Identitas Buku
1. Judul jurnal : A Textbook On Biotechnology 2. Penulis : H.D. Kumar
3. Tahun : 2013
4. ISBN : 81-85938-90-3
GENETIC ENGINEERING (Rekayasa genetika)
Rekayasa genetika salah satu fondasi dasar bioteknologi modern Karena modifikasi genetik atau manipulasi mikroorganisme yang bermanfaat adalah ultilization penting atau menguntungkan dalam produksi berguna, produk bernilai tinggi. selain budaya mikroba sel tumbuhan dan hewan dapat secara genetik dimanipulasi untuk keuntungan ini mungkin dalam pandangan kemampuan kita dalam banyak kasus meningkat kultur protoplas (dan sekering mereka) apa yang dapat ditangani seperti mikroba dalam percobaan genetik. Teknik atau rekayasa genetika telah memungkinkan dalam beberapa kasus untuk mentransfer gen dari satu organisme ke organisme lain dengan mengatasi penghalang spesies gen percobaan manipulasi memerlukan penggunaan enzim dengan metabolisme asam nukleat. enzim memungkinkan untuk memanipulasi DNA in vitro. Paling penting ini apakah enzim yang disebut pembatasan endonuklease-yang merupakan bagian dari gudang bakteri telah berevolusi sebagai mekanisme pertahanan terhadap resiko invasi unsur genetik alien zoals bakteriofag dan plasmid. yang nucleases menghidrolisis asam nukleat ke dalam nukleotida. sebuah exonucleases mengunyah untai DNA antara dua nukleotida kabisat. Endonuklease restriksi memotong DNA pada urutan tertentu. bakteri-yang menghasilkan sintesis endonuklease restriksi melindungi urutan spesifik dalam DNA mereka sendiri dengan masking mereka dengan kelompok certainement kimia dengan Konsekuensi Bahwa endonuklease restriksi tidak bisa memotong urutan spesifik di bakteri bakteri pada dengan DNA tetapi dapat menyerang hanya DNA asing.
In vitro atau teknologi DNA rekombinan Terdiri Dari empat langkah berikut
2. Gunakan atau kloning vektor (vektor plasmid, vektor berasal dari vektor fag lambda tujuan khusus kloning, organisme vektor untuk orang lain daripada E.coli)
3. Deteksi dan analisis klon (screening rekombinan klon karakterisasi DNA kloning) 4. Manipulasi gen kloning (mutagenesis, gen kloning)
simon 1992 telah menggambarkan perkembangan oligomer glycines N-tersubstitusi sebagai motif untuk generasi atau Kimia beragam perpustakaan molekul baru. oligomer tesis disebut peptoids. Untuk merancang sebuah alternatif untuk polimer alam Simon et al mendalilkan lima atribut describle untuk setiap sistem modular.
1. monomer memanggul akan straighforward untuk mensintesis dalam jumlah besar 2. monomer yang sudah berbagai kelompok fungsional disajikan sebagai rantai
oligomer
3. menghubungkan rantai kimia, yang dihubungan untuk enzim hidrolitik monomer menjadi akiral
Teknologi in vitro rekombinan DNA
1. Generasi dan kloning fragmen DNA (fragmen DNA menggunakan enzim restriksi, pengayaan untuk urutan DNA spesifik linkage covalen dari DNA ke vektor molekul, atau modifikasi DNA Ekstremitas isolasi molekul rekombinan dan mentransfer DNA interspesifik
2. Penggunaan vektor kloning (vektor plasmid, vektor berasal dari tujuan khusus fag lambda kloning vektor, vektor untuk organisme selain E.coli
3. Deteksi dan analisis dari klon (atau skrining rekombinan klon, karakterisasi atau DNA kloning
4. Manipulasi atau gen kloning (mutagenesis, ekspresi efisien gen kloning
Pembawa plasmid dan kloning
colicin (dan Memperoleh resistensi untuk itu) adalah ditransmisikan dari sel ke sel di atau di epidemi atau mannermouse menular.
Plasmid digunakan sebagai vektor dalam rekayasa genetika. Dalam hal ini plasmid digunakan untuk membawa suatu rangkaian fragmen DNA asing masuk dalam sel inang dengan harapan plasmid rekombinan itu mengalami replikasi dan mengekspresikan sifat baru pada DNA asing tersebut, sehingga sifat yang diinginkan dapat diperoleh dari plasmid rekombinan tersebut.
Tabel 5-1 beberapa vektor plasmid di E.coli
Palsmid Genetik marker (s) Pmb9 Colicin immunity
Pbr322 Ampicilin
Pbr325 Tc-r, Ap-r, Cm-r Pkc7 Ap-r, kanamycin (Km-r) Pacyc184 Tc-r, Cm-r
Pac105 Colicin immunity Pmk16 Tc-r, Km-r, Colicin immunity
Plasmid Genetik marker
Pub110 Km-r
Phv33 Ap-r, Tc-r, Cm-r
Pbd6 Km-r, Sm-r
Pbc16 Tc-r
Pbc16-1 Tc-r
Pgy31 Tc-r
Tabel 5-3 vektor M13
Phage Fenotipe marker
M13 mp 2 Biru
M13 mp 5 Biru
Fd 101 Ap-r, Km-r
Fd 107 Ap-r
Fd tet Tc-r
Vektor ekspresi
a. Ori (origin of replication), yaitu situs untuk memulai replikasinya sendiri, sehingga dalam sel mampu bereplikasi/menggandakan diri sendiri
b. Operator (o), mempunyai fungsi yaitu mengatur gen struktur menjadi aktif atau dalam keadaan terbuka dan menjadi tidak aktif atau dalam keadaan tertutup.
c. Promoter (p)
d. Marker seleksi berguna untuk proses seleksi, yaitu tahap untuk menyeleksi plasmid yang membawa DNA sisipan (rekombinan) dari plasmid yang tidak disisipi DNA asing. Marker seleksi yang umum adalah gen resistensi terhadap antibiotika, misalnya ampisilin atau tetrasiklin.
e. Situs kloning adalah tempat/lokasi dimana fragmen DNA yang akan diklon/digandakan dimasukkan/disisipkan untuk kemudian digandakan oleh plasmid.
f. situs kloning adalah satu segmen pada plasmid yang panjangnya beberapa puluh sampai ratusan pasang basa yang terdapat sekuens pengenal untuk beberapa enzim restriksi.
Strategi untuk Meningkatkan stabilitas plasmid pada bakteri rekayasa genetika di bioreaktor
Teknologi rDNA Providence pendekatan langsung untuk produksi berbagai macam produk biokimia dari mikroorganisme industri serta dari sel mamalia dan tumbuhan Palsmid yang digunakan secara luas digunakan sebagai vektor n rekayasa genetika untuk ekspresi gen asing di sel prokariot atau eukariotik. Berbagai plasmid yang tahu, tapi tidak semua yang berguna dalam Bioprocessing commericial. Karakteristik yang diinginkan untuk vektor berguna termasuk
1. Nomor copy Tinggi
2. Kepemilikan atau beberapa di pembatasan unik situs endonuklease lcevage 3. Ukuran kecil
4. stabilty Genetik
5. Screening penanda (gen resistensi antibiotik dikodekan oleh plasmid yang) 6. Prosedur sederhana untuk transfer ke dalam host
Rekayasa Genetika pada Hewan.
Dengan pengertian ini kegiatan pemuliaan hewan atau tanaman melalui seleksi dalam populasi dapat dimasukkan. Demikian pula penerapan mutasi buatan tanpa target dapat pula dimasukkan. Walaupun demikian, masyarakat ilmiah sekarang lebih bersepakat dengan batasan yang lebih sempit, yaitu penerapan teknik-teknik biologi molekular untuk mengubah susunan genetik dalam kromosom atau mengubah sistem ekspresi genetik yang diarahkan pada kemanfaatan tertentu.
Teknik hibridisasi meliputi dua proses, yaitu proses denaturasi atau pemisahan dua rantai asam nukleat yang komplementer dari proses renaturasi atau perpaduan kembali dua rantai asam nukleat. Proses denaturasi biasanya dilakukan dengan cara pemanasan DNA untuk memecah ikatan hidrogen yang terdapat di antara pasangan basa sehingga rantai asam nukleat akan terpisah. Proses ini kemudian diikuti dengan proses renaturasi dengan cara pendinginan. Pengujian sel bakteri pembawa rekombinan, gen-gen target, level mRNA, hasil pemotongan ER (RFLP) dan uji lainnya yang menggunakan teknik hibridisasi, membutuhkan proses denaturasi dan fragmen asam nukleat yang tidak diketahui dan memfiksasi fragmen tersebut pada bahan solid seperti filter nitroselulosa. Untuk pengujian dengan hibridisasi diperlukan suatu probe asam nukleat yang komplementer dicampurkan dengan fragmen asam nukleat yang terdapat pada bahan solid tersebut pada kondisi yang mendukung terjadinya hibridisasi. Proses hibridisasi dapat juga dilakukan dalam larutan (bukan bahan solid). Baik DNA yang hendak didiagnosis (target) maupun probe dimasukkan dalam larutan buffer. Kedua DNA tersebut bebas bergerak dan proses hibridisasinya berlangsung 5-10 kali lebih cepat daripada di bahan solid. Keadaan tersebut sangat penting dalam aplikasi kebanyakan diagnostik mikrobiologi yang memiliki konsentrasi DNA target sangat sedikit dan membutuhkan waktu diagnosis lebih cepat. Probe dapat juga dibuat dari oligonukleotida (biasanya terdiri dari 30-40 nukleotida) yang dibuat secara sintetik. Oligonukleotida tersebut dapat berupa fragmen DNA rantai tunggal atau fragmen RNA.
DNA FINGERPRINTING (sidik jari pada DNA)
Sebuah probe urutan DNA beruntai tunggal yang telah ditandai dengan radioaktivitas atau enzim sehingga probe dapat dideteksi. Ketika pasangan basa probe ke target, penyelidik dapat mendeteksi mengikat ini dan tahu di mana urutan target adalah karena probe terdeteksi. Sebagai contoh, mari kita ikuti RFLP tertentu yang ditetapkan oleh enzim restriksi EcoR I dan urutan target sebesar 20 basis
GCATGCATGCATGCATGCAT.
gen tertentu dan daerah analog yang mengandung alel mutan nya di belah oleh suatu enzim pembatas.
Tabel analisis langsung dari beberapa penyakit genetik menggunakan probe untuk mendeteksi cacat intragenik
Penyakit Probe
Achondroplasia Collagen
Adrenal hyperplasia Steroid 2 hydroxylase Atherosclerosis Apolipoprotein A-1 Diabetes melitus Insulin
Hiperkolestrol Low-density lipoprotein reseptor Leukimia t-cell antigen reseptor Phenilketonuria Phenylalanine hydroxylase
Anemia β-globulin sintetik oligonucleotide
Sistem penanda genetik
RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)
Marka molekuler RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) merupakan marka molekuler yang menggunakan enzim restriksi dalam mengidentifikasi sekuensi-sekuensi DNA suatu individu. Enzim restriksi ini berperan memotong rangkaian DNA genom individu menjadi potongan-potongan yang berbeda-beda ukurannya dan menjadi sumber informasi genetik spesifik dalam mendeteksi variasi sekuensi DNA yang dimiliki suatu individu.
marker RFLP telah berhasil dilakukan untuk individu jagung, tomat, kacang kapri dan lain-lain
Berbagai penerapan marker RFLP tersebut antara lain : (1) menduga hubungan kekerabatan dari beberapa individu yang dianalisis, (2) menduga ada tidaknya variasi genetik dari koleksi plama nutfah,(3) memonitor kemurnian benih hibrida, (4) memonitor proses seleksi (melalui linkage) berbagai karakter agronomis penting, (5) memilah-milah komponen genetik dari karakter kuantitatif, (6) menganalisis gen yang berasal dari proses transformasi genetik. Dalam hal ini, posisi integrasi dari gen tersebut dalam kromosom individu resipiennya akan dapat ditentukan.
RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)
Terdapat tiga jenis penanda genetik dalam menganalisis genom, yaitu penanda morfologi, penanda protein dan penanda DNA. Untuk menjadi penanda genetik, lokus dari penanda harus lokus yang secara eksperimen dapat mendeteksi variasi diantara individu di dalam pengujian populasi. Perbedaan jenis penanda bisa mengidentifikasi polimorfisme yang berbeda juga.
Penanda morfologi yang selama ini digunakan merupakan penanda yang berdasarkan pada hereditas Mendel yang sederhana, seperti bentuk, warna, ukuran dan berat. Karakter morfologi (fenotip) bisa digunakan sebagai indikator yang signifikan untuk gen yang spesifik dan penanda gen dalam kromosom karena sifat-sifat yang mempengaruhi morfologi dapat diturunkan. Dalam jumlah besar penanda morfologi dipelajari dan dipetakan untuk manusia, mencit, Drosophila, jagung tomat serta hewan dan tumbuhan lainnya.
Sejak ditemukan penanda DNA, penanda ini menjadi populer digunakan dalam mempelajari filogenetik molekuler. Penanda DNA adalah sebagian kecil DNA yang dapat menunjukkan polimorfisme diantara individu yang berbeda. Ada dua macam pendekatan yang dilakukan pada analisis penanda DNA ini, diantaranya pendekatan dengan hibridisasi dan PCR. Larik DNA bisa dideteksi menggunakan hibridisasi asam nukleat, larik DNA yang digunakan harus berasal dari lokus yang sama hasil isolasi dan pemurnian. Larik DNA yang sama lokus berasal dari spesies yang sama atau spesies yang lain tapi berkaitan. Hal ini menjadi dasar untuk penanda RFLP (Restriction Fragment Length polymorphism).
bisa digunakan secara acak pada penanda genetik RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA).
Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) adalah suatu sistem deteksi molekuler yang berbasis PCR, salah satu teknik molekuler untuk mendeteksi keragaman DNA didasarkan pada penggandaan DNA. RAPD juga merupakan penanda DNA yang memanfaatkan primer acak oligonukleotida pendek (dekamer) untuk mengamplifikasi DNA genom organisme (Cheema dan Pant. 2013).
Penanda RAPD telah digunakan untuk studi populasi. Secara teknis lebih sederhana daripada penanda berbasis DNA lainnya (misalnya RFLP), mampu meneliti sejumlah besar lokus, dan diharapkan untuk memberikan sampel yang jauh lebih acak dari genomik DNA. Bahwa RAPD mengungkapkan pola keragaman genetik, tapi RAPD cenderung memberikan diagnostik populasi, ras atau spesies-spesifik penanda. Karakteristik ini dapat menjadi penting untuk studi populasi dan untuk menginformasikan keputusan tentang konservasi populasi (Cheema dan Pant. 2013).
Salah satu penanda molekuler untuk analisis keragaman genetik adalah Randomly Amplified Polymorphic DNA (RAPD). Dasar dari analisis RAPD adalah penggunaan alat
Polymerase Chain Reaction (PCR) yang merupakan suatu metode in vitro untuk memperbanyak sekuen DNA dan merupakan teknik yang sangat berguna untuk identifikasi genotipik, analisa kekerabatan, filogenetik dan pemetaan genetik.
Teknik RAPD ini telah digunakan untuk mengetahui bagaimana tumbuhan langka dan terancam punah mengatur variasi genetiknya di alam untuk mempertahankan spesiesnya. Penemuan PCR dengan primer acak dapat digunakan untuk amplifikasi satu set lokus secara acak yang dapat didistribusikan dalam setiap genom, dapat memfasilitasi pengembangan penanda genetik untuk berbagai tujuan. Kemudahan dan penerapan teknik RAPD telah memikat para peneliti. Alasan utama keberhasilan analisis RAPD adalah memperoleh sejumlah besar penanda genetik yang hanya membutuhkan sejumlah kecil DNA tanpa persyaratan untuk kloning, sekuensing atau bentuk lain dari karakterisasi molekuler dari genom spesies yang bersangkutan.
Rudal Biolistic
digunakan untuk memperkenalkan gen ke dalam organel sintesis. Boynton 1998 dan Johnson pada tahun 1998 telah berhasil menembak segmen yang hilang dari DNA ke dalam ragi atau kloroplas. baik kapasitas sintesis foto dari Chlamydomonas mutan dan kapasitas pernafasan atau ragi yang rusak werw dipulihkan. Hal tersebut menunjukkan bahwa DNA kloning dimasukkan langsung menggantikan DNA yang rusak atau hilang dalam organel. sebagai hasil dari pengenalan DNA dipulihkan funcioning inherrited oleh sel. tembakan yang dalam menunjukkan dna telah Menjadi terintegrasi dan diekspresikan dalam progency sel.
Rekayasa Molekuler
Rekayasa molekuler memungkinkan untuk menghapus atau urutan substitutenucleotide di gen sasaran. gen target kloning. ini diikuti dengan penghapusan, substitusi atau penyisipan, atau DNA yang diperoleh dari gen lain atau disintesis in vitro. adalah mungkin untuk membangun hal itu memastikan ekspresi konstitutif dalam jaringan spesifik atau host. teknologi rekayasa genetika memiliki potensi untuk ook desain gen yang diekspresikan ke beberapa tingkat yang telah ditentukan di bagian spesifik dari hewan atau bahkan sel manusia. Molekul rekayasa memungkinkan menjahit produk gen yang diperlukan untuk kebutuhan tertentu. Rekayasa gen dapat dibuat untuk mengekspresikan oleh Memperkenalkan gen ke dalam sel baik oleh diri mereka atau vektor. Beberapa teknik vektor memungkinkan gen yang akan dimasukkan ke situs spesifik dalam genom sasaran. Vektor lainnya membawa gen yang menanamkan kepada penerima sel keuntungan selektif untuk pertumbuhan di media khusus vektor. Mungkin memiliki urutan DNA lebih yang memastikan bahwa gen yang direplikasi bersama dengan genom selular. Sebuah kategori ketiga vektor dirancang untuk memperkenalkan teknik gen effiiciently dan bersamaan ke sejumlah besar sel.
Kelebihan buku
1. Buku ini menjelaskan bagaimana proses rekayasa genetika sesuai dengan urutannya 2. Isi buku ini sudah lengkap dan skema untuk kloning DNA dijelaskan dengan jelas.
Terdapat berbagai tahap dalam proses rekombinan DNA
4. Untuk rekayasa genetika pada hewan terdapat beberapa proses yaitu, hibridisasi DNA, sidikjari DNA dan dijelaskan dengan skema sehingga mengetaui bagaimana teknologi rekombinan DNA dalam proses kloning gen untuk menghasilkan insulin
5. Buku ini memberikan contoh penyakit yang diakibatkan dari rekayasa genetik. Diantaranya diabetes melitus,leukimia, anemia, phenylketonuria.
6. Penanda sistem genetik terdiri dari RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) dan Randomly Amplified Polymorphic DNA (RAPD) sehingga mengetahui perbedaan dari kedua sistem tersebut.
Kelemahan buku
1. Isi buku ini sulit untuk dipahami, karena penjelasannya tidak secara rinci untuk dijelaskan.
2. Dengan materi yang sulit, perlunya pengulangan untuk memahami proses dari rekayasa genetika. Karena prosesnya tidak mudah ntuk diterapkan, sehingga lebih banyak lagi untuk menguasai dari skema yang sudah dijelaskan pada buku tersebut. 3. Didalam skema buku ini penjelasannya hanya sedikit, sehingga kesulian untuk
menerapkan bagaimana proses dari plasmid dan vektor apa saja yang dapat digunakan dalam rekayasa genetika.
