Pengaruh Endoxan-Asta (Cyclophosphamide) pada Pertumbuhan Embryo Ayam

PR)CEEDINGS ITB VoL. 10. No. 1, 1975.

PENGARUH

ENDOXAN.ASTA

(CYCLOPHOSPHMIDE)

PADA

PERTUMBUHAN

EMBRYO

AYAM

Sri Sudarwatl dan Tlen Wiati S,rtuorro*)

R I N G K A S A N

Telah diteliti penganlh Endasut-Aetq (cg-elophosphani.dd terhad.ap perturnbuhot embryo aAqn dengan ialaz menguntikka?mya ke dalan \---_ _{kantung yolk pada, wrur 4 dan 5 hcti inkubasi.}

i Didapatkut, bahua dosis teratogenik

ada,-\ Le 0.04 ng per telur. Malformaei, yang di.ttn-\ _{bulkannya ad.olah: geLenbwtg neLiputi, mata,}

kelopak mata yutg tidak twnb?th dengan serrFur.-na, mata yang tidak twnbth sonaaekali, pat'uh dengan sis'L Lateral yang bercelah, pdrlth basah atau panth atas yang pendek, puull menyilutg, niey,omelia, syndactyli, ectz,odaetyli, eetopia uisee.rwn, exeneephwli don tteleft paLate't. Se-Lain itu Endoaan-Asta berpengamth menghonbat p er ttttnbuhmt p ada urnnmy a.

A B S T R A C T

The infLuenee of End.ouan-Asta (eyeloptns-phonide) on the deueLopment of ehiek entbtyos has been inuestigated by injeeting tlrc eub-stqnce into the yolk sae of 4 and 5 days in-cubated eggs.

It uas found that 0^04 ng tndpaan-Asta pet, egg is a teraLogenie dose. Malfornations obtained during the inuestigation uere: bulb

* )

_{' D e p a r t e m e n}

B i o l o g i , I n s t i t u t T e k n o l o g i B a n d r m g .

deueloped eAes, cleft on the Lateral sides of upper beak, shoz't ,,Lpper or Louer L.,eak, ercssed beak, mieromelia, syndttctgly, ectr,odactgLy, ectopia Diseerum, exeneepha'LA arld eLeft pal-ate. Besides that, Endoran-Asta caused stunt-ed grouth.

PENDA}TULUAN

Cyclophosphami.de, suatu agens antitumor yang sangat ampuh, tergolong dalam kelompok "alkylating agents" dan meru-pakan obat yang digunakan untuk- chemotherapi kanker. Cyclo-phosq\lmrgg mempunyai rumus :

NHCH^

\

. o c H 2

c l c H r c H ,

. \ .

\

\T

,/

C l C H ^ C H ^ 1 t

,/

- P = O _{c H 2 . H ^ O} P e r c o b a a n F o y e e t a L . ( 1 9 6 0 ) m e m b u k t i k a n , b a h w a o b a t i n i sangat baik hasilnya dalan therapi nalignant lymphoma, epider-moid carclnoma paru-paru dan epidermoid carcinoma larynx. C y c l o p h o s p h a n i d e y a n g d i i n j e k s i k a n s e c a r a i n t r a p e r i t o n e a l pada mencit yang sedang mengandung pada hari-hari ke.-9 sampai-14 dengan dosis 20 ng/kg menyebabkan bertambahnya jurnJ-ah em-b r y o y a n g d i r e s o r p s i _{d a n - j u g a m e m p u n y a i e f e k t e r a t o g e n i k y a n g} b e r m a c a m - m a c a m , s e p e r t i : " c l e f t p a 1 a t e " , e x e n c e p h a l i , k e l a i _ n -a n - k e l -a i n -a n p a d a d i g i t , e k o r y a n g p e n d e k , p o l y d a c t y l i , s y n d a c -t y 1 i , e c t r o d a c t y l i , a d a c t y l i , b e r s a t u n y a t u l a n g - t u l a n g p a n -jang, bengkoknya culang-tulang panjang, hilangnya rusuk, mata t e r b u k a , a p h a k i a , m i c r o p h a k i a , h y d r o n e p h r o s i s d a n h y d r o c e p h a -l u s ( G i b s o n d a n B e c k e r , 1 9 6 8 ) .

C y c l o p h o s p h a n i d e j u g a b e r s i f a t t e r a t o g e n i k p a d a t i k u s d e n g a n d o s i s 7 - 1 0 m g / k g h a n y a b i l a d i i n j e k s i k a n s e c a r a i n t r a -peritoneal pada hari-hari mengandung yang ke-ll dan 12. Anoma-l i y a n g d i d a p a t a d a l a h : e x e n c e p h a l i , " c l e f t p a l a t e " , k a l c i - k a k i y a n g a b n o r m a l d a n j u g a e k o r y a n g a b n o r m a l ( C h a u b e e t a L . , 1 9 6 7 ) .

Penelitian yang dilakukan sekarang ini bertujuan untuk mempelajari bagaimana pengaruh cyclophosphamide bila diinjek-sikan ke dalam karrtung yolk embryo ayam yang sudah memperli.-hatkan pertumbuhan dari- tunas-tunas ekstrimitas.

BAHAN DAN TAI]AKERJA

T e l u r - t e I L r r f e r t i l a y a m " w h i t e l e g h o r n " d i p e r o l e h d a r i p e t e r n a k a y a m " M i s s o u r i " d i B a n d u n g .

Telur-telur diinkubasikan dengan menggunakan mesin-mesin p e n e t a s t e l u r b u a t a n " M i s s o u r i " B a n d u n g , S e t e l a h e m b r y o b e r -u r n -u r 1 r d a n 5 h a r i i n k -u b a s i , t e l u r - t e l u r d i i n j e k s i d e n g a n l a -rutan Endoxan-Asta. Injeksi dilakukan ke dalam kantung yolk d e n g a n d o s i s 0 . 0 4 m g p e r t e l u r s e b a n y a k 0 . 0 2 c c . E m b r y o - e m b r : y o s e r i k o n t r o l d i i n j e k s i d e n g a n a q u a b i d e s t i l a t a s e b a n y a k 0 . 2 c c p e r t e l u r .

Telur-te1ur kemudian di.inkubasikan kernbali sampai umur 16 h a r i . S e s u d a h u m u r i n i t e r c a p a i , e m b r y o d i b u n u h , d i p e r i k s a abnormalitas-abnormalitas norfologis yang dideritanya dan ke-mudian ditimbang bera:nya. Ernbryo-embryo yang berurnur lebih

tua dari t hari dan tidak dapat mencapai umur 16 hari, dlper-=----{kukan _{sama, hanya saja tldak ditirnbang beratnya.}

Untuk pe-V/arnaan rangka digunakan metoda pewarnaan dengan Alizarin

\ e d S ( C o n n , 1 9 6 0 ) .

HASIL PENGAI'IATAN

Malformasi yang ditimbulkan oleh Endoxan-Asta bila dl--injeksikan ke dalam kantung yolk pada umur 4 hari dan 5 harl inkubasi adalah:

P a d a m a t a : - Gelembung meliputl mata (Gambar

I )

- Kelopak mata tidak turnbuh, s€-hingga mata terbuka (Garnbar II) - MaEa tidak tumbuh sama seka1l

(Gambar III)

: - Sisi lateral paruh bercelah (Gan-Pada paruh

P a d a e k s t r i m i t a s b e l a k a n g : -P a d a d i g i t i e k s t r i m i t a s

belakang :

-bar IV)

Paruh bawah pendek (Gambar IV) Paruh atas pendek (Gambar V) Paruh atas dan bawah pendek (Gan-b a r I , V I , V I I )

Paruh menyilang

M i c r o m e l i a ( G a n b a r I , I I , V I I ) Syndactyli (Gambar V,VII)

E c t r o d a c t y l i ( G a r n b a r I , I I , V I I ) Melengkung

Ganbar I: Embryo ayam umur 15 hari yang dii-njeksi dengan 0.04 mg Endoxan*Asta pada umur 5 hari inkubasi. Malforma-s i : g e l e r o b u n g m e l i p u t i m a t a , t t c l e f t p a l a t e t t , p a r u h atas dan bawah yang tidak cunbuh dengan sempurna, micromelia, syndactyli dan ectrodac-tyli.

1 5

tt,

Gambar II: Embryo ayam umur 15 hari yang diinjekei dengan 0.04 ug Endoxan-Asta pada 'urur 5 hari inkubast. -ltarfor-masi: _{kelopak nata tl-dak tunbuh senpurna, mi-crome_}

_.(.,

Ganbar III: _{Embryo ayErm unur 13 hari yang dilnjeksi}

dengan 0.04 mg Endoxan-Asta _{pada umur 4 traif inkubasi.} Malformasi-: exencephali, _{paruh atas tidak tr:mbuh,} mata yang tidak _{tunbuh dan ectopia viscerum.}

T 7

Garnbar rV: Enbryo ay€rm umur 16 hari yang diinJeksl dengan 0.04 mg Endoxan-Asta pada umur 4 hart inkubasi. Malfor_ masl: _{paruh atas slsl lateralnya bercelah, paruh} bawah pendek, ectrodactyli (jari _{kakt ke I hlling).}

---a

I

I

Gaurbar Vr Lmbryo ayam umur 13 hari yang dlinjeksi- dengan.0.04 mg Endoxan-Asta pada umur 5 hari inkubasi. Malfor-masi: kelopak mata tldak tumbuh, paruh atas tldak tumbuh sempurna, micromel-la, syndactyll, ectrodacty-li dan ectoDia vi.scerun.

I

I

I

I

t

n

19

*

Gambar VI: Ernbryo ay€rm umur 14 hari yang diinjeksi dengan 0.04 mg Endoxan-Asta pada umur 4 hari inkubasi. Malfor-masi: gelembung meliputi mata kanan, paruh atas dan bawah tidak tumbuh sempurna, micromelia, jari kaki kanan melengkung ke dalarn dan ectrodactyl.i.

s

! , T .

It

Gambar VII: Ernbryo ayam umur 16 hari yang diinjeksi dengan 0.05 mg Endoxan-Asta pada umur 5 hari inkubasi. Malformasi: kelopak nata tldak tumbuh, paruh atas dan bawah tj-dak tumbuh sempurnar mi-cromelia dan e c t r o d a c t y l i .

I t

t 1

1t

rl

Gambar vrrr: Enbryo ayam unur 15 hari yang diinjeksl dengan 0.04 ng _{Endoxan-Asta pada r:mur 5 hari lnkubasi.} Malformasi: _{kelopak nata tidak tumbuh sempurna,} ectopla viscerum sampai wilayah jantung, _{syndac_} It ty11 dan bulu tidak berkenbang.

li

Ganbar IX: Enbryo aya:n diinj eksi unur 4 hari

unur 16 harl dart seri kontrol- yang dengan aquabi"dest sebanyaft 0.2 cc pada

2 3

l r r

T

f

.

' : ' t ,

s e r i k o n t r o l . Rangka embryo ayam umur: 16

Dlwarna dengan Allzarin .Red

Gambar X: 'i

{

i'

f : i . t(

,"

! .

i

#

I I: t l t I I , F t s

tu

t : ti lr' F

\ .

h a r i d a r l

_/r.

Ganbar XI: Rangka embryo ayam umur 15 harl ya4g diinjekst dengan 0.04 nS Endoxan-Asta pada umur 4 hari lnku-basi. Malforrnasi: paruh bawah yang tidak tr:mbuh dengan sempurna dan micromella. Tanpak tulang tar-so-metatarsus yang tereduksl dan nelengkung. Pewar-naan dengan All-zarin Red S.

: - Vlgcera terbuka sampal hatl (Ganbar V)

- Vlscera terbuka sanpal Jantung (Ganbar VIII)

2 5

wllayah wllayah Ectopia vlscerum

Exencephall (Gambar III) ttcleft _palate"

Dl samplng maLforoasi tersebut dl atas didapatkan juga eobryo-enbryo yang nengalauL edema dan pendarahan.

Tabel 1: Frekwensl nalformasi pada embryo ayam yang dapat hl-dup sesudah t hari lnkubasl setelah disuntik dengan Endoxan-Asta ke dalan kantung yolk pada umur 4 dan 5 harl inkubasl.

Hari 4 hari 5 harl

D o s i s 0 . 0 4 n g 0 . 0 4 n g

ttalforoasl pada:

Mata: - Gelenbung roeliputi - Kel-opak mata tidak - Mata ttdak tunbuh Parutt Mlcromella Dlglt Ectopla vlscerum Exencepball ttcleft palatet' Edema Pendarahan mata tuobuh 3 1 1 9 5 10 16

3

4

0

18

6

10

9

2

3

8

I

5

2

1

4

I

_i!

tr

'"

*

:f

. t Catatan: Jumlah telur

Jrolah yang abnormal Junlah yang normal Jumlah yang mati sebelun 1 0 h a r ; - ' , . i . : r t i

L31

30

q 8 106 2 6 l0 1 0

kelalnan pada paruh, digitl dan ectopia vlscerrm. Dalan keada-4n yang parah oekall, vlscera dapat terbuka sarnpal wllayatr Jantung. Ectopla viacerum dtJunpal pula dal-ao eeri kontrol, tlga kejadlan dari 53 telur.

Junlah macam anomall per embryo yang cacat, dengan anoma-11 leblh darl dua Dacam, rmtuk yang dlsuntlk pada uour 4 dan 5 harl lnkubasl tldak nengalaul perbedaan, yakni 3.8 per enbryo

( T a b e l 2 d a n 3).

Tabel 2: Enbryo ayam yang nenperllhatkan leblh darl dua macan anoDall sesudah dllnjekel dengan 0.04 ng Endoxan pada urur 4 hari lnkubasl.

E n b r y o

l{alfornasl:

Gelenbung mellputl mata Kelopak nata tldak tu'nhutt ltata tldak tumbuh

Parutr MlcromeLla Dlglt Ectopla viscerum Exencephall t'cleft palatett Edema Pendarahan

Jrnlatr macam anooall

Ilasll pcwarnaan rangka dengan Allzarln Red S -enbuk,tlkaor bahwa dalan keadaan micromellar nska tulang yaru tldak tunbuh sempurna adaLah tarso-Detataraua. Selaln pendek sekall Juga serlngkall nelengkung (Ganbar XI) .

Syndactyll umunnya berlangsung aDtara digit ke III dan IV. Anonali lnl hanya terbatas pada lndentagl y'ng tldak sempurna pada waktu pertuobutran ber1tn8sung. Tulaog-tulang phalanx yang menyokong naelng-naelug dlgit tersebut tetaP ter-plsah.

Dlt, Dttr, 'ro ttr' *tr,

"t*

Tabel 3: Ernbryo ayan yang memperlihatkan lebih anomali sesudair diinjeksi dengan 0.04 umur 5 hari inkubasi.

2 7

dari dua macam mg Endoxan pada

E D b r y o

Geleubrrag @llputl uta Kelopak [ata tldrk trnbuh Mata tldak tuduh Pauh t'l1cr@1ls D 1 g l t E c t o p l a v l a c e r @ Exeucephall " C l e f t p a l a t e " Edeu Pendarahan J@lah uac& s@a1l

Dalam hal ectrodactyli didapatkan kenungkinan, bahwa di-git ke I atau ke II atau ke IV yang hilang. Dalan penelitlan yang dilakukan sekarang ini dijuurpai pula embryo yang digit ke II, III dan IV hilang sekaligus. Mengenai ectrodactyli ini ti-dak dapat dikatakan digtt mana yang lebih mudah hilang. Selain darl ltu Juga tldak didapatkan adanya simetri daripada anomali iul antara kakt klri dan kanan. Tingkatan (degree) hilangnya diglt _{Juga tidak} sama. Ada yang seluruh digit hil-ang samaseka-1i., ada Juga yang terbatas pada beberapa phalanx saja.

Dlgit yang uemperlihatkan salah arah, disebabkan oleh pertumbuhan digit yang membelok ke luar alau ke dalam. Dalan keadaan normal, arah tumbuh adalah lurus menurut sunbu 1-ongl-tudinal digit.

Embryo yang cacat dengan macam-macam anomal-i yang keba-nyakan dapat hldup hlngga r:nur l-6 hari adalah dari embryo yang diirrJeksi dengan Erdoxan pada umur 5 hari inkubasi-. Dari berat badannya, jika dibandingkan dengan embryo-embryo seri koutrol, jelas tanpak adanya penurunan bera.t badan yang menyolok (Tabel 4). Ini membuktikan adanya pertumbuhan menyeluruh yang terhan-bat (stunted growth).

E r r F r r F ' G r G , H , H , L , L , L r L r t " L " 1 0 ' 5 ' r 7 ' 2 o ' B ^ r 1 ' 2 o ' 2 2 - - 2 8

D o s i s / t e l u r B e r a t d a l a m g r a m urnur 16 hari E k s p e r i m e n t i l 0 . 0 4 m g E n d b x a n K o n t r o l 0 . 2 c . c a q u a b i d e s t 2 . 9 4 0 8 3 . 5 8 5 0 4 . 2 7 9 8 4 . 5 3 2 9 4 . 9 6 7 8 5 . 3 9 1 0 5 . 9 2 4 5 5 hari 7 . 3 9 8 4 8 . 8 7 1 0 9 . 5 9 6 3 1 0 . 2 5 6 0 1 1 . 3 9 4 9 1 2 . 8 0 2 5 1 3 . 6 8 1 9 D ISKUSI

Penelltlan ini urembuktikan, bahwa Endoxan-Asta bl1a dl-lnjekslkan ke dalan kantung yolk enbryojernbiyo ayam umur 4 dan 5 harl inkubasi nenghasilkan cacat pada: mata, paruh, kaki, dlgit, langit-J-anglt trulut. Selain ltu dapat pula menyebabkan ectopla vlscerus, exencephall, pertumbuhan keseluruhan yang terhambat, edema dan pendarahan.

Salzgeber (L972) melakukan penelitian terhadap pengaruh 'rnltrogen _{mrstardrr pada}

pertumbuhan embryo ayam dengan Jalan nengapllkaslkannya pada umur 3 dan 4 hari 1nkubas1. Didapat-kannya, bahwa sayap dan kaki kedua-duanya sangat tereduksi atau hllang samasekali. Urutan hilangnya bagian-bagl-an rangka ekstrimitas sangat teratur, yakni: flbula, tlbla, metatarsal untuk kaki dan radlus, metacarpal untuk sayap. Bagl-an pro-ximal, sepertl femur dan humerus tetap ada dan yang paLlng sedikit mengalani perubahan-perubahan dibandingkan dengan seg-men-segmen lalnnya.

Cyclophosphanide yang dalan studi.-studl kllnis nenlllkl suatu spektrum aktivltas antitumor yang dalan banyak hal- mlrip dengan "nltrogen mustardrr dalarn penelltian lnl rnenperllhatkan perbedaan kerJa sebagal berikut:

Reduksi daripada baglan-baglan ekstrlmitas hanya dlJunpal pada kaki. Sayap sanasekali tidak dtpengaruhl pertunbuhannya oleh cyclophosphanlde.

2 9

Untuk rmur yang sama pada waktu zat diaplikasikan, yakni umur 4 hari inkubasi, "nitrogen mustard' menyebabkan phoco-melia, sedang cyclophospharnlde hemirnelia (reduksi dari bagian-bagian distal ekstrinitas) .

Tulang panjang yang lebih kurang tidak dikenai pengaruh "nitrogen mustardrr adalah tulang femur. Pada cyclophospharnide tuJ.ang-tulang femur, tibia dan fibula mer:upakan tulang-tulang yang tahan terhadap pengaruh zat tersebut. Sedang tulang tar-so-metatarsus, serta phalanx merupakan bagian-bagian yang peka terhadap pengaruh cyclophospharnide. Oleh kareua itu pada ke-adaan nicromelia, tulang tarso-metatarsus tampak sangat te-r e d u k s i . D a l a m h a 1 e c t r o d a c t y l i , j u n l a h p h a l a n x p a d a s u a t u digit dapat tereduksi atau tidak tumbuh sarnasekali-,

W a l a u p u n h a s i l t e r a t o g e n e s i t a s o l e h c y c l o p h o s p h a m i d e t e r -g a n t u n -g t i d a k h a n y a p a d a s p e c i e s , t e t a p i j u g a " s t r a i n t ' d a r i h e w a n - h e w a n p e r c o b a a n ( G i b s o n d a n B e c k e r , 1 9 6 8 ) , m a l f o r m a s i yang ditinbulkan oleh cyclophospharnide pada ayam dibandingkan dengan pada mencit dan titus, memperlihatkan persamaan. Anoma-l Anoma-l , p a d a k e p a Anoma-l a , s e p e r t i e x e n c e p h a l i , m a t a t e r b u k a k a r e n a k e l o -p a k m a t a y a n g t i d a k t u m b u h s e u p u r n a d a n " c l e f t p a l a t e " p a d a t i k u s ( C h a u b e e t a L . , 1 9 6 7 ) , d i j u r n p a i p u l a p a d a a y a m . P e m b e n -t u k a n d l g i t y a n g t i d a k s e r r r p u r n a p a d a m e n c i t ( C i b s o n d a n B e c k e r , 1 9 6 8 ) d a n t i k u s ( C h a u b e e t a L . , 1 9 6 7 ) s e p e r r i s y n d a c -t y l i , e c t r o d a c t y l i d a n a d a c t y l i , d a p a t p u l a d i j u m p a i p a d a ayan. Ectopia viscerum yang merupakan anomali yang sangat se-r i n g d i j u n p a i p a d a e m b r y o a y a m , t l d a k p e r n a h d i l a p o r k a n o l e h k e d u a p e n e l i t i t e r s e b u t p a d a m e n c i t m a u p u n r i k u s y a n g t l i p e r l a -kukan dengan cyclophosphamide.

RINGKASAN

1 . T e l a h d i t e l i t i p e n g a r u h E n d o x a n - A s t a ( c y c l o p h o s p h a m i d e ) pada pertumbuhan embryo ayam umur 4 dan 5 irari inkubasi dengan nenginjeksikannya ke dalam kantung yol.k.

2 . D o s j . s 0 . 0 4 u r g p e r t e l u r m e r u p a k a n d o s i s t e r a t o g e r n i k , 3 . M a l f o r m a s i y a n g d a p a t d i t i n b u l k a n n y a a d a l a h : g e l e m b u n g m e -l i o u t i m a t a , k e l o p a k m a t a y a n g t i d a k t u m b ' r h s e m p u r n a , m a t a y a n g t i d a k t u m b u h s a m a s e k a l i , p a r u h d e n g a n s i s i l a t e r a l y a n g b e r c e l a h , p a r u h b a w a h a f a u p a r u h a t a s y a n g p e n d e k , p a -r u h m e n y i l a n g , m i c -r o m e l - i a , s y n d a c t y l i , e c t r o d a c t y l i , e c f o -p i a v i s c e r u m , e x e n c e p h a l i d a n " c 1 e f t p a l a r e " . 4 . P a d a k e a d a a n m i c r o m e l i a , t u l a n g t a r s o - m e t a t a r s u s m e r u p a k a n b a g i a n y a n g s a n g a t t e r e d u k s i .

5. Endoxan-Asta hanya berpengaruh terhadap pertumbuhan ekstri-mitas belakang dan bersifat hemirnelia.

6 . S i . f a t a n o m a l i p a d a e k s t r i m i t a s t i d a k s i m e t r i s d a n t i n g k a t -annya juga tidak sana.

n y a .

UCAPAI.I TERIMA KASIH

Penulls rnenyarnpaikan terima kasih kepada Badan Rlset-ITB yang telah menbantu membiayai penelitian ini. Juga kepada Per-pustakaan t'Hubrecht Laboratorium" di Utrecht-Nederland ya:ng telah membantrr menglrimkan kopi dari tulisan-tulisan yang me-nunjang penelltian ini, penuJ-ls menyampaikan penghargaannya.

DAFTAR PUSTAKA

C h a u b e , S . , G . K u r y a n d M . L . M u r p h y , L 9 6 7 . T e r a t o g e n l . c e f f e c t s of cyclophosphamide (NSC-26271) in the rat. Cancer Chemo-t h e r a p y R e p o r Chemo-t s 5 1 ( 6 ) : 3 6 3 - 3 7 6 .

C o n n , H . J . , M . A . D a r r o w a n d V . M . E m n e l , 1 9 6 0 . S t a i n i n g P r o c e -d u r e s . T h e W i l l i a m s & W i l k i n s C o . , B a l t i m o r e .

F o y e , L . V . e t a L . , 1 9 6 0 . C y c l o p h o s p h a m l d e , a p r e l i m i n a r y s t u -dy of a new alkyl€ting agent. Cancer Chenotherapy Reports 6 : 3 9 - 4 O .

G l b s o n , J . E . a n d B . A . B e c k e r , 1 9 6 8 . T h e t e r a t o g e n i c i t y o f c . y -clophosphamide in rnice. / Cancer Research 28 z 475-48O. S a l z g e b e r , 5 , , L 9 7 2 . L i m b m a l f o r m a t i g n p r o d u c t i o n i n c h i c k e n embryos treaEed with nitrogen nustard at 48 hours of in-c u b a t i o n . P r o c . I n t . S y n p . o n t h e e f f e c t s o f p r o l o n g e d drug usage on fetal development. Plenum Press, New York.