3. METODOLOGI PENELITIAN
3.1. Waktu dan Tempat
Penelitian dilaksananakan pada bulan Maret-Juni 2009 di Laboratorium Diagnostik, Departemen Ilmu dan Penyakit Hewan dan Kesehatan Masyarakat Veteriner, Fakultas Kedokteran Hewan, Laboratorium Bioteknologi Hasil Perairan, Laboratorium Biokimia Hasil Perairan dan Laboratorium Mikrobiologi Hasil Perairan, Departemen Teknologi Hasil Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor.
3.2. Alat dan Bahan
Peralatan yang digunakan pada penelitian ini yaitu cawan petri, erlenmeyer 1 liter, inkubator shaker, oven, sentrifuse, timbangan, viskometer gilmont (bola jatuh), gelas ukur, kertas saring Whatman 42, satu unit membran Reverse osmosis (CSM Model No: RE75-1812-50GPD) dengan nilai rejeksi 95% NaCl dan luas permukaan 0,38 m² (Lampiran 1), termostat, baker glass 2 liter dan chromameter Minolta CR 300.
Bahan-bahan yang dilakukan dalam penelitian ini adalah bakteri Pseudomonas aeruginosa yang diperoleh dari laboratorium Mikrobiologi Medik, FKH-IPB, media pertumbuhan bakteri yaitu NA (Nutrien Agar) dan BHI (Brain Heart Infusion) Broth, etanol 96%, akuades dan NaOH.
3.3. Metode Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan dalam dua tahap. Tahap pertama, yaitu produksi alginat dari bakteri P. aeruginosa dan tahap kedua pemekatan alginat dengan teknologi membran.
3.3.1. Produksi alginat dari Pseudomonas aeruginusa
a. Penentuan kurva pertumbuhan dan pengukuran konsentrasi alginat (Modifikasi Hassett 1996)
Inokulum yang diperoleh dari stok kultur FKH disegarkan dalam cawan padat dengan media NA selama 24 jam pada suhu 37 oC. Mikroba tersebut diinokulasikan ke dalam 250 ml media BHI broth dalam erlenmeyer 1 liter dan diinkubasi dalam shaker dengan kecepatan 150 rpm selama 48 jam pada suhu
37 oC. Selama inkubasi dilakukan pengamatan pada jam ke-0, ke-3, ke-6, ke-9, ke-12, ke-18, ke-24, ke-30, ke-36, ke-42 dan ke-48. Parameter yang diamati selama inkubasi, yaitu biomassa kering bakteri, konsentrasi alginat dan viskositas. Parameter tersebut diamati untuk mengetahui laju pertumbuhan bakteri dan laju pembentukan produk (alginat) yang nantinya digunakan untuk penetapan waktu proses optimal pada produksi alginat skala besar. Diagram penentuan kurva pertumbuhan dan pengukuran konsentrasi alginat dapat dilihat pada Gambar 8.
b. Produksi alginat skala besar.
Proses ini dilakukan setelah mengetahui kondisi optimal pertumbuhan bakteri dan konsentrasi alginat yang didapatkan. Tahap ini diawali dengan pembuatan inokulum sebanyak 10% dari jumlah total media yang ada. Untuk membuat 10 liter kultur bakteri, terlebih dahulu disiapkan 1 liter inokulum yang yang dibagi menjadi dua, yaitu masing-masing 500 ml. Mikroba diambil dari stok kultur yang telah disegarkan sebanyak 4-5 ose dan dimasukkan kedalam erlenmeyer yang telah berisi BHI broth. Inokulum tersebut diinkubasi dalam shaker 150 rpm dengan lama inkubasi sesuai dengan kondisi optimal yang telah didapatkan pada tahap sebelumnya pada suhu 37 oC. Kemudian inokulum tersebut dimasukkan kedalam 10 liter media dan dinkubasi dengan waktu yang sama pada suhu 37 oC, kecepatan 150 rpm. Selanjutnya kultur sebanyak 10 liter disterilkan untuk meminimalisir bahaya kontaminasi pada proses pemisahan alginat dengan teknologi membran. Diagram proses produksi alginat skala besar dapat dilihat pada Gambar 9.
Gambar 8. Penentuan kurva pertumbuhan bakteri Pseudomonas aeruginosa dan pengukuran konsentrasi alginat.
Stok kultur
Inokulasi bakteri 2-3 ose dalam erlenmeyer 1 l dengan vol kerja 250 ml
Inkubasi dalam shaker 150 rpm, 37 oC selama 48 jam
Pengamatan pertumbuhan bakteri (t = 0,3,6,9,12,18,24,30,36,42, dan 48 jam)
Viskositas Penyegaran bakteri dalam cawan padat dengan media NA selama 24 jam pada
suhu 37 oC
Sentrifugasi 5000 rpm selama 15 menit (Evans dan Linker 1973)
Dikeringkan dalam oven 60-80 oC sampai
beratnya konstant
Supernatan
Alginat dikeringkan dalam oven suhu 60-80 oC sampai beratnya konstant Biomassa sel
Supernatan + etanol 96% (2-3 x volume)
Penyaringan dengan kertas saring Whatman 42 Biomassa
kering
Gambar 9. Proses produksi alginat skala besar.
3.3.2. Proses pemekatan alginat dengan teknologi membran
Pemekatan alginat (umpan) dilakukan dengan proses membran reverse osmosis. Pada proses ini alginat dimasukan kedalam tangki umpan dan dialirkan ke dalam membran. Produk hasil proses membran yang berupa permeat (bagian yang dapat melewati pori membran) dan retentat (bagian yang tidak dapat melewati pori membran) diresirkulasikan ke dalam tangki umpan. Pada waktu tertentu dilakukan sampling terhadap permeat dan retentat untuk pengukuran fluks dan nilai rejeksi. Diagram alir proses pemekatan alginat dengan teknologi membran dapat dilihat pada Gambar 10.
Kultur dipindahkan dalam media 10 liter dan dinkubasi dengan kondisi optimal
Kultur siap dilakukan proses filtrasi dengan membran reverse osmosis
Kultur dipanen dan disterilkan dalam autoklaf
Stok kultur
Pembuatan inokulum 1 liter dengan menginokulasi bakteri 4-5 ose dengan vol
kerja masing-masing 500 ml BHI broth
Inkubasi dalam shaker 150 rpm, 37 oC, lama
inkubasi optimal
Penyegaran bakteri dalam cawan padat dengan media NA selama 24 jam pada
suhu 37 oC
Gambar 10. Diagram alir proses pemekatan alginat dengan teknologi membran.
A. Karakteristik membran
a) Penentuan permeabilitas (Uju 2005)
Permeabilitas membran diukur untuk mengetahui kemampuan membran dalam melewati air destilasi. Permeabilitas membran diukur dengan cara menggunakan air destilasi sebanyak 600 ml sebagai umpan. Proses pengukuran dilakukan dengan kisaran tekanan transmembran yang digunakan 276–690 kPa. Pada setiap tekanan transmembran yang diujikan, besarnya fluks permeat diukur.
Nilai permeabilitas membran (K) ditentukan dengan cara menghitung gradien plot grafik antara nilai fluks (J) sebagai sumbu Y dan tekanan transmembran (∆P) sebagai sumbu X.
b) Pengaruh tekanan transmembran terhadap nilai fluks.
Pengaruh tekanan transmembran dilihat dengan mencobakan beberapa nilai tekanan pada proses recovery, yaitu 552-690 kPa. Sampel yang digunakan adalah kultur alginat sebanyak 600 ml. Setiap tekanan yang dicobakan diukur nilai fluksnya.
Kultur tanpa bakteri
Penentuan nilai fluks dengan umpan kultur alginat pada kisaran tekanan 552-690 kPa
Penentuan nilai fluks dan rejeksi dengan pengaruh tekanan dan suhu
Selesai
Penentuan permeabilitas membran dengan umpan air destilasi pada kisaran tekanan 276-690 kPa
Penentuan waktu tunak fluks
c) Penentuan waktu tunak
Penentuan waktu tunak fluks dilakukan dengan menghitung fluks permeat sejak kondisi variabel terpasang. Jeda waktu pengukuran lima menit dan penghitungan fluks permeat dilakukan setiap satu menit sekali selama 60 menit. Fluks dianggap tunak jika 5-10 kali pengukuran memperoleh nilai yang sama.
B. Pengaruh variabel operasi
a) Pengaruh tekanan transmembran dan suhu terhadap nilai fluks
Pengaruh tekanan transmembran dan suhu dilihat dengan mencobakan beberapa nilai tekanan pada proses recovery, yaitu pada tekanan 552, 620 dan 690 kPa dengan suhu 35, 40 dan 45oC. Setiap perlakuan yang dicobakan diukur nilai fluksnya.
b) Pengaruh tekanan transmembran dan suhu terhadap nilai rejeksi
Pengaruh tekanan transmembran dan suhu dilihat dengan mencobakan beberapa nilai tekanan pada proses recovery, yaitu pada tekanan 552, 620 dan 690 kPa dengan suhu 35, 40 dan 45oC. Setiap perlakuan yang dicobakan diukur nilai rejeksinya.
C. Proses pengkonsentrasian retentat (alginat) a) Fluks (Cheryan 1998)
Fluks didefenisikan sebagai jumlah volume cairan yang berhasil melewati membran (fraksi permeat) untuk setiap satuan luasan membran dan satuan waktu. Nilai fluks (J) dihitung dengan menggunakan persamaan :
∑
3600
b) Rejeksi (Cheryan 1998)
Rejeksi merupakan kemampuan suatu membran dalam menahan partikel terlarut tertentu. Nilai konsentrasi alginat diukur dengan cara:
c) Karakteristik warna retentat
Warna diukur dengan menggunakan alat chromameter Minolta CR 300. Sampel diletakkan pada tempat yang tersedia. Setelah menekan tombol start akan diperoleh nilai L, a dan b, masing-masing dengan kisaran 0 sampai 100 (putih). Pada dasarnya jenis warna dibentuk dari tiga warna dasar, yaitu merah (X), hijau (Y), dan biru (Z). kemudian nilai skala warna X, Y, Z dikonversikan menjadi notasi warna Hunter yang terdiri dari tiga parameter, yaitu nilai a, b dan L. konversi nilai-nilai tersebut dikonversi dengan rumus:
17,5 1,02 √ 7,0 0,0847 √ L = 10 √Y Keterangan:
(a+) = merah (a-) = hijau (L) = Kecerahan (b+) = kuning (b-) = biru
3.4. Analisis Data
Rancangan percobaan yang dilakukan dalam penelitian ini adalah two level factorial design (Box et al. 1979). Parameter yang diteliti, yaitu tekanan transmembran dan suhu dengan respon yang diukur adalah fluks (J) dan rejeksi membran (Robs). Sementara itu, batasan taraf nilai variabel yang digunakan
disajikan dalam Tabel 2.
Tabel 2. Penentuan tarif nilai variabel yang digunakan
Parameter Nilai pengkodean dan taraf sebenarnya
-1 0 +1
TMP (kPa) 552 621 690
i i<j
Model rancangan percobaan untuk mengetahui hubungan liner dari variable tekanan transmembran dan laju alir bahan terhadap respon nilai fluks dan rejeksi diberikan pada persamaan berikut:
Y = ao + aixi + aijxixj
Keterangan:
Y = respon dari masing-masing perlakuan xi ; xj = variable bebas
ao = intersep
ai = koefisien regresi orde pertama
aij = koefisien interaksi untuk interaksi variable i dan j
3.5. Prosedur Analisis
a) Bobot biomassa kering (Modifikasi Evans dan Linker 1973)
Proses pemanenan sel setelah kultur fermentasi mencapai lama fermentasi yang ditentukan. Kultur mula-mula diukur volumenya, sebanyak 10 ml. Massa sel dipisahkan melalui sentrifugasi pada kecepatan 5000 rpm selama 5 menit. Hasil pemisahan berupa fase padat adalah massa sel, yang selanjutnya dikeringkan pada oven dengan suhu 60–80 oC sampai beratnya konstan dan dinyatakan sebagai
berat sel kering.
b) Pengukuran konsentrasi alginat
Konsentrasi alginat diukur dengan cara mengambil filtrat yang didapatkan dari pengukuran massa kering sel sebanyak 10 ml, kemudian ditambahkan dengan etanol 96% sebanyak 30 ml, lalu diaduk dan di saring dengan menggunakan kertas saring 42 Whatman. Etanol ditambahkan untuk mengendapkan alginat. Kertas saring hasil saringan dioven dengan suhu 60–80 oC selama 24 jam, kemudian ditimbang untuk mengetahui berat alginat yang dihasilkan.
c) Penentuan viskositas (Uju 2005)
Sebanyak 5 ml larutan/cairan sampel dimasukkan ke dalam tube viskometer hingga 75% volume tube. Bola dimasukkan ke dalam tube dan adapter dikencangkan untuk menggenggam bola. Bola dilepaskan hingga jatuh sepanjang tube viskometer. Selang waktu tempuh bola dicatat ketika melewati dua garis Fiduciary.
Viskositas larutan/sampel dihitung dengan menggunakan persamaan: η = K(ρf – ρ) t
Keterangan :
η = viskositas cairan (cP) K = konstanta viskometer = 3,3
ρf = densitas bola (stainless steel : 8,02)
