ISOLASI DNA DARI TANAMAN Brassica juncea
Khurin’in (1112095000006)¹ drh. Bhintarti S. Hastari, M.Biomed²
Festy Aulyaur Rahmah, S.Si² Nugroho Adi Maulana³
Indina Reihannisha³
¹Mahasiswa Biologi, Fakultas Sains dan Teknologi, UIN Syarif Hidayatullah Jakarta ²Dosen praktikum Biologi Molekular
³Asisten praktikum Biologi Mlekular Jl. Ir. H. Juanda No.95 Ciputat 15412 Indonesia
Hurin.rin02@gmail.com 17 Oktober 2014
ABSTRAK
Isolasi DNA tanaman adalah langkah pertaman dalam teknik pemuliaan tanaman untuk mengeksploitasi genetik tanaman sehingga didapat sifat tanaman yang unggul. Dalam praktikum isolasi DNA tanaman kali ini digunakan daun muda dan segar dari tanaman sawi hijau yang sedikit kontaminan DNA dan metabolit sekundernya. Sawi hijau merupakan salah satu komoditi tanaman yang populer di pasaran, mudah ditemukan dengan harga terjangkau. Beberapa teknik yang perlu diperhatikan dalam isolasi DNA tanaman yaitu proses isolasi jaringan secara mekanik seperti penggerusan untuk mempermudah proses pelisisan dinding sel tanaman yang strukturnya lebih kompleks dibandingkan struktur dinding sel bakteri. Selain itu perlu juga diperhatikan metabolit sekunder yang terdapat pada bagian tanaman yang akan diisolasi karena dapat menjadi kontaminan sehingga menghambat proses isolasi DNA.
Kata kunci : Isolasi, DNA, tanaman
I. DASAR TEORI
Sawi hijau (Brassica juncea) merupakan komoditi tanaman sayuran yang populer di pasaran. Sawi hijau mudah tumbuh di dataran rendah ataupun dataran tinggi sehingga mudah didapat. Pada suhu yang sejuk akan lebih cepat
berbunga. Seluruh bagian dari tanaman ini diambil kecuali akarnya (Susanti, 2012).
1993) yang bertujuan memaksimumkan hasil pada suatu kondisi lingkungan tertentu dalam suatu usaha budidaya pertanian dengan meminimalkan keluaran. Salah satunya lewat modifikasi keragaman tanaman. Keberhasilan usaha pemuliaan tanaman sangat tergantung pada kemampuan mengidentifikasi induk jenis unggul yang sifatnya akan digabungkan melalui persilangan serta mengenali dan menyeleksi dalam populasi yang bersegeregasi secara efektif dan hal ini dapat dilakukan melalui tahap isolasi DNA terlebih dahulu (Shivanna dan Sawhney, 1997).
Berbagai teknik analisis dalam pemulian tanaman dan biologi molekuler yang berdasarkan pada hibridisasi molekuler atau Polymerase Chain Reaction (PCR) membutuhkan DNA dalam jumlah yang cukup dan kualitas yang baik. Oleh karena kandungan senyawa sekunder dalam sel tanaman berbeda-beda, maka setiap tanaman membutuhkan prosedur isolasi yang optimum agar diperoleh DNA genom yang dapat digunakan sebagai bahan dalam analisis molekuler. Optimasi prosedur tersebut dapat dilakukan terhadap komposisi larutan bufer lisisnya ataupun teknik penanganan fisik dalam pemisahan DNA genom dari senyawa lain. Pada prinsipnya optimasi prosedur ini bertujuan melindungi DNA genom dari degradasi akibat senyawa sekunder yang dilepaskan ketika sel dihancurkan atau kerusakan akibat penanganan fisik (Miligan, 1992). seringkali terkontaminasi oleh polisakarida dan metabolit sekunder seperti tanin, pigmen, alkaloid dan flavonoid. Sedangkan DNA dari hewan lebih banyak mengandung protein. Salah satu kesulitan isolasi DNA dari tanaman tinggi adalah proses destruksi dinding sel untuk melepaskan isi sel. Hal ini disebabkan karena tanaman memiliki dinding sel yang kuat dan seringkali pada beberapa jenis tanaman, kontaminasi tersebut sulit dipisahkan dari ekstrak asam nukleat. Kehadiran kontaminasi di atas dapat menghambat aktivitas enzim, misalnya DNA tidak sensitif oleh enzim restriksi dan menggangu proses amplifikasi DNA dengan PCR. Demikian pula pada hewan yang memiliki kandungan kitin (seperti serangga), memerlukan teknik dan metode khusus untuk menghancurkan sel hingga isi dapat terpisah atau keluar dari sel (Kusumawaty, 2012).
II. MATERI DAN METODE
Praktikum isolasi DNA tanaman ini dilaksanakan pada hari Jum’at, 24 Oktober 2014 pkl. 13.30-16.00 WIB di Laboritorium Biologi Dasar Pusat Laboritorium Terpadu Fakultas Sains dan Teknologi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.
Alat-alat yang digunakan yaitu mikropipet, refrigerated centrifuge, water bath dan refrigerator.
Bahan-bahan yang digunakan yaitu daun sawi, bufer ekstraksi, kloroform, isoamilalkohol, isopropanol dan bufer TE.
mikro steril. Dilunakkan daun selama 10 menit pada suhu ruang, tip steril digunakan sebagai penumbuk daun (tanpa menggunakan penambahan buffer). 500 L bufer ekstraksiʯ (200 mM Tris-HCl pH 7,5), 250 mM NaCl, 25 mM EDTA, dan 0,5% SDS) dimasukkan kedalam tabung lalu divortex selama 5 menit.
Tabung kemudian diinkubasi dalam waterbath pada suhu 60 ºC selama 30 menit. Ditambahkan kloroform: isoamil alkohol (24:1) sebanyak 1 x volume sampel. Tabung kemudian dikocok dan lalu disentrifuga pada 15.000 x selama 5 menit pada suhu 4ºC. diambil uspernatan lalu dipindahkan ke tabung mikro yang baru. Isopropanol ditambahkan kedalam tabung sebanyak 1x volume sampel. Tabung kemudian dikocok dan diinkubasi pada suhu -20 ºC selama 15 menit. Tabung kemudian disentrifuugasi pada 15.000 x g selama 5 menit setelah itu dibuang supernatannya dan ditambahkan 100 ʯL bufer TE. Tabung dimasukkan kedalam es selama 5 menit dan kemudian disentrifugasi kembali pada 15.000 x g selama 2 menit. Diambil supernatan yang mengandung DNA kemudian dipindahkan ke tabung yang baru dan simpan tabung pada suhu -20 ˚ C.
III. HASIL DAN PEMBAHASAN
Isolasi DNA dari tanaman sawi hijau (Brassica juncea) pada tahap pertama yaitu dilakukan isolasi jaringan yang diambil dari daun sawi hijau yang masih muda dan segar. Pemilihian sawi hijau adalah karena sawi hijau merupakan komoditi sayuran yang mudah didapat dan harganya terjangkau (Susanti, 2012), selain itu struktur daunnya yang tidak tebal, tidak terdapat trikom ataupun modifikasi epidermis
lainnya serta pertulangan daunnya tidak banyak dan keras mempermudah pengerjaan dalam proses isolasi jaringan. Selain itu akar memiliki struktur yang keras sehingga sulit dalam proses isolasi jaringannya, sedangkan pada buah terdapat banyak metabolit-metabolit sekunder yang dapat menjadi kontaminan yang sulit dipisahkan dari ekstrak asam nukleat (Kusumawaty, 2012). Adapun hasil dari berbagai tahapan dalam isolasi DNA dari tanaman sawi hijau dapat dilihat pada tabel 3.1.
tahap I dan dimana pada tahap ini daun sawi hijau ditumbuk dengan tip steril hingga halus. Tahap ini bertujuan untuk mempermudah tahap pelisisan sel. Hal ini disebabkan karena tanaman memiliki dinding sel yang kuat dan seringkali pada beberapa jenis tanaman, kontaminasi tersebut sulit dipisahkan dari ekstrak asam nukleat. Kehadiran kontaminasi di atas dapat menghambat aktivitas enzim, misalnya DNA tidak sensitif oleh enzim restriksi dan menggangu proses amplifikasi DNA dengan PCR, sehingga memerlukan teknik dan metode khusus untuk menghancurkan sel hingga isi dapat terpisah atau keluar dari sel salah satunya yaitu dengan penumbukan (Kusumawaty, 2012).
sudah dihaluskan kemudian divorteks selama 5 menit agar homogen. Penambahan bufer ekstraksi yaitu untuk merusak membran sel dan menjaga struktur DNA selama proses pelisisan dengan berbagai campuran. NaCl berfungsi untuk menghilangkan polisakarida, sebagaimana telah dijelaskan sebelumnya bahwa dinding sel tanaman mengandung polisakarida dan metabolit lain (Kusumawaty, 2012). Keberadaan polisacharida dan metabolit sekunder dalam sel tanaman sering menyulitkan dalam isolasi asam nukleat (Wilkins dan Smarts, 1996). EDTA berfungsi untuk mencegah koagulasi DNA sedangkan SDS berfungsi untuk merusak membran sel. Setelah dilakukan vorteks, tabung kemudian diinkubasi di waterbath pada suhu 60ºC selama 30 menit, tujuannya agar mengoptimalkan kerja dari bufer ekstrak.
Tahap ketiga yaitu purifikasi DNA, tahap ini berfungsi untuk memisahkan DNA dengan protein lain dan sisa-sisa dari larutan pada saat proses pelisisan sel. Pada tahap ini ditambahkan CIAA (24:1) sebanyak 1 x volume sampel. Pelarut organik ini secara signifikan dapat mendenaturasi protein dan melarutkan komponen lipid, selain itu kloroform juga menstabilkan zona interfase yang berisi kontaminan DNA. Pada penambahan kloroform ini akan menghasilkan tiga fasa yaitu paling atas adalah DNA dan air, fasa kedua protein dan sisa-sisa kontaminan atau sampah dari sel yang disebut juga zona interfase, dan fasa ketiga adalah kloroform seta senyawa-senyawa organik yang diikatnya sehingga disebut juga fasa organik. Fase ini memisahkan DNA dengan kontaminannya sehingga DNA yang didapat merupakan DNA murni, selain itu juga memudahkan pengambilan DNA yang terdapat
di fasa paling atas akibat adanya penambahan kloroform.
Tahap selanjutnya adalah pemekatan DNA. Cara sederhana dan murah untuk memisahkan DNA dari larutan dapat dilakukan dengan presipitasi dengan menggunakan alkohol seperti isopropanol. Proses presipitasi isopropanol umumnya dilakukan dalam kondisi suhu dingin yaitu dengan diinkubasi pada suhu -20ºC selama 15 menit, suhu ini mendukung DNA dalam bentuk presipitat. Setelah perlakuan itu, DNA akan terpresipitasi dan dapat dipeletkan dengan sentrifugasi. Pada saat penambahan dengan isopropanol langsung terlihat adanya pemisahan larutan menjadi dua fasa, dan DNA terprepitisasi dibawah (lampiran 7.)
Tahap berikutnya yaitu pengawetan prespitat DNA pada yang telah didapat dengan menggunakan bufer TE dan disimpan pada suhu -20ºC. Perlakuan penyimpanan pada suhu tersebut dan penambahan Bufer TE berfungsi untuk mengawetkan DNA, dan menjaga kondisi pellet DNA tidak rusak.
IV. KESIMPULAN
Kesimpulan dari praktikum isolasi DNA dari tanaman sawi hijau (Brassica juncea) yaitu:
1. Bagian tanamna yang diambil harus dalam keadaan masih muda dan segar karena kontaminannya lebih sedikit. 2. Dilakukan penggerusan dalam
mengisolasi jaringannya karena struktur dinding selnya lebih kompleks dibandingkan bakteri.
Kusumawaty, Diah. 2012. Materi Kuliah; Isolasi DNA Kecil. Pendidikan Biologi UPI. Bandung.
Miligan, B.G. 1992. Plant DNA Isolation. In: A.R. Hoelzel (Ed). Molecular Genetic Analysis of Populations, a Practical Aproach. Oxford University Pres. New York.
Shivanna K.R., Sawhney V.K. 1997. Pollen biology and pollen biotechnology: an introduction In Pollen Biotechnology for Crop Production and Improvement Cambridge University Press.
Stoskopf, N.C., Thomes D.T. dan Christie B.R. 1993. Plant Breeding, Theory and Practice. Westview Press. Oxpord. Susanti, T., Rondonuwu F.S. dan Sutresno A.
2012. Pengaruh musik pada range frekuensi (3000-6000 Hz) terhadap pertumbuhan dan produktivitas sawi hijau (Brassica juncea). FMIPA Fisika Universitas Kristen Satya Wacana. Diponegoro.
Wilkins, T.A. and Smart, L.B. 1996. Isolation of RNA from Plant Tissue. Di dalam:
LAMPIRAN
Lampiran Perhitungan Pengenceran
1. Diketahui: 1 M Tris-HCL Ph 7,5 200Mm Tris-HCL Ph 7,5 diambil sebanyak 1,5ml dengan total 7,5 ml
Ditanya: V1?
M1.V1 = M2. V2
1000. V1 = 7,5. 200
V1= 1,5 ml
2. Diketahui: 5 M NaCl 250 Mm NaCl diambil sebanyak 0,375 ml dengan total 7,5 ml
Ditanya: V1?
M1. V1 = M2. V2
5000 . V1 = 7,5. 250
V1 = 0,375 ml
3. Diketahui: 0,5 M EDTA 25 Mm EDTA diambil sebanyak 0,375 ml dengan total 7,5 ml
Ditanya: V1?
M1. V1 = M2. V2
500 . V1 = 7,5 . 25
V1 = 0,375 ml
4. Diketahui: 20 % SDS 0,5 % SDS diambil sebanyak 0,19 ml dengan total 7,5 ml
Ditanya: V1?
M1. V2 = M2. V2
20 . V1 = 7,5 . 0,5
V1 = 0,19
5. Ditanya: volume yang diambil untuk 2,44 ml dengan total 7,5 ml?
dd H2O (Aquades ) = 7,5 – 2,44 = 5,06 ml
Lampiran Gambar
Lampiran 1. Penambahan Buffer Ekstraksi dan divortex
Lampiran 2. Inkubasi 30 menit suhu 60oC
Lampiran 3. Penambahan isopropanol
Lampiran 5. Hasil setelah di sentrifugasi
Lampiran 6. Supernatan diambil
Lampiran 7. Penambahan isopropanol
Lampiran 8. Penambahan buffer TE pada pelet
