UJI SITOTOKSISITAS EKSTRAK ETANOLIK DAUN SIRIH MERAH (Piper crocatum Ruiz & Pav.) TERHADAP KULTUR SEL MIELOMA
SKRIPSI
Diajukan Untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)
Program Studi Ilmu Farmasi
Oleh:
Meri
NIM : 048114141
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA
2008
i
UJI SITOTOKSISITAS EKSTRAK ETANOLIK DAUN SIRIH MERAH (Piper crocatum Ruiz & Pav.) TERHADAP KULTUR SEL MIELOMA
SKRIPSI
Diajukan Untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)
Program Studi Ilmu Farmasi
Oleh:
Meri
NIM : 048114141
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA
2008
iii
HALAMAN PERSEMBAHAN
Untuk berguna bagi orang lain, pikiran harus terwujud
dalam tindakan.. Tidak ada tempat bagi kemalasan, yang ada
hanyalah karya yang baik tanpa henti
(At The Feet of Master)
Kupersembahkan karya ini untuk
Papa dan mamaku tercinta, atas kasih sayang, doa dan dukungan
yang terus menyertaiku.
Kakak-kakakku terkasih, Edy, Lina dan Hendry
Teman-teman dan Almamaterku
v
LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN
PUBLIKASI KARYA ILMIAH UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS
Yang bertanda tangan di bawah ini, saya mahasiswa Universitas Sanata Dharma :
Nama : Meri
Nomor Mahasiswa : 048114141
Demi pengembangan ilmu pengetahuan, saya memberikan kepada Perpustakaan Universitas Sanata Dharma karya ilmiah saya yang berjudul :
“Uji Sitotoksisitas Ekstrak Etanolik Daun Sirih Merah (Piper Crocatum Ruiz & Pav) terhadap Kultur Sel Mieloma”
beserta perangkat yang diperlukan (bila ada). Dengan demikian saya memberikan kepada Perpustakaan Universitas Sanata Dharma hak untuk menyimpan, me-ngalihkan dalam bentuk media lain, mengelolanya dalam bentuk pangkalan data, mendistribusikan secara terbatas, dan mempublikasikannya di Internet atau media lain untuk kepentingan akademis tanpa perlu meminta ijin dari saya maupun memberikan royalti kepada saya selama tetap mencantumkan nama saya sebagai penulis.
Demikian pernyataan ini yang saya buat dengan sebenarnya.
Dibuat di Yogyakarta
Pada tanggal : 21 Juli 2008
Yang menyatakan,
( Meri)
vii
PRAKATA
Puji syukur kepada Tuhan Yang Maha Esa atas segala anugerah-Nya
sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi dengan judul “Uji Sitotoksisitas
Ekstrak Etanolik Daun Sirih Merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.) terhadap Kultur
Sel Mieloma”. Skripsi ini dibuat untuk memenuhi salah satu syarat memperoleh
gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) pada Program Studi Farmasi di Universitas Sanata
Dharma.
Penulisan skripsi ini tidak mungkin terselesaikan tanpa adanya bimbingan,
bantuan dan dukungan dari berbagai pihak, maka pada kesempatan ini, penulis
mengucapkan terima kasih kepada:
1. Rita Suhadi, M.Si., Apt., selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata
Dharma yang telah banyak meluangkan waktu, tenaga dan atas segala
masukan serta sarannya dalam penyusunan skripsi ini.
2. Drs. A. Yuswanto S.U., Ph.D., Apt., selaku dosen pembimbing yang telah
banyak meluangkan waktu, tenaga dan atas segala masukan serta sarannya
dalam penyusunan skripsi ini.
3. Drs. Mulyono, Apt., selaku dosen penguji yang telah berkenan menguji dan
memberikan banyak masukan dan saran.
4. Yohanes Dwiatmaka, M.Si., selaku dosen penguji yang telah berkenan
menguji dan memberikan banyak masukan dan saran.
5. Ign. Y Kristyo B, M.Si., yang telah memberikan banyak masukan dalam
viii
6. Drs. P. Sunu Hardiyanta, S.J., M.Sc., yang telah memberikan masukan dan
saran dalam pengolahan statistik.
7. Jeffry Julianus, M.Si., yang telah memberikan banyak masukan dalam uji
sitotoksisitas.
8. Segenap dosen dan karyawan di Fakultas Farmasi Universitas Sanata
Dharma, terima kasih atas bantuannya selama ini.
9. Mbak Yuli dan segenap karyawan Laboratorium Hayati UGM yang telah
banyak membantu dalam penelitian skripsi ini.
10.Orang tua dan kakak-kakakku tercinta, atas segala dukungan dan doa yang
selalu menyertaiku.
11.Chong, kekasihku tercinta, atas segala dukungan dan kasih sayang yang
diberikan selama penyusunan skripsi ini.
12.Siska, Nur’aniyah, Ririt dan Eva, atas kerjasama, canda tawa, dan keluh
kesah selama penyusunan skripsi ini.
13.Limdrawati, Fenny Octarina dan semua teman-teman angkatan 2004, terima
kasih atas segala semangat dan kebersamaan kita yang indah.
14.Semua pihak yang telah banyak membantu penyusunan skripsi ini.
Atas segala bantuan yang telah diberikan selama ini, penulis mengucapkan
banyak terima kasih. Penulis juga menyadari bahwa penulisan skripsi ini tidak
terlepas dari kekurangan-kekurangan. Oleh karena itu, penulis mengharapkan kritik
dan saran yang bersifat konstruktif demi penyempurnaan skripsi ini. Skripsi ini
diharapkan dapat bermanfaat bagi perkembangan ilmu pengetahuan.
PERNYATAAN KEASLIAN KARYA
Saya menyatakan dengan sesungguhnya bahwa skripsi yang saya tulis ini tidak
memuat karya atau bagian karya orang lain, kecuali yang telah disebutkan dalam
kutipan dan daftar pustaka, sebagaimana layaknya karya ilmiah.
Yogyakarta, 09 Mei 2008
Penulis,
Meri
ix
INTISARI
Penggunaan obat tradisional di masyarakat telah berkembang semakin pesat. Daun sirih merah secara empiris memiliki banyak khasiat, salah satunya sebagai antikanker. Akan tetapi, belum ada penelitian yang membuktikan bahwa daun sirih merah memiliki aktivitas sebagai antikanker. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui apakah ekstrak etanolik daun sirih merah memiliki efek sitotoksik terhadap kultur sel mieloma.
Penelitian ini termasuk penelitian eksperimental murni dengan rancangan acak lengkap pola searah. Uji sitotoksisitas dilakukan dengan menghitung jumlah kultur sel mieloma pada kelompok kontrol dan kelompok perlakuan yang diberi ekstrak etanolik daun sirih merah. Metode uji sitotoksisitas yang digunakan adalah metode perhitungan langsung dengan pewarna trypan blue. Data yang diperoleh berupa persen kematian kultur sel mieloma. Efek sitotoksisitas ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap kultur sel mieloma dianalisis secara statistik dengan Anova satu arah dan harga LC50 dihitung dengan analisis probit.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak etanolik daun sirih merah memiliki efek sitotoksik terhadap kultur sel mieloma dengan harga LC50 sebesar
434,1 μg/ml.
Kata kunci : daun sirih merah, kultur sel mieloma, sitotoksisitas, harga LC50
ABSTRACT
Nowadays, the use of traditional drugs in society has expanded rapidly. Empirically, celebes pepper leaves has a lot of medicinal actions, one of them is anticancer. However, there are still no research that claim celebes pepper leaves have an anticancer activity. This study aims to determine whether extract ethanolic had cytotoxic effect or not.
The study was pure experimental research with random complete and one way design. Myeloma cell cultures in control group and group with ethanolic extract of celebes pepper leaves is counted. The cytotoxicity effect was determined by using direct counting method with trypan blue stain. Data were collected by counting the percentage of death cells. Cyotoxicity effect of the ethanolic extract of celebes pepper leaves were analyzed using one way Anova and the LC50 value were analyzed
using probit statistic.
The result showed that ethanolic extract of celebes pepper leaves had cytotoxic effect to myeloma cell cultures with LC50 value of 434.1 μg/ml.
keywords : celebes pepper leaves, myeloma cell cultures, cytotoxicity, LC50 value
xi
DAFTAR ISI
Halaman
HALAMAN JUDUL ... ii
HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ... . iii
HALAMAN PENGESAHAN ... iv
HALAMAN PERSEMBAHAN ... v
PRAKATA ... vi
PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ... viii
INTISARI ... ix
ABSTRACT ... x
DAFTAR ISI ... xi
DAFTAR TABEL ... xv
DAFTAR GAMBAR ... xvi
DAFTAR LAMPIRAN ... xvii
BAB I PENGANTAR ... 1
A. Latar Belakang ... 1
1. Rumusan masalah ... 2
2. Keaslian penelitian ... 3
3. Manfaat penelitian ... 3
B. Tujuan ... 3
1. Tujuan umum ... ... 3
2. Tujuan khusus ... ... 4
xiii
BAB II PENELAAHAN PUSTAKA ... 5
A. Tanaman Sirih Merah ... 5
1. Keterangan botani ... 5
2. Uraian tanaman ... 5
3. Kandungan kimia ... 6
4. Khasiat dan penggunaan ... 6
5. Penelitian ... 7
B. Kanker ... 7
1. Karsinogenesis ... 8
2. Kanker sel plasma ... 9
3. Sel mieloma ... 9
C. Ekstraksi ………. ... 10
D. Uji Sitotoksisitas ... 11
E. Landasan Teori ... 12
F. Hipotesis ... 13
BAB III METODOLOGI PENELITIAN ... 14
A. Jenis dan Rancangan Penelitian ... 14
B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional ... 14
1. Variabel bebas ... 14
2. Variabel tergantung ... 14
3. Variabel pengacau terkendali ... 14
xiv
C. Alat dan Bahan ... 15
1. Alat .... ... 15
2. Bahan .. ... 16
D. Tata Cara Penelitian ... 16
1. Determinasi tanaman ... 16
2. Pengumpulan daun sirih merah ... 17
3. Preparasi ekstrak etanolik daun sirih merah ... 17
4. Pembuatan larutan uji ... 18
5. Pembuatan medium pencuci ... 18
6. Pembuatan medium penumbuh ... 18
7. Propagasi sel mieloma ... 18
8. Panen sel mieloma ... 19
7. Uji sitotoksisitas ekstrak etanolik daun sirih merah ... 20
E. Analisis Hasil ... 20
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ... 22
A. Determinasi Tanaman ... 22
B. Pengumpulan Daun Sirih Merah ... 22
C. Preparasi Ekstrak Etanolik Daun Sirih Merah ... 24
D. Pembuatan Medium Pencuci dan Medium Penumbuh ... 25
E. Propagasi dan Panen Sel Mieloma ... 26
BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN ... 36
A. Kesimpulan ... 36
B. Saran ... 36
DAFTAR PUSTAKA ... 37
LAMPIRAN ... 41
BIOGRAFI PENULIS ... 57
xv
xvi
DAFTAR TABEL
Halaman
Tabel I. Data perhitungan jumlah kultur sel mieloma dengan perhitungan
langsung ... 44
Tabel II. Data persentase kematian kultur sel mieloma ... 29
Tabel III. Data log konsentrasi, % kematian dan harga probit pada
replikasi I ... 51
Tabel IV. Data log konsentrasi, % kematian dan harga probit pada
replikasi II ... 51
Tabel V. Data log konsentrasi, % kematian dan harga probit pada
replikasi III ... 52
Tabel VI. Nilai r (koefisien korelasi) pada level signifikansi 5% dan 1%... 53
xvii
DAFTAR GAMBAR
Halaman
Gambar 1. Foto kultur sel mieloma di sumuran kontrol ... 27
Gambar 2. Kultur sel mieloma di haemocytometer ... 28
Gambar 3. Grafik konsentrasi (µg/ml) terhadap persen kematian kultur sel mieloma ... … 29
Gambar 4. Kultur sel mieloma di sumuran perlakuan ... 31
Gambar 5. Grafik log konsentrasi terhadap harga probit pada replikasi I …... 33
Gambar 6. Grafik log konsentrasi terhadap harga probit pada replikasi II ... 33
Gambar 7. Grafik log konsentrasi terhadap harga probit pada replikasi III … 34
Gambar 8. Tanaman sirih merah ………... 41
Gambar 9. Daun sirih merah ………... 42
Gambar 10. Medium pencuci dan medium penumbuh ... 42
Gambar 11. Sentrifuge ... 42
Gambar 12. Mikroskop ... 42
Gambar 13. Haemocytometer dan cell count ... 42
Gambar 14. Tabung conical steril dan 96-well plate ... 42
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
Lampiran 1. Foto tanaman sirih merah ………... 41
Lampiran 2. Foto medium dan peralatan uji sitotoksisitas... 42
Lampiran 3. Perhitungan jumlah kultur sel mieloma tiap sumuran ... 43
Lampiran 4. Perhitungan jumlah kultur sel mieloma yang hidup... 44
Lampiran 5. Perhitungan persentase kematian kultur sel mieloma... 48
Lampiran 6. Perhitungan LC50 dengan analisis probit dan uji linearitas ………... 51
Lampiran 7. Analisis statistik dengan Anova satu arah... 54
Lampiran 8. Tabel probit ... 55
Lampiran 9. Hasil determinasi tanaman sirih merah ... 56
BAB I
PENGANTAR
A. Latar Belakang
Kanker merupakan salah satu penyakit yang menyebabkan kematian di
seluruh dunia. Data Organisasi Kesehatan Dunia (WHO) yang diterbitkan pada tahun
2007 menyebutkan, sebanyak 7,6 juta jiwa meninggal pada tahun 2005 dan 84 juta
orang lainnya akan mati dalam jangka waktu 10 tahun ke depan, jika tidak ada
tindakan nyata untuk menanggulangi penyakit ini. Di Indonesia, kanker menduduki
peringkat keenam sebagai penyebab kematian utama. Sekitar 800.000 orang
Indonesia terserang kanker tiap tahunnya (Anonim, 2007a).
Pada kasus kanker sel plasma, American Cancer Society memperkirakan
19.900 kasus baru akan terjadi pada tahun 2007. Jumlah kematian akibat penyakit ini
sekitar 10.790 jiwa, terdiri dari 5.550 pria dan 5.240 wanita. Dari 10,5 miliar pasien
kanker diperkirakan jumlah pasien multiple myeloma sebanyak 63.000 jiwa (Rados,
2007).
Pengobatan kanker sangat bervariasi dan tergantung pada faktor jenis,
lokasi, kuantitas penyakit serta status kesehatan pasien. Beberapa jenis pengobatan
kanker yang dapat dilakukan adalah pembedahan, radiasi, kemoterapi, terapi hormon,
inhibitor spesifik, antibodi, dan vaksin (Anonim, 2002). Akan tetapi, berbagai
pengobatan tersebut memiliki banyak efek yang merugikan pasien dan membutuhkan
biaya yang mahal.
Penggunaan obat tradisional di masyarakat telah berkembang semakin pesat.
Obat tradisional merupakan obat dari bahan-bahan alam yang memiliki khasiat untuk
menyembuhkan penyakit. Pada umumnya, harga obat tradisional lebih murah
dibandingkan dengan obat modern. Oleh karena itu, masyarakat mulai beralih
menggunakan obat tradisional yang memiliki efek terapi sama dengan obat modern.
Sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.) merupakan salah satu tanaman
yang memiliki berbagai khasiat. Secara empiris, daun sirih merah digunakan untuk
mengobati kanker, kencing manis, ambeien, peradangan, asam urat, hepatitis, maag,
peradangan akut pada organ tubuh tertentu, luka yang sulit sembuh, TBC, lemah
sahwat, jantung koroner, darah tinggi, dan asam urat (Sudewo, 2005).
Untuk membuktikan klaim antikanker yang beredar di masyarakat, maka
diperlukan penelitian terhadap daun sirih merah. Dalam penelitian ini, digunakan
kultur sel mieloma untuk mengetahui apakah ekstrak etanolik daun sirih merah
bersifat sitotoksik terhadap sel kanker. Hasil penelitian ini diharapkan dapat
digunakan sebagai dasar pengembangan senyawa antikanker dari tanaman sirih
merah untuk pengobatan kanker sel plasma.
1. Rumusan masalah
Berdasarkan latar belakang yang telah dipaparkan, maka dapat dirumuskan
permasalahan sebagai berikut:
a. apakah ekstrak etanolik daun sirih merah bersifat sitotoksik ?
b. seberapa besar harga LC50 dari ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap kultur
sel mieloma?
2. Keaslian penelitian
Sejauh yang diketahui penulis, penelitian mengenai uji sitotoksisitas ekstrak
etanolik daun sirih merah terhadap kultur sel mieloma belum pernah dilakukan.
3. Manfaat penelitian
Penelitian mengenai uji sitotoksisitas ekstrak etanolik daun sirih merah ini
diharapkan memiliki beberapa manfaat, antara lain:
a. manfaat teoritis yang dapat diperoleh ialah untuk melengkapi dan memperkaya
teori yang telah ada mengenai khasiat daun sirih merah serta memberikan
informasi tentang efek sitotoksisitas ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap
kultur sel mieloma.
b. manfaat praktis yang dapat diperoleh ialah sebagai bukti ilmiah mengenai klaim
khasiat daun sirih merah sebagai antikanker.
B. Tujuan
1. Tujuan umum
Untuk mengetahui apakah ekstrak etanolik daun sirih merah bersifat
sitotoksik.
2. Tujuan khusus :
a. untuk mengetahui apakah ekstrak etanolik daun sirih merah bersifat sitotoksik
terhadap kultur sel mieloma.
b. untuk mengetahui seberapa besar harga LC50 ekstrak etanolik daun sirih merah
terhadap kultur sel mieloma.
BAB II
PENELAAHAN PUSTAKA
A. Tanaman Sirih Merah
1. Keterangan botani
Tanaman sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.) termasuk dalam famili
: Piperaceae (Anonim, 2007b), memiliki sinonim Piper ornatum N.E. Br. (Anonim,
2006a). Di daerah Sulawesi, tanaman ini dikenal dengan nama Celebes pepper
(Anonim, 2007c).
2. Uraian tanaman
Menurut Sudewo (2005), tanaman sirih merah tumbuh menjalar seperti
halnya sirih hijau. Batangnya bulat berwarna hijau keunguan dan tidak berbunga.
Daunnya bertangkai membentuk jantung dengan bagian atas meruncing, bertepi rata,
dan permukaannya mengkilap atau tidak berbulu. Panjang daunnya bisa mencapai
15-20 cm. Warna daun bagian atas hijau bercorak warna putih keabu-abuan. Bagian
bawah daun berwarna merah hati cerah. Daunnya berlendir, berasa sangat pahit, dan
beraroma wangi khas sirih. Batangnya beruas dengan jarak buku 5-10 cm dan di
3. Kandungan kimia
Kandungan kimia tanaman ini belum diteliti secara detil. Dari hasil
kromatogram diketahui daun sirih merah mengandung flavonoid, alkaloid, senyawa
polifenolat, tanin, dan minyak atsiri (Sudewo, 2005).
Beberapa penelitian menunjukkan adanya efek sitotoksisitas dari senyawa
flavonoid dan alkaloid. Menurut Devie (2007), kematian 50% sel mieloma terjadi
akibat pemberian fraksi alkaloid daun jarong (Achyrantes aspera Linn) terjadi pada
dosis 1 µg/ml. Kematian sel mieloma diduga akibat proses degenerasi, nekrosis, dan
apoptosis. Kunci pepet (Kaempferia rotunda Linn) mengandung senyawa alkaloid,
flavonoid, dan polifenol memberikan efek sitotoksitas pada sel mieloma dengan LC50
sebesar 7,36 g/ml (Wahyuningsih, 2004). Suatu penelitian menunjukkan efek
sitotoksisitas ekstrak etanol kalus mahkota dewa (Phaleria macrocarpa (Scheff)
Boerl.) terhadap sel mieloma dengan LC50 sebesar 12,53 µg/ml. Hasil analisis
menunjukkan bahwa ekstrak etanol kalus mahkota dewa mengandung senyawa
golongan alkaloid, terpenoid, dan flavonoid (Setyaningsih, 2005).
4. Khasiat dan penggunaan
Secara empiris, ekstrak daun sirih merah dalam pemakaian secara tunggal
atau diformulasikan dengan tanaman obat lainnya mampu membasmi aneka
penyakit, seperti kanker payudara, kanker rahim, leukemia, diabetes melitus,
peradangan akut pada organ tubuh tertentu, luka yang sulit sembuh, TBC, radang
pada lever, lemah sahwat, ambeien, jantung koroner, darah tinggi, dan asam urat
5. Penelitian
Sepengetahuan penulis, belum ada penelitian mengenai uji sitotoksisitas
daun sirih merah terhadap kultur sel mieloma. Beberapa penelitian yang pernah
dilakukan pada daun sirih merah adalah :
a. Toksisitas ekstrak air daun sirih merah dan kemampuannya dalam menurunkan
kadar glukosa darah tikus. Hasil penelitian menunjukkan ekstrak daun sirih merah
dosis 20 g/kg BB dapat menurunkan glukosa darah tikus sebesar 34,3 %.
Penurunan lebih tinggi dibandingkan dengan obat anti DM komersial Daonil 3,22
ml/kg yang hanya menurunkan 27 % glukosa darah tikus (Diek, 2005).
b. Skrining fitokimia daun sirih merah. Hasil penelitian menunjukkan sirih merah
mengandung flavonoid, senyawa polifenolat, alkaloid, tanin dan minyak atsiri
(Sudewo, 2005).
B. Kanker
Kanker merupakan penyakit yang ditandai dengan proliferasi sel yang tidak
terkontrol dan mengarah pada invasi jaringan di sekitarnya serta menyebar ke bagian
lain dalam tubuh (metastasis) (King, 2000).
Kanker disebabkan oleh mutagen, yaitu substansi yang dapat menyebabkan
mutasi DNA. Mutagen yang menyebabkan kanker adalah karsinogen. Berdasarkan
jenisnya, karsinogen terbagi menjadi 3 yaitu: karsinogen kimia, fisik dan biologi.
Karsinogen kimia berasal dari zat-zat kimia seperti nitrosamina, kadmium, dan
aflatoksin. Karsinogen fisik berasal dari pemaparan sinar X dan ultraviolet,
papiloma, virus hepatitis B, dan bakteri helikobakter pylori (Yuswanto dan Sinardi,
2000).
Menurut jaringan asal pertumbuhannya, kanker dapat diklasifikasikan
menjadi 3 kelompok, yaitu (1) karsinoma, merupakan kanker yang tumbuh dari
jaringan epitel, meliputi membran mukosa dan kelenjar (seperti kanker payudara,
paru-paru dan ovarium); (2) sarkoma, merupakan kanker yang berasal dari jaringan
mesodermal yang terdiri dari jaringan ikat, tulang atau sel otot; dan (3) blastoma,
berasal dari hemopoetik dan jaringan darah, meliputi jaringan limfosit yang berasal
dari leukosit dan mungkin juga berasal dari limfatik atau monositik (Bosman, 1999).
1. Karsinogenesis
Karsinogenesis merupakan proses transformasi sel normal menjadi sel
kanker. Karsinogenesis disebabkan oleh mutasi sel normal yang merusak
keseimbangan antara proliferasi dan kematian sel normal. Hal ini menghasilkan
pembelahan sel yang tidak terkontrol dan pembentukan tumor. Proliferasi sel yang
tidak terkontrol dan cepat, mempermudah terbentuknya tumor jinak, beberapa tipe
tumor tersebut dapat berubah menjadi tumor ganas (kanker). Tumor jinak tidak dapat
menyebar ke bagian lain dalam tubuh atau menyerang jaringan lain, dan jarang
mengancam jiwa kecuali mereka menekan struktur utama atau fisiologi aktif seperti
produksi hormon. Tumor ganas dapat menyerang organ lain, menyebar ke lokasi
2. Kanker sel plasma
Kanker sel plasma merupakan tipe kanker yang berkembang dari sel dalam
sumsum tulang yang disebut sel plasma. Kanker ini dapat berkembang di
tempat-tempat yang terdapat sumsum tulang, termasuk tulang pinggul, tulang belakang dan
tulang rusuk (Anonim, 2007d). Penyebab kanker sel plasma tidak diketahui secara
pasti (Anonim, 2006b). Akan tetapi, penelitian menunjukkan bahwa terjadi
perubahan DNA pada sel mieloma. Kebanyakan sel mieloma kehilangan semua atau
satu bagian pada kromosom 13. Sel yang kehilangan kromosom 13 cenderung lebih
agresif dibandingkan sel yang memiliki kromosom 13 normal (Fronseca, 2008).
Dalam keadaan normal, ketika antigen masuk ke dalam tubuh, limfosit B
akan berkembang menjadi sel plasma dan menghasilkan antibodi untuk melawan
antigen tersebut. Pada kanker sel plasma, limfosit B mengalami kerusakan secara
genetik sehingga terjadi peningkatan jumlah sel plasma dan antibodi yang berlebihan
(Lonial, 2005).
Ketika sel plasma tumbuh tak terkontrol, mereka dapat menghasilkan tumor.
Tumor ini umumnya berkembang di dalam sumsum tulang. Apabila, hanya terdapat
satu tumor, maka disebut plasmacytoma. Biasanya, tumor sel plasma menyebar
melewati sumsum tulang dan terdapat di beberapa tempat, yang disebut sebagai
multiple myeloma (Anonim, 2006c).
3. Sel mieloma
Sel mieloma pertama kali diambil dari Marwin Plasma Cell Tumour-11
Scharff. Sel tumor ini diadaptasi ke dalam kultur secara terus menerus sampai 6 kali
dan dipelihara dalam erlenmeyer yang berisi media Dulbecco’s-Eagle’s dengan asam
amino essensial dan 20% serum kuda yang inaktif. Sel mieloma menyerupai sel
tumor induk yang dapat memproduksi gamaglobulin (IgG2b), 5-6ug IgG2b per sel
per menit. Waktu pembelahan sel kurang lebih 17 jam. Kultur sel mieloma memiliki
karakteristik yaitu bentuk selnya hampir bulat sempurna, bergerombol, melekat di
dasar flask dan akan terlepas dari dasar flask dengan agitasi ringan (Irawati, 2005).
C. Ekstraksi
Ekstraksi merupakan kegiatan penarikan kandungan kimia yang dapat larut
sehingga terpisah dari bahan yang tidak larut dengan pelarut cair. Simplisia yang
diekstrak mengandung senyawa aktif yang dapat larut dan senyyawa tidak dapat larut
seperti serat, karbohidrat, protein dan lain-lain. Senyawa aktif yang dapat larut
digolongkan ke dalam golongan minyak atsiri, alkaloid, flavonoid dan lain-lain
(Anonim, 2000).
Bahan baku tumbuhan yang diekstraksi akan menghasilkan produk, yakni
ekstrak tumbuhan obat. Ekstrak adalah sediaan pekat yang diperoleh dengan
mengekstraksi zat aktif dari simplisia nabati atau simplisia hewani menggunakan
pelarut yang sesuai, kemudian pelarut diuapkan dari massa atau serbuk yang
memenuhi baku tertentu yang telah ditetapkan (Anonim, 2000).
Salah satu cara ekstraksi yang sering dilakukan adalah metode maserasi.
Maserasi merupakan proses perendaman sampel dengan pelarut organik yang
senyawa bahan alam karena dengan perendaman sampel tumbuhan akan terjadi
pemecahan dinding dan membran sel akibat perbedaan tekanan antara di dalam dan
di luar sel sehingga metabolit sekunder yang ada dalam sitoplasma akan terlarut
dalam pelarut organik dan ekstraksi senyawa akan sempurna karena dapat diatur
lama perendaman yang dilakukan. Pemilihan pelarut untuk proses maserasi akan
memberikan efektifitas yang tinggi dengan memperhatikan kelarutan senyawa bahan
alam pelarut tersebut (Lenny, 2006). Keuntungan metode maserasi adalah cara
pengerjaan dan alat yang digunakan sederhana dan mudah diusahakan. Akan tetapi,
metode ini memiliki kelemahan, yakni waktu pengerjaannya lama (Mustofa, 2007).
Pelarut cair yang sering digunakan pada pembuatan ekstrak adalah air dan
campuran etanol air. Bila digunakan cairan penyari air maka untuk mencegah
tumbuhnya jamur dapat ditambahkan bahan pengawet yang diberikan pada awal
penyarian (Anonim, 2000).
D. Uji Sitotoksisitas
Sitotoksisitas adalah sifat toksis atau beracun suatu senyawa terhadap sel
yang hidup. Uji sitotoksisitas adalah uji in vitro dengan menggunakan kultur sel yang
digunakan dalam evaluasi keamanan obat, kosmetika, zat tambahan makanan,
pestisida, dan digunakan juga untuk mendeteksi adanya aktivitas sitotoksik dari suatu
senyawa. Sistem ini merupakan uji kualitatif dan kuantitatif dengan cara menetapkan
kematian sel (Freshney, 2000).
Salah metode uji sitotoksisitas yang sering digunakan adalah metode
digunakan untuk menghitung sel secara efisien dan akurat adalah menggunakan
haemocytometer. Alat ini berupa counting chamber yang memiliki ketebalan 0,1 mm
dan squared graduation untuk memudahkan perhitungan. Ketika suspensi sel
diisikan ke dalam chamber, sel dapat diamati di bawah mikroskop dan dihitung
dalam ruled square yang dipilih. Dari perhitungan ini, jumlah sel per ml suspensi
dapat dihitung secara langsung (Doyle and Griffiths, 2000).
Trypan blue biasa digunakan untuk membedakan sel hidup dari sel mati. Sel
hidup tidak terwarnai, bulat dan relatif kecil dibandingkan dengan sel mati.
Sedangkan sel mati membengkak dan berwarna biru (Doyle and Griffiths, 2000).
Dalam beberapa hal, penggunaan trypan blue dihindari karena menyebabkan
lapangan pandang berwarna gelap sehingga sulit membedakan sel hidup dan sel mati
(Elly, 2002). Pemaparan trypan blue yang lebih dari 15 menit juga akan mewarnai
sel hidup (Anonim, 1999).
E. Landasan Teori
Saat ini banyak bahan-bahan alam yang digunakan dalam pengobatan
kanker, seperti daun sirih merah. Akan tetapi, belum ada penelitian yang mendukung
klaim khasiat daun sirih merah sebagai antikanker. Dari hasil skrining fitokimia,
diketahui bahwa daun sirih merah mengandung flavonoid, alkaloid, senyawa
polifenolat, tanin, dan minyak atsiri.
Flavonoid terbagi menjadi 6 subkelas, yaitu : flavon (apigenin, luteolin),
flavonol (kuersetin, mirisetin), flavanon (naringenin dan hesperidin), flavanol
(genistein dan daidezin) (Ross and Kasum, 2002). Beberapa jenis flavonoid yang
memiliki efek antikanker adalah kuersetin, genistein, daidezin, dan antosianin
(Grotewold, 2006). Kebanyakan senyawa golongan ini larut dalam air dan pelarut
organik lainnya seperti metanol, etanol dan aseton. Flavonoid berperan sebagai
inhibitor enzim DNA topoisomerase sel kanker. Enzim tersebut merupakan enzim
yang berperan dalam proses replikasi, transkripsi dan rekombinasi DNA serta proses
proliferasi dan diferensiasi sel kanker (Sukardiman, 1999).
Alkaloid merupakan salah satu senyawa organik terbanyak di alam dan
tersebar pada tumbuhan. Alkaloid terdiri dari golongan piridin, pirolidin, tropan,
kuinolin, isokuinolin, penetilamin, indol, purin, terpenoid, dan vinka. Senyawa
golongan ini tidak larut dalam air, tetapi larut dalam pelarut organik, seperti etanol,
metanol, kloroform dan eter. Golongan alkaloid vinka telah diketahui memiliki
aktivitas sebagai antikanker, misalnya vinkristin dan vinblastin yang dapat
menghambat pembelahan sel kanker (Anonim, 2008b).
Penelitian dari beberapa tanaman menujukkan bahwa senyawa alkaloid dan
flavonoid memiliki efek sitotoksisitas terhadap sel mieloma. Hal tersebut mendasari
penelitian uji sitotoksisitas ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap kultur sel
mieloma ini, untuk melihat apakah ekstrak etanolik daun sirih merah bersifat
sitotoksik terhadap kultur sel mieloma.
F. Hipotesis
Ekstrak etanolik daun sirih merah bersifat sitotoksik terhadap kultur sel
BAB III
METODOLOGI PENELITIAN
A. Jenis dan Rancangan Penelitian
Penelitian uji sitotoksisitas ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap kultur
sel mieloma ini termasuk penelitian eksperimental murni dengan rancangan acak
lengkap pola satu arah.
B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional
1. Variabel utama
a. Variabel bebas
Kadar ekstrak etanolik daun sirih merah, yaitu : 250 µg/ml, 500 µg/ml, 750 µg/ml,
1000 µg/ml, 1250 µg/ml, 1500 µg/ml, 1750 µg/ml, dan 2000 µg/ml.
b. Variabel tergantung
Persentase kematian kultur sel mieloma.
2. Variabel pengacau terkendali
a. Medium tumbuh sel dikendalikan dengan menggunakan medium RPMI-1640
serum.
b. Tempat tumbuh dan waktu pemanenan daun sirih merah dikendalikan dengan
c. Kematian alami sel mieloma dikendalikan dengan adanya kontrol kultur sel
mieloma.
3. Definisi operasional
a. Sitotoksisitas ialah sifat toksik atau beracun dari ekstrak etanolik daun sirih
merah terhadap kultur sel mieloma.
b. Ekstrak etanolik ialah ekstrak yang diperoleh dengan cara mengekstraksi daun
sirih merah secara maserasi menggunakan larutan penyari etanol 70%.
c. LC50 ialah konsentrasi ekstrak etanolik daun sirih merah yang mampu membunuh
atau menyebabkan kematian sejumlah 50% kultur sel mieloma dan dinyatakan
dalam µg/ml.
C. Alat dan Bahan
1. Alat
Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini terdiri atas : alat-alat gelas,
oven, blender, ayakan, kertas saring, filter polietilensulfon, timbangan analitik
(Mettler Toledo), alumunium foil, autoklaf, tissue culture flask (Nunc), tabung
conical (Nunc), swing rotor sentrifuge (Centrifuge), inkubator (Memmer),
mikropipet, lemari pendingin (Sharp), cell counter (Rogoshiseiki), 96-well plate
(NunclonTM), laminar air flow (LabconcoR), mikroskop (Olympus), haemocytometer
(Neubauer Improved), yellowtip, bluetip, tabung effendrof, tisu, sarung tangan dan
masker.
2. Bahan
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini ialah :
a. Daun sirih merah segar
b. Kultur sel mieloma yang diambil dari stok di Laboratorium Hayati Universitas
Gadjah Mada, Yogyakarta.
c. Larutan penyari yang digunakan dalam preparasi ekstrak etanolik daun sirih
merah, yakni etanol 70%
d. Medium pencuci : RPMI-1640, Natrium bikarbonat, Hepes
e. Medium penumbuh : RPMI-1640, FBS (Foetal Bovine Serum) 10%,
Penisilin-Streptomisin 1%, dan Fungison 0,5%.
f. Reagen pewarna : Trypan Blue
g. Aquabidest
h. Dimethyl Sulfoxide (DMSO)
D. Tata Cara Penelitian
1. Determinasi tanaman
Bahan utama yang akan digunakan dalam penelitian, yaitu daun sirih merah,
dideterminasi terlebih dahulu di laboratorium Biologi Farmasi, Fakultas Farmasi
Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta dan dipastikan juga kebenarannya
2. Pengumpulan daun sirih merah
Daun sirih merah yang digunakan diambil dari tanaman daun sirih merah
yang tumbuh di desa Mantenan, kecamatan Mertoyudan, kabupaten Magelang, Jawa
Tengah, pada bulan September 2007.
3. Preparasi ekstrak etanolik daun sirih merah
Daun sirih merah dipetik, disortir, dicuci dengan air mengalir dan ditiriskan.
Setelah itu, daun sirih merah dikeringkan dengan menggunakan oven pada suhu
60-700C dan diserbuk dengan blender sampai halus serta diayak dengan menggunakan
ayakan 0,75 mm.
Selanjutnya, dilakukan ekstraksi daun sirih merah dengan metode maserasi.
Serbuk daun sirih merah ditimbang dan diekstraksi dengan larutan penyari etanol
70%. Untuk tiap 10 bagian (100 g) serbuk digunakan 75 bagian (750 ml) etanol
70%, ditutup dan dibiarkan selama 24 jam terlindung dari cahaya matahari. Setelah
24 jam sari diserkai, disaring, ampas diperas, ampas ditambah cairan penyari
secukupnya, diaduk dan diserkai sehingga diperoleh seluruh sari sebanyak 100
bagian. Bejana ditutup, dibiarkan di tempat sejuk, terlindung dari cahaya, selama 2
hari kemudian endapan dipisahkan. Rendaman harus dikocok berulang-ulang
(kira-kira 3 kali sehari). Setelah 2 hari maserat disaring dengan kertas saring, kemudian
ditampung. Maserat yang terkumpul kemudian dipekatkan di atas waterbath dengan
suhu 60-65oC, dibantu dengan kipas angin sampai kental.
4. Pembuatan larutan uji
Ekstrak etanolik daun sirih merah ditimbang sebanyak 0,1 g, dilarutkan
dengan DMSO dan diaduk sampai homogen untuk mendapatkan sediaan ekstrak
induk dengan konsentrasi 100 mg/ml. Dari sediaan ekstrak induk tersebut, dibuat
sediaan uji, dengan konsentrasi sebesar 250 µg/ml, 500 µg/ml, 750 µg/ml, 1000
µg/ml, 1250 µg/ml, 1500 µg/ml, 1750 µg/ml, dan 2000 µg/ml.
5. Pembuatan medium pencuci
RPMI-1640 dilarutkan dalam aquabidest kurang lebih 80 ml, ditambah 2,3 g
natrium bikarbonat, 2 g Hepes, diencerkan sampai 100 ml, pH dibuat 7,2, lalu
disterilkan dengan filter polietilensulfon yang berdiameter 0,22 μm secara aseptis.
Medium disimpan dalam lemari pendingin pada suhu 4oC (Freshney, 1986; Jacoby
and Pastan, 1979; Sambrook, Fritsch and Maniatis, 1989).
6. Pembuatan medium penumbuh
Untuk medium RPMI-1640 serum, ditambahkan FBS (Foetal Bovine
Serum) 10%, penisilin-streptomisin 1% dan fungison 0,5% dalam medium RPMI-
1640 dan disterilkan dengan filter polietilensulfon yang berdiameter 0,22 μm secara
aseptis. Medium disimpan dalam lemari pendingin pada suhu 4oC (Freshney, 1986;
Jacoby and Pastan, 1979; Sambrook et al, 1989).
7. Propagasi sel mieloma
Sel diambil dari tangki nitrogen cair, kemudian segera dicairkan dalam
dan sel mieloma dipindahkan dalam tabung conical steril yang berisi medium
RPMI-1640. Suspensi sel disentrifugasi selama 5 menit, supernatan dibuang, diganti dengan
medium RPMI-1640 yang baru, kemudian disuspensikan perlahan. Suspensi sel lalu
disentrifugasi kembali selama 5 menit kemudian dicuci ulang sekali lagi. Supernatan
dibuang, pelet ditambahkan 1 ml medium penumbuh yang mengandung 10% FBS.
Resuspensikan secara perlahan sampai homogen, kemudian sel ditumbuhkan dalam
tissue culture flask kecil dan diinkubasikan dalam inkubator dengan suhu 37oC dan
aliran 5% CO2. Setelah 24 jam, medium penumbuh diganti dan sel ditumbuhkan
hingga konfluen dan jumlahnya cukup untuk penelitian (Freshney, 1986; Jacoby and
Pastan, 1979; Sambrook et al, 1989).
8. Panen sel mieloma
Setelah jumlah sel cukup (kurang lebih setelah berumur 7 hari), medium
diganti dengan RPMI-1640 baru sebanyak 5 ml kemudian sel dilepaskan dari dinding
flask dengan cara diresuspensikan menggunakan pipet Pasteur. Sel dipindahkan
dalam tabung conical steril dan ditambahkan medium RPMI-1640 sampai volum 10
ml dan disentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm selama 5 menit. Supernatan
dibuang dan pelet sel diresuspensikan perlahan dengan 1 ml medium. Sel kemudian
dihitung menggunakan haemocytometer. Suspensi sel ditambah sejumlah medium
sehingga memperoleh konsentrasi sel sebesar 2x104/100 μl dan siap dipakai untuk
penelitian (Freshney, 1986; Jacoby and Pastan, 1979; Sambrook et al, 1989).
9. Uji sitotoksisitas ekstrak etanolik daun sirih merah
Suspensi kultur sel mieloma dengan kepadatan 2 x 104 sel / 100 μl medium
diambil sebanyak 100 μl dan dimasukkan ke dalam sumuran 96-well plate bersama
dengan ekstrak uji sesuai seri konsentrasi yang dibuat, yaitu 250 µg/ml, 500 µg/ml,
750 µg/ml, 1000 μg/ml, 1250 μg/ml, 1500 μg/ml, 1750 μg/ml, dan 2000 μg/ml.
Untuk kontrol, digunakan 100 μl suspensi sel dan ditambahkan medium. Setelah itu,
plate diinkubasi dalam inkubator dengan suhu 370C dan aliran 5% CO2 selama 24
jam. Pada akhir masa inkubasi, tiap sumuran sel diresuspensi, kemudian
ditambahkan 50 μl trypan blue. Tiap sumuran diambil 10 μl dan masukkan dalam
haemocytometer. Setelah itu, dilakukan perhitungan jumlah sel hidup pada control
dan tiap konsentrasi di bawah mikroskop. Sel yang hidup akan tampak relatif bulat
transparan. Sedangkan sel yang mati akan tampak gelap dan tidak cemerlang.
E. Analisis Hasil
Analisis hasil dilakukan dengan perhitungan persentase kematian kultur sel
mieloma dengan rumus :
% kematian =
A
B A−
x 100 %
Keterangan : A= Jumlah kultur sel mieloma yang hidup pada sumuran kontrol
media
B= Jumlah kultur sel mieloma yang hidup pada sumuran yang telah
Efek sitotoksisitas ekstrak etanolik daun sirih merah diketahui dengan
analisis statistik Anova satu arah, sedangkan perhitungan LC50 dilakukan dengan
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Determinasi tanaman
Determinasi tanaman dilakukan untuk memastikan identitas tanaman uji dan
menghindari terjadinya kesalahan dalam pengambilan tanaman uji. Determinasi
dilakukan dengan cara mencocokkan tanaman dengan kunci determinasi (Backer,
1965). Determinasi dilakukan pada bulan September 2007 di Laboratorium Biologi
Farmasi, Fakultas Farmasi, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.
Hasil determinasi menunjukkan bahwa tanaman yang teliti adalah benar
tanaman sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.)
B. Pengumpulan daun sirih merah
Daun sirih merah yang digunakan diambil dari tanaman daun sirih merah
yang tumbuh di desa Mantenan, kecamatan Mertoyudan, kabupaten Magelang, Jawa
Tengah, pada bulan September 2007. Pengumpulan daun sirih merah harus diketahui
asalnya karena perbedaan lingkungan tempat tumbuh mengakibatkan perbedaan
kadar kandungan senyawa aktif.
Setelah dipetik, daun disortir dengan standar mutu : bersih, segar, tebal, dan
mengkilap. Penyortiran daun perlu dilakukan untuk memisahkan daun yang layak
merah merah perlu dicuci dengan air mengalir untuk membersihkan kotoran dan
debu yang menempel pada permukaan daun.
Dalam pembuatan simplisia daun sirih merah, dilakukan pengeringan
dengan menggunakan oven pada suhu 600C-700C. Pengeringan bertujuan untuk
mencegah kerusakan sampel oleh mikroorganisme. Bila kadar air dalam simplisia
terlalu tinggi, maka simplisia dapat berkapang. Kerusakan yang terjadi tidak hanya
terbatas pada jaringan simplisia, tetapi juga akan merusak susunan kimia zat yang
terkandung di dalam simplisia. Selain itu, kapang juga dapat menghasilkan toksin
yang dapat mengganggu kesehatan (Sirait, 1985). Keuntungan pengeringan dengan
oven adalah perngeringan lebih merata, suhu dapat dikontrol dan waktu pengeringan
lebih cepat karena tidak tergantung pada cuaca, bila dibandingkan dengan
pengeringan yang menggunakan sinar matahari.
Penyerbukan simplisia perlu dilakukan karena dapat memperluas area
kontak antara daun dengan cairan penyarinya sehingga zat aktif yang terekstraksi
akan semakin banyak. Penyerbukan dipengaruhi oleh derajat kehalusan simplisia,
yakni semakin halus serbuk simplisia, proses ekstraksi semakin efektif dan efisien.
Akan tetapi, apabila serbuk terlalu halus dapat mempersulit proses filtrasi. Oleh
karena itu, dalam penelitian ini digunakan pengayak berdiameter 0,75 mm untuk
C. Preparasi ekstrak etanolik daun sirih merah
Dalam penelitian ini, ekstraksi dilakukan secara maserasi dengan larutan
penyari etanol 70%. Prinsip metode ini adalah perendamanan sampel dalam larutan
penyari pada suhu ruangan. Perendaman menyebabkan terjadinya penembusan
larutan penyari ke dalam dinding sel sehingga zat aktif akan terlarut. Perbedaan
konsentrasi zat aktif di dalam dan di luar sel menyebabkan zat aktif di dalam sel akan
terdesak ke luar sel. Keadaan ini akan terjadi terus-menerus hingga terjadi
kesetimbangan konsentrasi di dalam dan di luar sel. Waktu perendaman dilakukan
selama 2 hari sehingga ekstraksi zat aktif lebih sempurna. Kemudian ekstrak cair
diuapkan dengan waterbath pada suhu 600C-650C sehingga larutan penyari menguap
dan dihasilkan ekstrak kental.
Larutan penyari harus memiliki selektifitas yang tinggi untuk senyawa yang
akan diekstraksi, tidak bereaksi dengan senyawa yang terkandung di dalam simplisia,
ekonomis, mudah menguap dan tidak berbahaya bagi manusia dan lingkungan
(Samuelsson, 1999). Hal ini mendasari pemilihan etanol 70% sebagai larutan penyari
karena dapat mengekstraksi senyawa flavonoid dan alkaloid. Flavonoid merupakan
senyawa polar sehingga flavonoid cukup larut dalam pelarut polar seperti air, etanol,
metanol, butanol, aseton, DMSO, dimetilformamida, dan lain-lain (Markham, 1988).
Senyawa alkaloid tidak larut dalam air tetapi dapat larut dalam pelarut organik
Keuntungan metode maserasi adalah cara pengerjaan dan peralatan yang
digunakan sederhana. Selain itu, metode ini tidak menggunakan panas, sehingga zat
aktif yang termolabil tidak mudah rusak dan dapat terekstraksi. Kekurangan metode
ini adalah waktu pengerjaan lama tergantung waktu perendaman dan membutuhkan
jumlah pelarut yang banyak.
D. Pembuatan medium pencuci dan medium penumbuh
Dalam penelitian ini, digunakan 2 jenis medium, yakni : medium pencuci
dan medium penumbuh. Medium pencuci mengandung RPMI-1640, natrium
bikarbonat dan Hepes. Natrium bikarbonat berfungsi sebagai buffer sintetik,
sedangkan Hepes sebagai bahan buffer organik. Kedua buffer ini digunakan untuk
menjaga pH pertumbuhan agar tetap konstan.
Medium penumbuh berfungsi sebagai media pertumbuhan bagi kultur sel
mieloma. Medium ini mengandung RPMI-1640, FBS (Foetal Bovine Serum) 10%,
penisilin-streptomisin 0,5%, dan fungison 0,5%. Dalam media ini, FBS digunakan
sebagai suplemen pertumbuhan karena mampu mendukung nutrisi pertumbuhan pada
kultur sel mieloma.
Kondisi medium kultur harus bebas dari kontaminan. Hal ini dapat
menyebabkan persaingan untuk mendapatkan nutrisi sehingga pertumbuhan kultur
sel mieloma dapat terhambat. Oleh karena itu, dalam medium penumbuh digunakan
kombinasi antibiotik penisilin-streptomisin untuk menghindari kontaminan bakteri,
baik gram positif maupun negatif. Selain itu, digunakan fungison untuk menjaga agar
E. Propagasi dan panen sel mieloma
Untuk menghindari perubahan genetik, sel mieloma perlu dibekukan dalam
tangki nitrogen cair sehingga kondisi sel mieloma tetap normal. Kemudian suspensi
sel mieloma perlu disentrifugasi sehingga pelet sel terpisah dari medium dan
mengendap di dasar tabung conical. Sentrifugasi dilakukan pada kecepatan 3000
rpm, sebagai kecepatan optimum untuk menghasilkan pelet sel mieloma yang padat,
tidak rusak dan mudah diresuspensikan.
Setelah berumur 7 hari, populasi kultur sel mieloma telah menempati
seluruh permukaan area tumbuh dan jumlahnya telah mencukupi untuk penelitian.
Oleh karena itu, kultur sel mieloma siap dipanen dan digunakan untuk penelitian. Sel
yang siap panen merupakan sel yang fase pertumbuhannya menurun/berhenti
karena kehabisan nutrisi sehingga dilakukan penggantian medium kultur. Kultur sel
mieloma yang melekat pada flask dilepaskan dengan resuspensi secara perlahan dan
dipindahkan ke dalam tabung conical untuk disentrifugasi. Tujuannya adalah untuk
memisahkan pelet sel mieloma dan mediumnya sehingga dapat dihitung jumlah sel
total dengan menggunakan haemocytometer.
Setelah dipanen, dilakukan pengamatan morfologi sel mieloma. Kultur sel
mieloma hidup berbentuk hampir bulat sempurna, bening cemerlang, tidak keruh
pada bagian inti, dan berada pada dasar flask. Kultur sel mieloma mati terlihat
Morfologi kultur sel mieloma tampak pada gambar berikut:
Gambar 1. Foto kultur sel mieloma di sumuran kontrol (perbesaran 100x)
Ket. : semua kultur sel mieloma hidup
F. Uji sitotoksisitas ekstrak etanolik daun sirih merah
Dalam penelitian ini, uji sitotoksitas dilakukan untuk mengetahui potensi
ketoksikan ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap kultur sel mieloma. Pengujian
dilakukan dengan metode perhitungan langsung menggunakan pewarna trypan blue
untuk mengamati morfologi dan menetapkan persen kematian kultur sel mieloma.
Dari hasil uji sitotoksisitas dapat ditentukan harga LC50, yaitu konsentrasi ekstrak
etanolik daun sirih merah yang mampu mematikan 50 % populasi kultur sel
mieloma.
Prinsip metode perhitungan langsung adalah pengamatan dan perhitungan
jumlah kultur sel mieloma yang mati dan hidup dengan menggunakan
haemocytometer. Dalam metode ini, trypan blue digunakan untuk membantu
pengamatan dan perhitungan jumlah kultur sel mieloma. Kultur sel mieloma mati
akan kehilangan integritas membrannya, sehingga trypan blue dapat masuk ke dalam
dapat masuk dan mewarnai inti sel karena adanya selektifitas membran selnya. Pada
kultur sel mieloma yang mati, sel akan tampak berwarna biru, bentuknya lebih besar
dan membengkak. Sedangkan pada kultur sel mieloma yang hidup, sel akan tampak
bersinar, bentuknya kecil (gambar 2).
Gambar 2. Kultur sel mieloma di haemocytometer (perbesaran 100x)
Ket. : i = sel mieloma hidup dan ii = sel mieloma mati
Dalam metode ini, dilakukan perhitungan jumlah sel mieloma hidup dan
direpresentasikan dalam bentuk persen kematian sel. Persentase kematian kultur sel
mieloma merupakan persentase hasil pengurangan jumlah sel mieloma hidup pada
kelompok kontrol dengan jumlah sel mieloma hidup pada kelompok perlakuan
dibagi dengan jumlah sel mieloma hidup pada kelompok kontrol. Hasil persentase
kematian kultur sel mieloma menunjukkan bahwa semakin tinggi konsentrasi maka
persen kematian kultur sel semakin meningkat (gambar 3). Hal ini terlihat pada
konsentrasi 2000 dan 1750 µg/ml, persentase kematian kultur sel mieloma sebesar
100 %. Persentase kematian 50 % diprediksikan berada disekitar konsentrasi 500
µg/ml yang menghasilkan persentase kematian sebesar 50,69; 49,32; dan 49,32 %.
(tabel II).
i
Tabel II. Data persentase kematian kultur sel mieloma
Konsentrasi (µg/ml)
% pada penetapan
I II III
2000 100,00 100,00 100,00 1750 100,00 100,00 100,00 1500 95,89 94,52 94,52 1250 84,93 84,93 84,93 1000 75,34 73,97 73,97 750 63,01 63,01 63,01 500 50,69 49,32 49,32 250 36,99 36,99 36,99
Gambar 3. Grafik konsentrasi (µg/ml) terhadap % kematian kultur sel mieloma
Kematian kultur sel mieloma juga dapat diketahui dengan pengamatan
morfologi sel pada setiap konsentrasi ekstrak etanolik daun sirih merah. Pada
konsentrasi 250, 500 dan 750 µg/ml, sel yang hidup dan mati terlihat secara jelas.
Kultur sel mieloma hidup berbentuk hampir bulat sempurna dan bercahaya.
keruh. Perbedaan yang signifikan ini dapat dilihat pada kadar 1750 dan 2000 µg/ml,
sel mieloma mengalami kematian (gambar 4).
ii
ii i
i
(konsentrasi 250 µg/ml) (konsentrasi 500 µg/ml)
(konsentrasi 750 µg/ml) (konsentrasi 1000 µg/ml)
(konsentrasi 1250 µg/ml) (konsentrasi 1500 µg/ml) ii
i i
ii
i
ii
ii ii
(konsentrasi 1750 µg/ml) (konsentrasi 2000 µg/ml)
Gambar 4. Kultur sel mieloma di sumuran perlakuan (perbesaran 100x)
Ket. : i = sel mieloma hidup dan ii = sel mieloma mati
Kekurangan metode perhitungan langsung menggunakan pewarna trypan
blue adalah perhitungan sel membutuhkan waktu yang lama dan subjektifitasnya
tinggi. Untuk mengatasi hal ini, maka perhitungan sel dilakukan minimal 3 kali oleh
orang yang sama untuk mengurangi tingkat kesalahan. Selain itu, setelah pemaparan
trypan blue, kultur sel mieloma harus segera dihitung karena dapat menyebabkan
toksisitas pada sel hidup sehingga mengurangi keakuratan perhitungan. Kelebihan
metode ini adalah mudah dilakukan/sederhana, ekonomis, dan dapat mengamati sel
yang hidup dan mati secara langsung.
Untuk mengetahui efek sitotoksisitas ekstrak etanolik daun sirih merah
terhadap kultur sel mieloma, maka dalam penelitian ini digunakan kontrol kultur sel
mieloma. Hasil penelitian dianalisis secara statistik dengan metode Anova satu arah
untuk mengetahui apakah jumlah kematian sel pada kelompok kontrol dan kelompok
perlakuan berbeda secara signifikan atau tidak.
Analisis statistik Anova satu arah dapat dilakukan apabila data yang dikaji
dan memiliki nilai varian yang sama (Harinaldi, 2005). Oleh karena itu, dilakukan uji
Kolmogorov-Smirnov. Hasil pengolahan data dengan SPSS menunjukkan bahwa
data yang dikaji memiliki distribusi yang normal (α > 0,05) dan nilai varian yang
sama sehingga data dapat dianalisis dengan Anova satu arah. Hasil analisis
menunjukkan jumlah kematian sel pada kelompok kontrol dan kelompok perlakuan
berbeda secara signifikan, artinya ekstrak etanolik daun sirih merah bersifat
sitotoksik terhadap kultur sel mieloma.
Untuk mengetahui potensi ketoksikan ekstrak etanolik daun sirih merah,
dilakukan analisis probit. Analisis probit merupakan salah satu analisis regresi untuk
mengetahui hubungan konsentrasi-respon (persentase kematian sel) agar diperoleh
persamaan garis lurus yang dapat digunakan untuk menentukan LC50 dengan lebih
akurat (Nurrochmad, 2001). Analisis probit merupakan analisis regresi antara log
konsentrasi dengan harga probit. Harga probit didapatkan dari tabel probit (lampiran
8) yang disesuaikan dengan persentase kematian kultur sel mieloma.
Dalam analisis probit, perlu dilakukan uji linearitas pada setiap penetapan.
Hasil uji linearitas menunjukkan bahwa r hitung > r [4, 0,05] (lampiran 6), artinya
grafik pada penetapan I, II, dan III bersifat linear (gambar 5, 6 dan 7). Grafik yang
linear menggambarkan bahwa log konsentrasi ekstrak etanolik daun sirih merah
berbanding lurus dengan harga probit, sehingga LC50 dapat dihitung secara akurat.
Gambar 5. Grafik log konsentrasi terhadap harga probit pada penetapan I
Gambar 7. Grafik log konsentrasi terhadap harga probit pada penetapan III
Semakin kecil LC50 suatu senyawa maka semakin toksik senyawa tersebut
(Doyle and Griffiths, 2000). Ekstrak etanolik daun sirih merah memiliki LC50 > 20
µg/ml terhadap kultur sel mieloma. Penelitian sitotoksisitas ekstrak etanolik daun
sirih merah juga dilakukan terhadap kultur sel kanker yang lain dengan nilai LC50
sebesar 1.143,1 µg/ml pada sel HeLa (Atmaningsih, 2008), nilai LC50 sebesar 587,7
µg/ml pada sel T47D (Neritika, 2008), nilai LC50 sebesar 200,7 µg/ml pada sel SiHa
(Nur’aniyah, 2008), dan nilai LC50 sebesar 395,5 µg/ml pada sel Raji
(Kusumaningtyas, 2008). Perbedaan harga LC50 pada sel HeLa, SiHa, T47D, raji dan
mieloma disebabkan oleh perbedaan karakteristik sel yang berpengaruh terhadap
Berdasarkan kriteria National Cancer Institute (NCI), suatu senyawa yang
dapat dikembangkan sebagai antikanker adalah senyawa dengan LC50 ≤ 20 µg/ml
(Swanson and Pezzuto, Devie, 2007). Dalam penelitian ini, digunakan ekstrak
etanolik daun sirih merah mengandung banyak senyawa yang kemungkinan
berpotensi sebagai antikanker. Oleh karena itu, daun sirih merah dapat
dikembangkan sebagai antikanker apabila ditemukan senyawa tunggal yang
bertanggung jawab atas aktivitas antikanker tersebut dan memiliki LC50 ≤ 20 µg/ml.
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
A. Kesimpulan
1. Ekstrak etanolik daun sirih merah bersifat sitotoksik.
2. Harga LC50 dari ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap kultur sel mieloma
sebesar 434,1 µg/ml.
B. Saran
1. Penelitian lebih lanjut mengenai sitotoksisitas fraksi etanolik daun sirih merah.
2. Penelitian lebih lanjut mengenai mekanisme kematian sel mieloma oleh
ekstrak etanolik daun sirih merah.
3. Penelitian lebih lanjut mengenai sitotoksisitas ekstrak etanolik daun sirih
merah terhadap sel normal.
DAFTAR PUSTAKA
Anonim, 1999, Biochemicals and Reagent for Life Science Research, Sigma_aldrich co.Singapura, 723, 1873
Anonim, 2000, Parameter Standar Umum Ekstrak Tumbuhan Obat, Cetakan I, Departemen Kesehatan RI, Jakarta
Anonim, 2002, An Introduction to Cancer Treatments, http://cancerquest.emory. edu/index.cfm?page=183, November 2007
Anonim, 2006a, Celebes Pepper, http://davesgarden.com, Mei 2008
Anonim, 2006b, Understanding Myeloma, http://www.leukaemia.org.au, Maret 2008
Anonim, 2006c, Multiple Myeloma, http://documents.cancer.org/175.00/175.00.pdf, Maret 2008
Anonim, 2007a, 800.000 Orang Indonesia Terserang Kanker Tiap Tahun, http://www.suarapembaruan.com/News/2007/05/14/Utama/ut01.htm, Maret 2008
Anonim, 2007b, Piper crocatum, http://zipcodezoo.com/Plants/P/Piper_crocatum .asp, Mei 2007
Anonim, 2007c, Piper ornatum, http:/toptropicals.com/catalog/uid/piper_ornatum .htm, Mei 2007
Anonim, 2007d, Types of Myeloma, http://CancerHelp.UK.com, September 2007
Anonim, 2008a, Carcinogenesis, http://en.wikipedia.org/wiki/Carcinogenesis, Maret 2008
Anonim, 2008b, Alkaloid, http://en.wikipedia.org/wiki/Alkaloid, Maret 2008
Atmaningsih, F. R., 2008, Uji Sitotoksisitas Ekstrak Etanolik Daun Sirih Merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.) Terhadap Kultur Sel HeLa, Skripsi, Fakultas Farmasi USD, Yogyakarta.
Backer, C. A., dan Backuizen van den Brink, R. C.,1965, Flora of Java, Volume I dan II, N. V. Noordhoff, Graningen.
De Muth, J. E., 1999, Basic Statistics And Pharmaceutical Statistical Applications, 585, Marcel Dekker, Inc., New York
Devie, K., A., 2007, Efek Fraksi Alkaloid Daun jarong (Achyrantes aspera Linn.) Pada Viabilitas Kultur Sel Mieloma Mencit, Skripsi, Fakultas Kedokteran Hewan UNAIR, Surabaya
Diek, 2005, Daun Sirih Merah Obat Tradisional Kencing Manis, http://www.bogoronline.com/index.php?ar_id=108&catid=9, November 2007
Doyle, A., and Griffiths, J.B., 2000, Cell and Tissue Culture for Medical Research, John Willey and Sons Ltd, New York
Elly, K., W., 2002, Efek Fraksi Protein yang Diisolasi dari Daun Mirabilis jalapa L. Terhadap Proses Apoptosis pada Sel HeLa, Skripsi, Fakultas Farmasi UGM, Yogyakarta
Freshney, R.I., 1986, Animal Cell Culture : A Practical Approach, 1st Edition, 71-73, IRL Press, Washington DC
Freshney, R. I., 2000, Culture f Animal Cells : A Manual of Basic Technique, 14th Edition, 336-338, John Wiley and Sons Inc., New York
Fronseca, R., 2008, The Genome of Myeloma Cells, www.medcape.com, April 2008
Grotewold, E., 2006, The Science of Flavonoids, Springer Science_Business Media Inc., USA
Harinaldi, 2005, Prinsip-Prinsip Statistik Untuk Teknik dan Sains, Penerbit Erlangga, Jakarta
Irawati, M., 2005, Uji Sitotoksisitas Senyawa Chalcone dan (2E)-3-(4’-hidroksi-3’-metoksifenil)-1(4’-metoksifenil)propan-2-en-1-on Terhadap Sel Mieloma dan Sel Vero, Skripsi, Fakultas Farmasi UGM, Yogyakarta
Jacoby, W.B., and Pastan, I.H., 1979, Methods in Enzymology Cell Culture, Volume VIII, Academia Press Inc, New York
King, R. J. B., 2000, Cancer Biology, 2nd Edition, Pearson Education Limited, London
Lenny, S., 2006, Isolasi dan Uji Bioaktifitas Kandungan Kimia Utama Puding Merah dengan Metoda Uji Brine Shrimp, USU Repository, Sumatera Utara
Lonial, S., 2005, Intro to Myeloma, http://www.multiplemyeloma.org/ about_myeloma/, November 2007
Markham, K.R., 1988, Cara Identifikasi Flavonoid, diterjemahkan oleh Padmawinata, ITB Bandung
Mursyidi, A., 1985, Statistika Farmasi dan Biologi, Ghalia Indonesia, Jakarta
Mustofa, 2007, Fitofarmaka, BagianFarmakologi/PusatKedokteranTropis, Fakultas KedokteranUGM, Yogyakarta
Neritika, K., 2008, Uji Sitotoksisitas Ekstrak Etanolik Daun Sirih Merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.) Terhadap Kultur Sel T47D, Skripsi, Fakultas Farmasi USD, Yogyakarta.
Nur’aniyah, 2008, Uji Sitotoksisitas Ekstrak Etanolik Daun Sirih Merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.) Terhadap Kultur Sel SiHa, Skripsi, Fakultas Farmasi USD, Yogyakarta.
Nurrochmad, A., 2001, Sintesis kurkumin, bisdemetoksikurkumin, bisdemetoksihidroksikurkumin dan pentagamavunon-0 serta uji ketoksikannya terhadap sel mononuklear normal secara in vitro, Tesis S2, Program pasca sarjana, universitas gadjah mada, yogyakarta.
Rados, C., 2007, Multiple Myeloma Statistics, Myeloma Breakdown, http://media.www.thehurricaneonline.com/media/paper479/sections/200710 11News.html, Maret 2008
Ross, J. A., and Kasum, C. M., 2002, Dietary flavonoids: bioavailability, metabolic effects, and safety, Annu Rev Nutr, 22: 19-34
Sambrook, Fritsch, E.F., Maniatis, T., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Coldspring Harbor Laboratory Press.
Samuelsson, G., 1999, Drugs of Natural Origin, Swedish Pharmaceutical Press, Sweden
Setyaningsih, N., 2005, Uji Sitotoksisitas Ekstrak Etanol Kalus Phaleria macrocarpa
(Scheff) Boerl. Terhadap Sel Mieloma, Skripsi, Fakultas Farmasi UMS, Solo
Sudewo, B., 2006. Basmi Penyakit dengan Sirih Merah, AgroMedia Pustaka, Yogyakarta
Sukardiman, R., 1999, Efek Antikanker Isolat dari Herba Benalu Mangga, Cermin Dunia Kedokteran122: 6-8
Swanson, S.M. and Pezzuto J.M., 1990. Bioscreening Tecnique for Cytotoxic Potential and Ability to Inhibit Macromolecule Biosynthesis in : Thomson, E. B. Drug Bio Screening : Drug Evaluation Tecnique in Pharmacology. VCH publishers Inc. New York. p. 273- 295
Wahyuningsih, T., 2004, Uji Sitotoksisitas Ekstrak Gubal Rimpang Kunci Pepet (Kaempferia rotunda Linn.) Terhadap Sel Mieloma, Skripsi, Fakultas Farmasi UMS, Solo
Lampiran 1. Foto tanaman sirih merah
Gambar 8. Tanaman Sirih Merah
Lampiran 2. Foto medium dan peralatan uji sitotoksisitas
Gambar 10. Medium pencuci (i) dan Gambar 11. Sentrifuge medium penumbuh (ii)
Gambar 12. Mikroskop Gambar 13. Haemocytometer (i) dan cell counter (ii)
Lampiran 3. Perhitungan jumlah kultur sel mieloma tiap sumuran
Jumlah kultur sel mieloma terhitung = 150 sel
Jumlah kultur sel mieloma sebenarnya = 4
Jumlah kultur sel mieloma yang dibutuhkan
= 9 sumuran x 3 replikasi x kepadatan sel
= 9 x 3 x 20.000
= 540.000 sel
Jumlah media pengenceran = 9 sumuran x 3 replikasi x 100 µl (tiap sumuran)
= 2700 µl
Sehingga jumlah sel yang harus diambil dan diencerkan dengan 2700 µl adalah :
Lampiran 4. Perhitungan jumlah kultur sel mieloma yang hidup
Tabel 1. Data perhitungan jumlah kultur sel mieloma dengan perhitungan langsung
Konsentrasi (µg/ml)
Penetapan
I II III Hidup Mati Hidup Mati Hidup Mati
Kontrol 73 0 73 0 73 0
Jumlah kultur sel mieloma yang hidup dan mati dari tiap sumuran hasil
dapat dihitung dengan rumus :
Jumlah sel/sumuran = 4
X
x 10 x 200
Keterangan :
X = jumlah sel hasil perhitungan langsung pada haemocytometer
4 = jumlah bilik dalam haemocytometer
10 = jumlah volume yang masuk dalam bilik haemocytometer (10 µl) 200 = jumlah volume total (200 µl)
Perhitungan jumlah sel mieloma dilakukan sebanyak tiga kali dengan hasil
III =
2. Konsentrasi 250 µg/ml
I =
3. Konsentrasi 500 µg/ml
I =
4. Konsentrasi 750 µg/ml
5. Konsentrasi 1000 µg/ml
6. Konsentrasi 1250 µg/ml
I =
7. Konsentrasi 1500 µg/ml
I =
8. Konsentrasi 1750 µg/ml
I = 4 0
II = 4 0
x 10 x 200 = 0 sel
III = 4 0
x 10 x 200 = 0 sel
9. Konsentrasi 2000 µg/ml
I = 4 0
x 10 x 200 = 0 sel
II = 4 0
x 10 x 200 = 0 sel
III = 4 0
Lampiran 5. Perhitungan persentase kematian kultur sel mieloma
Persentase kematian kultur sel mieloma dihitung dengan rumus :
% kematian sel =
A = jumlah sel hidup pada sumuran kontrol
B = jumlah sel hidup pada sumuran yang telah diberi perlakuan ekstrak etanolik daun sirih merah
1. Konsentrasi 250 µg/ml
I =
2. Konsentrasi 500 µg/ml
I =
3. Konsentrasi 750 µg/ml
III =
4. Konsentrasi 1000 µg/ml
I =
5. Konsentrasi 1250 µg/ml
I =
6. Konsentrasi 1500 µg/ml
I =
7. Konsentrasi 1750 µg/ml
II =
8. Konsentrasi 2000 µg/ml
Lampiran 6. Perhitungan LC50 dengan analisis probit dan uji linearitas Penetapan I
Tabel III. Data log konsentrasi, % kematian dan harga probit pada penetapan I
Konsentrasi
(µg/ml) Log konsentrasi % kematian Harga probit
250 2,39794 36,99 4,67
Dengan Regresi Linear log konsentrasi ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap
harga probit didapatkan nilai : A = -1,33517, B = 2,40656 dan r hitung = 0,92852
Tabel IV. Data log konsentrasi, % kematian dan harga probit pada penetapan II
Konsentrasi
(µg/ml) Log konsentrasi % kematian Harga probit
250 2,39794 36,99 4,67
Dengan Regresi Linear log konsentrasi ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap
harga probit didapatkan nilai : A = -1,18474, B = 2,34262, dan r hitung =
Sehingga persamaannya : y = Bx + A
y = 2,34262x – 1,18474
5 = 2,34262x – 1,18474
x = 2,64009
Penetapan III
Tabel V. Data log konsentrasi, % kematian dan harga probit pada penetapan III
Konsentrasi
(µg/ml) Log konsentrasi % kematian Angka probit
250 2,39794 36,99 4,67 500 2,69897 49,32 4,97 750 2,87506 63,01 5,33 1000 3,00000 73,97 5,64 1250 3,09691 84,93 6,04 1500 3,17609 94,52 6,64
Dengan Regresi Linear log konsentrasi ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap
harga probit didapatkan nilai : A = -1,18474, B = 2,34262, dan r hitung =
0,93571
Sehingga persamaannya : y = Bx + A
y = 2,34262x – 1,18474
5 = 2,34262x – 1,18474
x = 2,64009
Rata-rata LC50 = anti log (
3
2,64009 2,64009
2,63246+ +
) = anti log 2,63755
Uji Linearitas
Tabel VI. Nilai r (koefisien korelasi) pada level signifikansi 5% dan 1%
Lampiran 7. Analisis statistik dengan Anova satu arah Asymp. Sig. (2-tailed) .541 a Test distribution is Normal.
b Calculated from data.
Lampiran 8. Tabel probit
Tabel VII. Tabel probit
