OPTIMASI WAKTU INKUBASI SINTESIS NUKLEOTIDA BERTANDA [r_32p]atp

(1)

~

batan

PROSIDING SEMINAR

PENELITIAN DAN PENGELOLAAN PERANGKAT

NUKLIR

Pusat Teknologi Akselerator don Proses Bahan

Yogyakarta, Rabu, 11 September 2013

OPTIMASI W AKTU INKUBASI SINTESIS NUKLEOTIDA

BERTANDA

[r_32p]ATP

Wira Y Rahman1*, Endang

Sarmini1, Herlina1,

Hotman

Lubis1, Triyanto1, Hambali1

Pusat Radioisotop Dan Radiofarmaka (PRR) - BATAN [email protected]

ABSTRAK

OPTIMASI WAKTU SINTESIS NUKLEOTIDA BERTANDA Irtp]A TP. Nukleotida

bertanda fosfor-32 (2 P) [y-32PI-adenosine triphosphate {[y- 2P]-A TP} salah satu

senyawa yang banyak digunakan dalam penelitian biologi molekul. Untuk dapat

menunjang penelitian biologi molekul di Indonesia, telah dilakukan pembuatan

senyawa nukleotida bertanda [y_32p]_ATP melalui reaksi enzimatis menggunakan

prekursor DL-glyceraldehyde 3-phosphate, nukleotida adenosine di-phosphate (ADP)

dan H/2p04, serta enzim gliseraldehid 3-phosphat dehidrogenase,

3-phosphogliserat-kinase dan laktat dehidrogenase. Optimasi waktu inkubasi proses sintesis nukleotida

bertanda dilakukan untuk mencari kondisi yang optimum, dalam arti waktu yang paling

menguntungkan dalam proses sintesis tersebut. Dari proses sintesis tersebut berhasil

diperoleh [y_32p]_ATP dengan rendemen pembentukannya

93,91%

dengan waktu

optimum

5

menit. Dengan berhasilnya dilakukan sintesis dan optimasi waktu inkubasi

sintesis nukleotida bertanda [y_32p]_ATP maka Pusat Radiosiotop dan Radiofarmaka

akan dapat menyediakan nukleotida bertanda dimaksud di atas untuk menunjang

penelitian biologi molekul di Indonesia.

ABSTRACT

OPTlMIZA TlON TIME SYNTHESIS OF NUCLEOTIDE LABELED ly·32P]_A TP.

Adenosine triphosphate-labelled with y_32p([y_32p]_ATP) has been widely used in the

biotechnology research, usually

as a

tracer to study aspects

of

physiological and

pathological processes. In order to support biotechnology research in Indonesia,

a

process for production

of

[y-32P]-A TP with enzymatic reaction was used as Brecursors

DL-glyceraldehydde 3-phosphate, Adenosine Diphosphate (ADP) and H32p04, and

enzyme glyceraldehid 3-phosphate dehydrogenase, 3-phosphoglyceryc

phosphokinase and lactate dehydrogenase. Optimization

of

incubation time labeled

nucleotide synthesis process is performed to find the optimum conditions, in terms of

the most advantageous time in the synthesis process. With the success of the

synthesis and optimization is done incubation time of synthesis labeled nucleotide, the result suggested can be used for producing [y_32p]_ATP to support the provision of radiolabeled nucleotide for biotechnology research in Indonesia.

PENDAHULUAN

Salah

_{kesehatan yang dikombinasikan}satu aplikasi teknologi nuklir dalam bidang_{dengan teknik} biologi molekul adalah mendeteksi virus, kuman atau bakteri penyebab penyakit atau yang telah bermutasi. Deteksi ini dilakukan melalui penentuan urutan asam nukleat DNA virus, kuman atau bakteri tersebut menggunakan teknik

polymerase chain reaction (PCR) dan hibridisasi dot blot. Teknik hibridisasi membutuhkan pelacak

(probe) yang berperan untuk mendeteksi tfagmen DNA-nya yang spesifik tersebut. Pelacak merupakan asam nukleat rantai pendek beruntai tunggal (untai tunggal RNA atau DNA) yang memiliki sekuen spesifik yang akan dideteksi dan berlabel radioaktif P-32, salah satunya adalah

[y-32p]ATP [4,5.6) Teknik penggunaan pelacak

DNAIRNA untuk mendeteksi gen atau fragmen DNA yang diinginkan atau untuk mendeteksi klon

(2)

PRO SIDING SEMINAR

PENELITIAN DAN PENGELOLAAN

PERANGKAT

NUKLIR.

Pusat Teknologi Akselerator dan Proses Bahan Yogyakarta, Rabu 11 September 2013

~

batan

Gambar 1. Proses sintesis nukleotida bertanda [y_32p]ATP CliO I H-C-QH OH

I

CH20P CH3CHC()()" D-GLYCERALDEHYD,:'PHOSP~,,::~ _~LAcrATE

GL.;,.ca.ALDEF.YDE.1-PH~J'~aATE LACTATEDEHYDROGENASE

DDffDROG£N..uE~115jf'EH" (LDH) Coo"p 0 I II H--C-OH CHC-COO' I P~RUVATE CH20P

yang benar dikenal dengan nama teknik Southern

Blotting [7,8,9],

Kebutuhan pelacak [y_32p]ATP untuk penelitian biologi molekul di Indonesia saat ini sulit dalam pengadaannya, terutama dalam ijin impomya. Maka dengan fasilitas yang ada di Pusat Radioisotop dan Radiofarmaka (PRR-BAT AN) diharapkan kebutuhan pelacak tersebut dapat disediakan. Penelitian ini bertujuan untuk membuat senyawa nukleotida bertanda [y)2p]ATP yang akan digunakan untuk penelitian dalam bidang biologi molekul. Sintesis [y_32p]ATP dilakukan menggunakan reaksi enzimatisllO,lIl. Dari penelitian sebelumnya telah berhasil disintesis nukleotida bertanda [y)2p]ATP, maka perlu dilakukan optimasi waktu inkubasin~a sehingga diperoleh waktu optimalnya sehingga proses sintesis lebih efisien.

Proses sintesis nukleotida bertanda P-32 dimulai dari DL-gliseraldehid 3-fosfat, yang bereaksi dengan asam fosfat (H/2p04)

menghasilkan 1,3-disfosfogliseraldehid. Senyawa 1,3-difosfogliseraldehid berubah menjadi asam 1,3-difosfogliserat dengan bantuan enzim

gliseraldehid-Air (aquabidest 0,5 M Tris-HCI 0,3 M Ma nesium Klorida 0,125 M Natrium oiruvat 5 mM ADP 0,2 M Dithiothreitol 0,02 M DL I ceraldehide 20 mM NAD

3-fosfat dehidrogenase, kofaktor ion Mg ++ serta koenzim NAD+. Selama reaksi berlangsung molekul NAD+ akan berubah menjadi NADH. Molekul NADH ini dengan bantuan enzim laktat

TEORI DAN TATA KERJA

Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah H/2p04 bebas pengemban dengan kemumian radiokirnia diatas 97% yang dibuat oleh Pusat Radioisotop dan Radiofarmaka (PRR). Enzim gliseraldehid-3-phosphat dehidrogenase (80 unit/mg) 10 mg/ml, phosphogliserat kinase (450 unit/mg) 10 mg/ml, dithiothreitol, tris-HCI, DL-gliseraldehid 3-fosfat dari Sigma Aldrich. Sedangkan laktat dehidrogenase (250 unit/mg) 5 mg/ml, adenosin di-fosfat (ADP), P-nicotinarnide adenine dinucleotide (NAD), magnesium klorida dari Merck.

Bahan penunjang yang digunakan dalam penelitian ini diantaranya kromatografi lapisan tipis (KL T), plastik polyethyleneimine (PEl) cellulose

dari E.Merck, kertas indikator pH universal, peralatan gelas dan tabung mikro.

Peralatan yang digunakan yaitu sentrifuga berpendingin ( refrigerated centrifuge) (Allegra Beckman Coulter), penangas air (Memmert), Mini TLC Scanner (Bioscan AR-2000), dan Liquid Scintilation Counter (LSC) (MicroBeta Trilux).

Cara Kerja

1. Preparasi campuran yang digunakan

Pembuatan larutan campuran A: 100 J.lL campuran berikut ini dibuat dalam satu tabung rnikro

2. Preparasi pereaksi campuran untuk buffer pelet enzim

Pembuatan larutan campuran B: 50 J.lL larutan berikut disiapkan dalam satu tabung rnikro dehidrogenase akan berubah kembali menjadi NAD+ disertai pengubahan asam piruvat menjadi asam laktat. Senyawa 1,3-difosfogliserat selanjutnya berubah menjadi 3-fosfogliserat dengan bantuan enzim fosfogliserat kinase, disertai dengan perubahan ADP menjadi ATP. Kemudian dilakukan pemumian dengan menggunakan kromatografi penukar anion DEAE-Sephadexl12,Q .

Salah satu faktor yang menentukan hasil sintesis nukleotida bertanda [y_32p]ATP melalui reaksi enzimatis adalah waktu inkubasi. Untuk mendapatkan hasil yang optimal perlu ditentukan lamanya waktu sintesis yang dibutuhkan sehingga didapatkan hasil yang optimal. Optimasi waktu sintesis dilakukan dengan rentang waktu satu jam, setiap 15 menit reaksi enzimatis dilakukan pencuplikan dan dianalisa dengan KLT.

Seiring dengan perkembangan biologi molekul di Indonesia maka kebutuhan akan senyawa nukleotida bertanda untuk perunut menjadi sangat penting. Untuk itu penguasaan teknik sintesis nukleotida bertanda akan sangat mendukung peningkatan kemampuan di bidang biologi molekul.

LEGEND P=pol' 32pi=32pO .•J-]·PHOSPHOGL YCERA TE I.]-DIPIIOSPIIOGI.YCERA TE ~(O'OI""'NDP)

PHOSPItOGL YCERATE KINASE (pGK) \1 ):?).:\TP(Ote-lk~NTI'} COO I H-C-OH I CH,OP

(3)

~

batan

PENELITIAN DAN PENGELOLAAN

PERANGKAT

NUKLIR

Pusat Teknologi Akselerator don Proses Bahan Yogyakarta, Rabu, 11 September 2013

Preparasi campuran enzim

Pembuatan campuran enzim : 12 ilL campuran enzim berikut dibuat didalam satu tabung mikro 3. 0,5 M 0,3 M 0,2 M 42,5 ul 2,5 2,5 2,5

H332P04 dengan kemurnian radiokimia yang tinggi dan layak digunakan untuk pembuatan nukleotida bertanda [y_32p]ATP. Analisa kemurnian radiokimia H/2p04 dilakukan dengan sistim KLT, dengan menggunakan

PEl

Cellulose sebagai fasa diam dan

larutan KH2P04 0,5 M pH 3,5 sebagai fasa gerak, Dari proses pemurnian radioisotop H/2p04 tersebut diperoleh kemurnian radiokimianya - 97%, dengan Rf 0,690 seperti terlihat pada radiokromatogram berikut :

Glyceraldehydes 3-phosphate I 50 ~I I (40 units) dehydrogenase Lactate dehydrogenase

50 ~I (62,5 units 3-phosphoglycerate 50 ~I (225 oSDhokinase units (tni't't:) (1:'1'111) (mM)

R-o $tart ~ Ctl:O.~ RF

~ 1 uta 30<$ 2$.1 iU:H R9A:2 111.1 14a..$ 132~1' ():,6$~ ~ RhOkm R~ %qf %DI C~ •• CPM Tokd R01 i93.o 3,M,O Q,03 0...04 $3604.7;0 10120tw,g 95,1$$ gU)8 .$36240.0 1072480~O K.:I$9 100.00 100 Position(mID)

Gambar 2. Radiokromatogram larutan H/2p04 setelah proses pemurnian

Sintesis dimulai dari DL- Glyceraldehyde 3-phosphate dengan menggunakan tiga campuran enzim yaitu lactate dehydrogenase, Glyceraldehydes 3-phosphate dehydrogenase serta 3-phosphoglycerate phosphokinase. Setelah itu dilakukan proses sintesis nukleotida bertanda

[0-32p]ATP menggunakan radioisotop P-32 dengan aktivitas 3,76 mCi, sebanyak 200 ilL. Pembentukan [y_32p]ATP diamati dengan cara mencuplik sejurnlah tertentu sampel setiap 15 menit reaksi yang kemudian dianalisis dengan sistem KLT dengan menggunakan PEI Cellulose sebagai fasa diam dan larutan KH2P04 0,5 M pH 3,5 sebagai fasa gerak. Rendemen pembentukan nukleotida bertanda P-32 pada saat 15 menit inkubasi mencapai 76,66%, RfO,275.

Campuran enzim tersebut disentrifugasi pada kecepatan 15000 rpm selama 20 menit. Setelah diambil supematannya, endapan enzim kemudian dilarutkan dengan 50 ilL larutan campuran B.

4. Proses sintesis [y-32P]ATP

Ke dalam tabung mikro bervolume 1,5 ml dimasukk~~ 40 III H/2p04 (aktivitas terukur) diatur pH· 7-9 dengan larutan . 5M NaOH. Selanjutnya ke dalam larutan tersebut ditambahkan berturut-turut 40 III larutan campuran A dan 10 III campuran enzim. Inkubasi dilakukan selama (t) menit dan dicuplik setiap waktu tertentu selama 1 jam. Reaksi dihentikan dengan memasukkan tabung mikro ke dalam penangas air bersuhu 70°C selama 3 menit untuk menghentikan reaksi enzimatis. Kemudian dilakukan proses pemisahan dengan menggunakan kolom penukar ion DEAE-Sephadex.

5. Analisa hasil sintesis [y_32p]ATP

Hasil sintesis dianalisa kemurnian radiokimianya menggunakan KLT

PEl

Cellulose sebagai fasa diam dan KH2P04 0,5 M

pH 3,5 sebagai fasa gerak. Kemudian ditentukan

Rrnya

dengan Bioscanner.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Dalam proses penyiapan [y_32p]ATP dibutuhkan 32p dalam bentuk H/2p04, maka hal pertama yang dilakukan adalah melakukan uji kualitas H/2p04 yang akan digunakan dalam proses sintesis yang dimaksud di atas. Hal ini dilakukan karena radionuklida 32p berupa larutan H/2p04 (dalam bentuk orto-fosfat) cenderung tidak stabil dalam penyimpanan dan mudah berubah menjadi senyawa polifosfat. Pemurnian radioisotop P-32 menggunakan kolom kromatogafi penukar kation Dowex AG 50 (l x 8) yang telah dikondisikan dengan HCI O,IM, sehingga diperoleh larutan

10000

o

(4)

PROSIDING SEMINAR

PENELITIAN DAN PENGELOLAAN PERANGKAT NUKLIR

Pusat Teknologi Akselerator dan Proses Bahan

Yogyakarta, Rabu 11 September 2013

@>

batan

(mm) (mm)%OfR~~ (ft\rn) RoQlbt> ,",of Rq 8mn $OOf1 C~'!f'Pk1'IF C($Uobt"PM Tot ••1RO' """, 41.7 702$1>.1

on.

2t2120,O7S","74.M"254.0,0 R••• '(f'.' 10"090.$ 0.-4$3S.9010142.04L7tU2e,f,O R ••• ~ '05'" t4~.a122 .• 0.4Uis.,''''C5tU 2.0•Uti'1224,0

•....•. .1.25554M8,0100,00 27'1474.0 (mm)...(mm)(m"'l% ••R:.gionR_

Ro. S10pStartCentroid

RF """nlsTotalROICPM Ron , 42.6 11.1!$G.2 0.211"0.411.0DO.e33M70.0 13." Ron • ...• '00'"".1 0'""701.051.02S150.o7500.0 Ron • 121.2 '''".8132,' 0.•••1~O.O~!taoo.Q4.&7 .... 3 h.ka ••••••••• 1128",0 &e,72 100..00 30000 • ~ 20000 ..

,

i:

Ii

" 1\

i \

, \

[

>-Gambar 3. Radiokromatogram pembentukan

[y-32p]ATP setelah inkubasi 15 menit

Dari kromatograrn yang sarna juga dapat dilihat masih terdapat 16,44% H/2p04 (Rf 0,613) bebas atau yang tidak terikat pada ATP. Inkubasi dilakukan selama 60 menit dan dicuplik setiap 15 menit, rendemen pembentukan nukelotida bertanda [y_32p]ATP dapat dilihat pada gambar berikut :

100.00 I ,

Garnbar 5. Radiokromatogram pembentukan [y-32p]ATP setelah inkubasi 5 menit

Dari kromatogram ini dapat dilihat persentase rendemen hasil sintesis [y_32p]ATP sebesar 93,91 %,(RfO,281). Dari kromatograrn yang sarna juga dapat dilihat masih terdapat 5,04% H/2p04 (RfO,663) bebas. 100.00 , 90,00 ~ 80,00_c: OJ E .:: 70,00

_"

!

60,00 .., ••

•

70,00 o

•

5

•

10

•

15 20 25

Gambar 4. Rendemen pembentukan nukleotida bertanda P-32 [y_32p]ATP dengan waktu inkubasi selama 60 menit

Dari Gambar 4. terlihat bahwa pada menit ke-30 terjadi sedikit kenaikkan rendemennya, pada menit ke-45 cenderung tetap, tetapi sampai menit ke-60 tidak terjadi kenaikkan yang cukup signifikan, malah terjadi sedikit penurunan, maka proses sintesis diulang lagi dengan memperpendek waktu sintesis menjadi 20 menit dengan selang waktu pencuplikan setiap 5 menil. Aktivitas yang digunakan untuk proses sintesis ini 3,99 mCi sebanyak 200 ilL, temyata dalam waktu 5 menit rendemen pembentukan nukleotida bertanda

[y-32p]ATP mencapai 93,91 %, terlihat dari kromatogram berikut :

i

...

__.

~~u(menit)

Gambar 6. Rendemen hasil inkubasi setiap 5 menit pencuplikan

Rendemen hasil sintesis pada menit ke-IO, ke-15 dan ke-20 cenderung berkurang, dari beberapa literatur kemungkinan [y_32p]ATP yang sudah terbentuk terurai kembali karena reaksinya bersifat reversible, dengan memf:ercepat menghentikan reaksi enzimatik kondisi [y- 2p]ATP yang terbentuk dapat dipertahankan. Dari Gambar 6. waktu yang optimal untuk inkubasi pembentukan nukleotida bertanda P-32 [y_32p]ATP adalah 5 menit, karena dengan bertambahnya waktu tidak menarnbah rendemen pembentukannya.

(5)

©>

batan

PENELITIAN DAN PENGELOLAAN PERANGKAT NUKLIR

Pusat Teknologi Akselerator dan Proses Bahan

Yogyakarta, Rabu, 11 September 2013

KESIMPULAN

Sebelum larutan H/2p04 digunakan untuk proses sintesis [y_32p]ATP terlebih dahulu dilakukan pemumian dengan cara melewatkan H/2p04 ke dalam kolom penukar kation Dowex AG 50 (1 x 8) yang telah dikondisikan dengan HCI O,lM. Diperoleh kemurnian radiokimia

H332P04-99% setelah proses pemurnian ini. Dari hasil sintesis yang dilakukan diEeroleh waktu inkubasi optimum proses sintesis [y- 2p]ATP adalah 5 menit, dengan memberikan rendemen 93,91% pada Rf 0,281.

UCAPAN TERIMAKASIH

Penulis mengucapkan terimakasih kepada sejawat yang terkait dengan penelitian ini terutama dari Bidang Keselamatan PRR dan kepada Bapak Dr Abdul Mutalib yang telah mempercayakan penelitian ini kepada saya.

DAFT AR PUST AKA

1. FATCHIYAH DAN ESTRI LARAS ARUMNINGTYAS. "Kromosom, Gen, DNA, Synthesis Protein dan Regulasi", Laboratorium Biologi Molekuler dan Selluler Universitas Brawijaya, Malang, 2006

2. NUNUK PRIYANI, "Sifat Fisik dan Kimia DNA", Program Studi Biologi dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Sumatera Utara, 2004

3. DWI SURY ANTO, "Melihat Keaneka-ragaman Organisme Melalui Beberapa Teknik Genetika Molekuler", Program Studi Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Sumatera Utara.

4. SUHARSONO, "Struktur dan Ekspresi Gen", Jurusan Biologi FMIP A, Institut Pertanian Bogor.

5. LEHRINGER, A.L, "Dasar-Dasar Biokimia Jilid I", Erlangga, Jakarta, 1982

6. ARIS TJAHJOLEKSONO, "Teknologi DNA Rekombinan", Jurusan Biologi FMIPA, Institut Pertanian Bogor, hall - 16.

7. MUKH. SYAlFUDIN DAN DEVITA TETRIANA, "Analisis Mutasi Gen inhA untuk Uji Resistensi M.Tuberculosis terhadap Isoniazid dengan Metode SSCP radioaktif', Pusat Teknologi Keselamatan dan Metrologi Radiasi, BAT AN, Jakarta.

8. MARIA UNA R, BUDIMAN BELA DAN ANDI YASMON, "Deteksi Mutasi Gen KATG

(MyobacteriumTuberculosis) dengan Metode

PCR (Polymerase Chain Reaction) - Hibridisasi

Dot Blot menggunakan Pelacak Oligonukleotida

Bertanda 32p", Jurnal Aplikasi Isotop dan Radiasi, 2000.

9. BUDIAWAN, "Pengembangan Teknik 32p_ Postlabelling untuk Mendeteksi Dini Resiko Kanker", Risalah Pertemuan Ilmiah Penelitian dan Pengembangan Teknologi Isotop dan Radiasi, 2000.

10.F. SAKAMOTO, M. IZUMO, K. HASHIMOTO, Y. FUJI, "Study of Optimum Condition for Synthesis of [y}2p]ATP with High Specivic Radioactivity", Journal of Radioanalytical and Nuclear Chemistry, Vol. 239,1998, No.2 (1999) 423-427.

11.PAUL F. SCHENDEL AND ROBERT D. WELLS, "The Synthetic and Purification of

[y-32p] Adenosine Triphosphate with High Specific Activity", The Journal of Biology Chemistry, Vol. 248, No. 23, (8319 - 8321) Issue of December 10.

12. JHONSON, ET AL, "Enzymatic Process for Preparing [y-32P]-Labeled Nucleotides", United State Patent, June, 1980.

13. WIRA Y RAHMAN, ENDANG SARMINI, HERLINA, DKK, " Sintesis ATP Bertanda P-32 sebagai Perunut Biologi Molekul", Pertemuan Ilmiah Radioisotop, Radiofarmaka dan Siklotron, 2010.

TANYA JAWAB Giarno

>

Apa manfaat pospor32 untuk kesehatan?

>

Bagaimana proses pembuatannya?

Wira

Y

R

~ Dalam kesehatan digunakan untuk pengobatan

leukemia, sebagai pelacak dalam biologi

molekul dalam bentuk{

t32P1ATP,

untuk

identifikasi virus human papiloma (HPV)

penyebab kanker serviks.

~ Proses pembuatan pospor 32 dengan mengiradiasi sulfur di reactor dengan reaksi

(6)