 24-48 jam (tergantung terlihatnya efek sitotoksik)
13. Kondisi sel diamati dan didokumentasikan
14. Dibuat reagen MTT (0,5 mg/ml) dibuat dengan mengambil sebanyak 1 ml MTT di dalam PBS (5 mg/ml), kemudian diencerkanmenggunakan MK ad 10 ml (untuk 1 buah 96 plate well)
15. Dibuang media di plate dan cuci menggunakan PBS
16. Dilakukan penambahan reagen MTT. Reagen ditambahkan 100 µl pada masing-masing sumuran termasuk kontrol sel dan kontrol media. Lalu dilakukan inkubasi selama 2-6 jam di dalam incubator CO2
17. Diamati Kristal formazen yang muncul pada kondisi sel
18. Ditambah stopper SDS 10% ke semua plate lalu bungkus menggunakan kertas atau alummunium foil dan diinkubasi selama satu malam pada suhu kamar di tempat yang gelap
19. Dihidupkan ELISA reader ditunggu progressing sampai selesai.
20. Dibuka pembungkus plate dan tutup plate. Dimasukkan ke dalam ELISA reader baca absorbansi masing-masing sumuran dengan ELISA reader dengan λ=550-600 nm (595 nm, tekan tombol START).
21. Setelah hasil dari ELISA keluar,lakukan analisis data menggunakan SPSS dan analisis harga IC50.
4.13. Analisis Data
Hasil data uji sitotoksisitas dapat dinyatakan dengan factor serapan kemudian dikonversikan ke persen kehidupan sel dengan menggunakan rumus sebagai berikut :
%kehidupan = absorbansi sumuran uji−absorbansi kontrol media
absorbansi kontrol sel−absorbansi kontrol media x100%
Analisa data dilakukan dengan menggunakan SPSS versi 32 dengan analisa probit digunakan untuk mencari suatu konsentrasi yang dapat membunuh atau mematikan 50% sampel dan juiga digunakan untuk menguji tingkat suatu konsentrasi terhadap respon dari sampel. Analisis dilakukan dengan analisa probit yang memiliki tujuan untuk menentukan nilai IC50 yang merupakan konsentrasi yang memiliki potensi unruk menghambat populasi poliferasi sel kanker yang mencapai 50% dari efek teoritis (Nevozhay, 2014). Berdasarkan penelitian yang sudah dilakukan, berdasarkan kategori aktivitas kanker dapat dikategorikan aktif apabila mempunyai aktivitas sebagai antikanker dengan nilai IC50 <30 μg/mL, dikategorikan moderate aktif apabila nilai IC50 30-100 μg/mL dan dikategorikan tidak aktif apabila nilai IC50 >100 μg/mL. (Amir, 2017., Bezivin, 2003., Sentilraja
& Kthiresan, 2015., Paputungam, 2017., Weerapreeyakul, 2012).
Tingkat selektifitas fraksi yang dapat membunuh sel kanker tanpa mempengaruhi sel normal dapat diketahui dengan perhitungan Selectivity Index (SI) dimana apabila nilai SI >3 dapat dikatakan selektif dan tidak selektif apabila nilai SI <3 (Sutejo, 2016).
Perhitungan Selektivitas terhadap sel vero ditentukan dengan menggunakan parameter Selectivity Index dengan rumus :
SI = IC50 𝑝𝑎𝑑𝑎 𝑠𝑒𝑙 𝑣𝑒𝑟𝑜 IC50 𝑝𝑎𝑑𝑎 𝑠𝑒𝑙 𝑘𝑎𝑛𝑘𝑒𝑟
