PENGEMBANGAN MARKA MOLEKULAR UNTUK KARAKTERISASI VARIETAS ANGGREK TANAH UNGGUL (SPATHOGLOTTIS) HASIL POLIPLOIDISASI DENGAN KOLKISIN

PENGEMBANGAN MARKA MOLEKULAR UNTUK KARAKTERISASI

VARIETAS ANGGREK TANAH UNGGUL (SPATHOGLOTTIS) HASIL

POLIPLOIDISASI DENGAN KOLKISIN

Agus Setiawan1)*_{, Anahtadiya Nurfa Shochicha}1)_{, Abrory Agus Cahya Pramana}1)_{, Restiyanti}1)_{, Budi} Setiadi Daryono1)

1)_{Program Studi Biologi, Fakultas Biologi Universitas Gadjah Mada} *e-mail: agus.setiawan@mail.ugm.ac.id

Abstract

Characterization of Spathoglottis has not been observed yet especially in determination

of genetic relationship and identification of colchisine-induced polyploid orchid. The aim of this

research was to study about characterization of fingerprinting molecular mark in DNA Barcode

profiling of Polyploid Anggrek Tanah (Spatholgottis sp.) and fenetic relationship of polyploid

orchid with superior hybrid soil orchid (Spatholgottis sp.). The method of this research is

collecting the orchid, germinating orchid seed, colchisine-induced PLB orchid, making simply

buffer DNA isolation, genome DNA isolation, quantitative test of genome DNA, qualitative test

of genome DNA, liquidity DNA genom, liquidity RAPD primer, PCR Random Amplified

Polimorphism DNA (RAPD) of Orchid DNA, electrophoresis of PCR-RAPD, polymorphism

RAPD , Dendogram RAPD analysis, dan creating Orchid DNA barcode. Based on the result

known that RAPD molecular method could be used in detection of polyploid Spathoglottis sp.

with OPAW11 primer.

Electroforegram could be made as DNA bar-coding for

Spathoglottis sp. that also could be used to to trace the origin orchids from Indonesia.

Keywords: Spathoglottis, RAPD, bar-code DNA, colchisine

1. PENDAHULUAN

Indonesia

merupakan

megabiodiversitas anggrek karena dari

30.000 spesies anggrek alam di dunia,

sebanyak 5.000 diantaranya berada di

Indonesia (Irawati, 2002). Salah satunya

adalah Anggrek Tanah (Spathoglottis) yang

memiliki siklus pembungaan tiap bulan dan

mudah perawatannya. Dalam produksi

varietas anggrek unggul baru melalui teknik

mutasi

genetik

yang

menghasilkan

peningkatan karakter fisik dan fenotip

tertentu,

seperti

perubahan

performa

tumbuhan, warna bunga, peningkatan

ukuran dan daya adaptasi. Teknik mutasi

tanaman anggrek dapat menggunakan bahan

kimia berupa kolkisin yang berfungsi

sebagai antimikrotul (Zainudin, 2010).

Menurut Sulistianingsih et al.

(2004) pemberian kolkisin pada tanaman

anggrek dapat memicu poliploidisasi yang

diikuti oleh peningkatan ukuran sel dan

jaringan tanaman termasuk bentuk dan

warna. Poliploidisasi anggrek menunjukkan

peningkatan karakter yang lebih diing tipe

diploid (2n). Berdasarkan penelitian yang

telah dilakukan diketahui bahwa konsentrasi

kolkisin dalam usaha poliploidisasi pada

genus anggrek berbeda-beda. Perlakuan

Protocorm-like bodies (PLB) anggrek

Phalaenopsis pada kultur cair dengan

penambahan 50 (ml/g) kolkisin dapat

menginduksi

poliploid

sebesar

50%

(Griesbach,

1981).

Sedangkan

dalam

Sarathum et al. (2010) menyatakan bahwa

konsentrasi kolkisin yang paling efektif

pada anggrek Dendrobium devoniatum

(0,03%), Vanda poepoe ‘Diana’ (0,5-1,5%),

Dendrobium

devonianuma

(0,03%),

Dendrobium offinale (0,01%), Phalaenopsis

sp. (0,005%), Dendrobium scabrilingue

(0,075%). Setiawan (2012) menyatakan

bahwa perendaman Protocorm dalam

medium New Phalaenopsis cair dengan

penambahan kolkisin 0,075% dengan lama

perlakuan 7 hari dapat menginduksi

poliploidisasi anggrek Spathoglottis plicata

secara

optimal.

Setiawan

(2012)

menemukan konsentrasi kolkisin optimal

dalam poliploid anggrek Spathoglottis

plicata Blume 1825 adalah 0,075% dengan

lama perlakuan 7 hari.

Pengembangan marka molekular

untuk karakterisasi varietas anggrek tanah

unggul dapat dilakukan dengan perlakuan

senyawa kolkisin. Proses karakterisasi

genetik anggrek tanah unggul dapat

dilakukan

dengan

metode

DNA

fingerprinting, yaitu: Random Amplified

Polymorphism

DNA

(RAPD)

yang

menghasilkan profil fenetik DNA anggrek.

Profil DNA anggrek dapat digunakan dalam

proses pemuliaan dan pencarian varietas

unggul. Penelitian ini menggunakan DNA

dari Protocorm like-bode (PLB) Anggrek

Tanah unggul (Spatholgottis sp.) hasil

perlakuan kolkisin secara in-vitro, sehingga

DNA terbebas dari senyawa kontaminan.

Teknik

RAPD

membutuhkan

tingkat

kemurnian DNA yang tidak terlalu tinggi

namun harus dihindarkan dari senyawa

kontaminan

seperti

polisakarida

dan

metabolit sekunder. Khosravi et al. (2009)

telah melakukan analisis RAPD terhadap

beberapa varietas anggrek Dendrobium

Serdang beauty yang telah diinduksi dengan

menggunakan kolkisin dan menemukan

primer yang sesuai, yaitu: OPU-7

(5’-CCTGCTCATC-3’),

OPU-10

(5’-ACCTCGGCAC-3’),

OPAW-11

CTGCCACGAC-3’) dan OPU-14

(5’-TGGGTCCCTC-3’).

Inovasi karakterisasi molekular

berupa pembuatan profil bar-code DNA

anggrek

hasil

poliploidisasi

dapat

meningkatkan nilai jual dari anggrek

tersebut. Penelitian ini dapat menjadi dasar

pengembangan

varietas

anggrek

Spathoglottis

dalam

skala

besar

di

Indonesia. Penelitian ini bertujuan untuk

mengetahui karakterisasi marka molekular

fingerprinting dalam pembuatan profil

bar-code DNA pada varietas Anggrek Tanah

unggul

(Spatholgottis

sp.)

hasil

poliploidisasi dan mengetahui hubungan

kekerabatan

fenetik

anggrek

hasil

poliploidisasi dengan varietas Anggrek

Tanah unggul (Spatholgottis sp.) hibrid.

2. METODE

1. Koleksi Buah Anggrek

Buah varietas anggrek Spathoglottis

dikoleksi dari kebun Fakultas Biologi UGM

meliputi buah Spathoglottis plicata, S.

plicata var. pink, S. kimballiana, dan

Spathoglottis hybrid, yaitu: Spathoglottis

Sutra

Ungu,

Spathoglottis

Bintang

Segunung, Spathoglottis Kuning Layung,

Spathoglottis

Bintang

IOCRI,

dan

Spathoglottis Kartika

2. Kultur Biji Anggrek pada Medium

New Phalaenopsis (NP)

Buah anggrek dikultur secara in-vitro

menggunakan medium New Phalaenopsis

(NP) pada masing-masing cawan petri dan

tiap buah ditabur pada 10 jenis petri untuk

menghindari

terjadinya

kemungkinan

kontaminasi medium kultur. Setelah 3

minggu, Protocorm sudah muncul dan

dilakukan subkultur pada petri dengan

jumlah 4 untuk perlakuan kolkisin.

3. Perlakuan Mutasi dengan Kolkisin

Penambahan kolkisin pada medium

New Phalaenopsis (NP) anggrek yang telah

mencapai fase Protocorm-like bodies (PLB)

masing-masing 0.075% (gr/100 ml) selama

1 minggu kemudian dipindahkan kedalam

medium tanpa kolkisin. Setelah 3 minggu,

maka PLB siap untuk diekstraksi.

4. Isolasi

DNA

Genom

Tanaman

Anggrek

Isolasi DNA anggrek Spathoglottis

dilakukan dengan mengambil 0,1 gram daun

segar tanaman kemudian dimasukkan ke

dalam

tube

1,5

mL

lalu

digerus

menggunakan pastle kecil yang sebelumnya

telah dicelupkan pada larutan nitrogen cair.

Setelah sampel daun digerus, kemudian

ditambahkan 600 µL buffer isolasi DNA.

Tube lalu diinkubasi pada waterbath suhu

68

o

C

selama

15

menit.

Kemudian

ditambahkan 500 µL kloroform dingin, lalu

tube dishake selama 1 jam dengan kecepatan

110 rpm. Kemudian disentrifugasi dengan

kecepatan 5.000 rpm selama 5 menit.

Aqueous layer selanjutnya dipindahkan ke

dalam tube 1.5 mL baru lalu ditambahkan

isopropanol dengan peringan 1:1 dengan

larutan aqueous layer. Tube diinverse

sebanyak 6 kali lalu didiamkan selama 10

menit. Selanjutnya tube disentrifugasi

dengan kecepatan 5.000 rpm selama 5

menit. Supernatan dibung kemudian pellet

DNA dicuci dengan menggunakan ethanol

70% lalu di sentrfugasi kembali 10.000 rpm

selama 2 menit. Supernatan dibuang, lalu

pellet DNA dikeringanginkan pada vacuum.

Setelah pellet DNA kering, kemudian

ditambahkan larutan TE (0,1-10 M)

sebanyak 50 µL. Sampel DNA kemudian di

simpan pada suhu -20

o

_C.

5. Analisis

Random

Amplified

Polymorphism DNA (RAPD) anggrek

Spathoglottis

PCR dilakukan menggunakan kit

PCR Go Taq Green©. Pertama dilakukan

pembuatan premix PCR sesuai dengan

jumlah sampel yang akan di PCR namun

jumlahnya

dilebihkan

1

untuk

meminimalisir habisnya premix. Komposisi

premix untuk satu reaksi yaitu 12,5 µL kit

PCR, 10 µL ddH

2

O dan 2 µL primer.

Kemudian ditambahkan sampel DNA

genom yang akan di PCR. Konsentrasi DNA

genom yang digunakan yaitu 50-75 ng/ µL.

Sampel kemudian di running menggunakan

alat

PCR

BOECO

dengan

suhu

predenaturasi 95

o

_{C (5 menit), dan kemudian}

dilanjutkan dengan siklus yang diulang

sebanyak 45 kali yaitu denaturasi 95

o

C,

annealing 38

o

C, dan elongasi 72

o

C. Siklus

selanjutnya diakhiri dengan post-elongasi 72

o

_{C (10 menit) lalu holding 4}

o

_{C selama 5}

menit. Amplikon disimpan pada suhu 4

o

_C.

6. Deteksi

Polimorpisme

Profil

fingerprinting

DNA

Anggrek

Spathoglottis

Hasil PCR RAPD kemudian di

lakukan analisis polimorfisme pita hasil

elektroforesis. Data berupa pita-pita DNA

diubah menjadi matriks 0-1, yaitu pita DNA

yang muncul diubah menjadi matriks 0-1,

yaitu yang muncul diberi nomor 1

sedangkan yang tidak muncul diberi nilai 0.

Matriks

dibuat

dengan

menggunakan

program Microsoft Excel (.xls). Nama

spesies diletakkan pada pada kolom pertama

lalu data diisi secara horizontal. Hasil

skoring kemudian dimasukkan pada data

kolom selanjutnya.

7. Analisis Data dan Pembuatan

bar-coding DNA Anggrek

Pengamatan DNA hasil elektroforesis

dapat diamati dengan menggunakan UV

transluminator. DNA kemudian di beri skor

berdasarkan jarak tempuhnya (bp) dan diberi

skor yaitu 0 apabila tidak ada yang muncul

dan 1 untuk kenampakan yang ada. Data

biner dan yang didapat dianalisis dengan

menggunakan MVSP versi 2.0. Modul

SIMQUAL

digunakan

dalam

mengeneralisirkan

matriks

similaritas

Koefesien Jaccard (Jaccard, 1908). Ukuran

similaritas dikonversi ke dalam jarak genetik

menggunakan rumus Sij=a/(a+b+c)*100%.

Matriks jarak yang diperoleh digunakan

analisis

pengelompokkan.

Hasil

pengelompokan kemudian digunakan dalam

menyusun dendogram dengan metode

unweighted

pair-group

method

with

arithmetic mean (UPGMA).

3. HASIL DAN PEMBAHASAN

Isolasi

DNA

genom

anggrek

Spathoglottis dapat dilakukan dengan

menggunakan buffer isolasi DNA sederhana

menggunakan

deterjen

komersial.

Penggunaan deterjen berfungsi sebagai

pelarut lipid, melarutkan dan menstabilkan

protein dan senyawa lain yang mengandung

permukaan hidrofobik yang signifikan,

pendenaturasi protein serta agen emulsi

(Rickwood and Patel, 1995).

Uji

kuantitatif

DNA

genom

menggunakan metode elektroforesis untuk

mengetahui ukuran panjang pasangan basa

dan berat molekul dari DNA anggrek

Spathoglottis. Berdasarkan elektroforesisi

DNA

anggrek

diperoleh

hasil

elektroforegram seperti Gambar 1. Menurut

Li dan Yang (1996) pita DNA pada

elektroforegram yang baik adalah apabila

pita DNA terlihat jelas dan mempunyai

keseragaman ukuran panjang pasangan basa

tanpa adanya smear. Kuantitas DNA

anggrek ditentukan menggunakan metode

spektrofotometri

UV

pada

panjang

gelombang 260 nm dan 280 nm (Murray and

Thompson, 1980).

Gambar 1. Uji kuantitatif DNA genom

anggrek Spathoglottis. M=marker, 1= S.

plicata, 2=S. plicata poliploid, 3=S.

plicata var. pink, 4=S. plicata var, pink

poliploid,

5=S.

kimballiana,

6=S.

kimballiana poliploid, 7= S. Sutra Ungu,

8=S. Bintang Segunung, 9=S. Kuning

layung, 10=S. Bintang IOCRI, dan

11=S. Kartika.

Metode

Random

Amplified

Polimorphic DNA (RAPD) merupakan

metode

yang

paling

popular

dalam

penentuan marka molekular suatu karakter

genetik makhluk hidup. Hal ini dikarenakan

penanda RAPD merupakan penanda yang

cukup

efisien

untuk

identifikasi

polimorfisme secara cepat dan akurat

(Williams et al., 1990). PCR-RAPD anggrek

Spathoglottis

menggunakan

4

primer

random berdasarkan penelitian Khasravi et

al., (2009).

Amplikon PCR-RAPD dari 4 jenis

primer

dianalisis

menggunakan

elektroforeisis

sehingga

diperoleh

elektroforegram seperti pada Gambar 2-5.

Analisis

polimorfime

DNA

anggrek

Spathoglottis menggunakan software MVSP

dengan cara menentukan polimorfisme

pita-pita DNA yang teramplifikasi. Scoring

DNA digunakan sebagai dasar dalam

pembuatan

dendogram

dengan

menggunakan analisis Jaccad’s

m

coefficient.

Gambar 2. Hasil elektroforesis 11 spesies

anggrek Spathoglottis menggunakan

primer OPU 7. M=marker, 1= S.

plicata, 2=S. plicata poliploid, 3=S.

plicata var. pink, 4=S. plicata var, pink

poliploid, 5=S. kimballiana, 6=S.

kimballiana poliploid, 7= S. Sutra

Ungu, 8=S. Bintang Segunung, 9=S.

Kuning layung, 10=S. Bintang IOCRI,

dan 11=S. Kartika.

Gambar 3. Hasil elektroforesis 11 spesies

anggrek

Spathoglottis

menggunakan

primer OPU 10. M=marker, 1= S. plicata,

2=S. plicata poliploid, 3=S. plicata var.

pink, 4=S. plicata var, pink poliploid,

5=S. kimballiana, 6=S. kimballiana

poliploid, 7= S. Sutra Ungu, 8=S. Bintang

Segunung, 9=S. Kuning layung, 10=S.

Bintang IOCRI, dan 11=S. Kartika.

Gambar 4. Hasil elektroforesis 11 spesies

anggrek

Spathoglottis

menggunakan

primer OPAW 11. M=marker, 1= S.

plicata, 2=S. plicata poliploid, 3=S.

plicata var. pink, 4=S. plicata var, pink

poliploid,

5=S.

kimballiana,

6=S.

kimballiana poliploid, 7= S. Sutra Ungu,

8=S. Bintang Segunung, 9=S. Kuning

layung, 10=S. Bintang IOCRI, dan 11=S.

Kartika.

Gambar 5. Hasil elektroforesis 11 spesies

anggrek

Spathoglottis

menggunakan

primer OPU 14. M=marker, 1= S. plicata,

2=S. plicata poliploid, 3=S. plicata var.

pink, 4=S. plicata var, pink poliploid,

5=S. kimballiana, 6=S. kimballiana

poliploid, 7= S. Sutra Ungu, 8=S. Bintang

Segunung, 9=S. Kuning layung, 10=S.

Bintang IOCRI, dan 11=S. Kartika.

Berdasarkan

m

analisis

clustering

karakter pita-pita DNA elektroforegram

RAPD dihasilkan dendorgam (Gambar 6)

dengan range koefisien similaritas

0.24-0.72.

Karakterisasi

didasarkan

pada

polimorfisme

pita-pita

DNA

yang

teramplifikasi dengan menggunakan 4

primer acak. Hasil analisis dendorgam

Anggrek Tanah (S. plicata var. Tarakan

control (2n=2x=44) diketahui bahwa Indeks

Similaritasnya dengan S. plicata var.

Tarakan poliploid mengelompok pada IS

0.23. Oleh karenya dapat dipastikan bahwa

anggrek ini telah mengalami mutasi yang

menyebabkan terjadinya perubahan struktur

sekuen DNA spesifik pada tiap-tiap primer

yang digunakan. Menurut Setiawan (2012)

anggrek yang diperlakukan dengan kolkisin

melebihi konsentrasi optimum maka dapat

menyebabkan auto multiplikasi kromosom

secara tidak teratur. Kondisi ini dapat

menyebabkan mutasi kromosom terutama

delesi salah satu kromosom. Peristiwa ini

ditandai dengan pertumbuhan plantlet yang

abnormal, misalnya anggrek menjadi kerdil

dan pertumbuhan daun yang tidak simetris

dikarenakan gen homeobox daun mengalami

mutasi. Berbeda halnya dengan anggrek S.

kimballiana kontrol dan poliploid yang

mengelompok pada IS ≥0,70. Hal ini

dikarenakan konsentrasi kolkisin yang

digunakan belum optimal untuk melakukan

mutasi pada tanaman. Sedangkan jenis

anggrek Spathoglottis hybrid maupun yang

telah dipoliploid mengelompok ≤0.70.

Menurut Pamungkas (2011) apabila terdapat

spesies yang mengelompok ≥0.70 maka

dinyatakan sebagai satu jenis spesies yang

sama namun spesies yang mengelompok

≤0.70 dinyatakan sebagai spesies yang

berbeda.

Oleh

karenanya,

anggrek

Spathoglottis plicata var. pink poliploid dan

S. plicata var. Tarakan poliploid dinyatakan

sebagai varietas baru apabila diingkan

dengan kontrolnya.

Gambar 6. Dendogram similaritas 11 spesies

anggrek

Spathoglottis

berdasarkan

karakter molekular dengan metode

UPGMA.

Berdasarkan dendogram similaritas

(Gambar 6) diketahui bahwa terdapat

perbedaan antara anggrek yang telah diberi

perlakuan

kolkisin

dengan

kontrol.

Perbedaan tersebut terlihat jelas pada

pengelompokkan IS spesies pada taraf

>70%, namun pada spesies Spathoglottis

kimballiana kontrol dengan S. kimballiana

poliploid menunjukkan bahwa keduanya

masih tidak berbeda jauh secara fenetik.

4. KESIMPULAN

Berdasarkan hasil penelitian yang

telah dilakukan maka dapat disimpulkan

bahwa metode molekular RAPD dapat

digunakan

dalam

deteksi

Anggrek

Spathoglottis plicata var. Tarakan poliploid

menggunakan

Primer

OPAW11.

Elektroforegram amplikon PCR RAPD

OPAW 11 dapat digunakan sebagai

bar-coding DNA Anggrek Spathoglottis plicata

var. Tarakan poliploid yang dapat digunakan

untuk melacak Anggrek Asli Indonesia.

Hasil analisis dendogram menunjukkan

bahwa anggrek Spathoglottis poliploid dapat

mengelempok sendiri dan secara fenetik

berbeda spesies dengan anggrek kontrol.

5. REFERENSI

Griesbach, R. J. 1981. Colchicine-induced

polyploidy in phalaenopsis orchids.

Plant Cell, Tissue and Organ

Culture. 1 (1):103-107.

Irawati. 2002. Pelestarian jenis anggrek di

Indonesia.

Prosiding

Seminar

Anggrek Nasional, Yogyakarta.

Khosravi A.R, M.A. Kadir, S.B Kadzemin,

F.Q. Zaman, and D.A.E. de Silva.

2009. RAPD analisys of colchisin

induced

variation

of

the

Dendrobium

Serdang

Beauty.

African Journal of Biotechnology 8

(8):1455-1465.

Li Y.Y. and B. Yang. 1996. Practical

protocols in molecular biology.

Edited by Yongming Li and Yuqi

Zhao, Science Press. New York

Murray, M.G. and W.F. Thompson. 1980.

Rapid isolation of high molecular

weight plant DNA. Nucleic Acid

Res. 8(19):4321-5.

Pamungkas R.P.2011. Variasi genetik dan

hubungan

kekerabatan

fenetik

tanaman durian (Durio zibethinus

Murr.)

di

Jawa

berdasarkan

karakter

molekular.

Tesis.

Yogyakarta:

Fakultas

Biologi

Universitas Gadjah Mada.

Rickwood, D. and D. Patel. 1995. Cell and

molecular biology essential data.

John Wiley and Sons. New York.

Sarathum, S., M. Hegele, S. Tantiviwat, and

M. Nanakorn. 2010. Effect of

Concentration and Duration of

Colchisine Treatment on Polyploidy

Induction

in

Dendrobium

scabrilingue L. Europ.J.Hort.Sci.

75(3):123-127.

Setiawan, A. 2012. Peningkatan kualitas

anggrek

Tanah

(Spathoglottis

plicata Blum 1825) dengan teknik

poliploid in-vitro. Laporan Seminar.

Yogyakarta:

Fakultas

Biologi

Universitas Gadjah Mada.

Sulistianingsih, R., Z.A. Suyanto, dan N.

Anggia. 2004. Peningkatan Kualitas

Anggrek

Dendrobium

Hibrida

dengan Pemberian Kolkhisin. Ilmu

Pertanian 11 (1):13-2.

Williams, J.G.., A.R. Kubelik, K.J. Livak,

J.A. Ravalski, and S.V. Tingey.

1990. DNA polimophism amplified

by Arbitrary Primer are useful as

genetic markers. Nucleic Acid

Research 18(22): 6531-6535

Zainudin A. 2010. Optimasi Proses

PCR-RAPD Anggrek Phalaenopsis sp.

yang telah Diperlakukan dengan

Colchicine.

Malang:

Jurusan

Agronomi

Fakultas

Pertanian

Universitas Muhammadiyah Malang.