Lampiran 1. Diagram Alir Penelitian
Gen
erm(B)
Gen
mef(A) & erm(B)
Gen
mef(A)
Ekstraksi DNA
Duplex
PCR
Kultur Isolat
S. pneumoniae
hasil seleksi pada Media BA
5% + Gentamisin
Uji Mikrobiologis
(Uji sensitivitas antibiotik)
Lampiran 2. Spesifikasi Alat dan Bahan
No. Nama Alat Merek/Tipe Kegunaan Tempat
1. Erlenmeyer Duran, 100 dan 500 mL
Tempat pembuatan media
Lab. Mikrobiologi Lembaga Eijkman 2. Cawan petri plastik LabServ Tempat media agar Lab. Mikrobiologi Lembaga Eijkman 3. pH meter Thermo Orion 2
Star pH Benchtop
Mengukur pH Lab. Mikrobiologi Lembaga Eijkman 4. Heater dan
pengaduk elektrik
Barnstead Thermolyne Cimarec
Mengaduk suspensi media
Lab. Mikrobiologi Lembaga Eijkman 5. Timbangan digital Precisa Mengukur berat
bahan pembuat media
Lab. Mikrobiologi Lembaga Eijkman 6. Laminar Air Flow
Cabinet
Esco Tempat bekerja secara aseptis
Lab. Mikrobiologi Lembaga Eijkman 7. Mikropipet Eppendorf; 0,5
µl-1000 µl
Meneteskan suatu larutan dengan akurasi tinggi
Lab. Mikrobiologi Lembaga Eijkman 8. Tips Thermo ; 0,5
µl-1000 µl
Tempat meneteskan larutan pada mikropipet
Lab. Mikrobiologi Lembaga Eijkman 9. Autoklaf Hirayama Tempat sterilisasi
mekanik
Washing Facility Lembaga Eijkman
10. Refrigerator Sanyo Tempat
penyimpanan media
Lab. Mikrobiologi Lembaga Eijkman 11. Biomedical Freezer
-86oC
Thermo Freezer Tempat
penyimpanan isolat cair
Lembaga Eijkman
12. Biomedical Freezer -30oC
Sanyo Tempat
penyimpanan sampel DNA
Lembaga Eijkman
13. Disposable cotton bud
Puritan Mengulas suspensi antibiotik dan bakteri pada media
Lab. Mikrobiologi Lembaga Eijkman 14. Vortex mixer VM-300 K Menghomogenkan
suatu suspensi
Lab. Mikrobiologi Lembaga Eijkman 15. Alat sentrifugasi Thermo Heraeus
Centrifuge
Mengsentrifugasi suatu suspensi
Lab. Mikrobiologi Lembaga Eijkman 16. Inkubator Forma Scientific Menginkubasi biakan
murni mikoba
Lab. Mikrobiologi Lembaga Eijkman 17. Sarung tangan nitril Hand Seal Melindungi tangan
dari kontaminan
Lab. Mikrobiologi Lembaga Eijkman 18. Tabung vial Eppendorf; 1,5 ml Menyimpan sampel
DNA
Lab. Mikrobiologi Lembaga Eijkman 19. Tabung cryotube NUNC; 1,8 mL Menyimpan media
STGG/mikroba murni dalam bentuk cair
21. Disposable ose NUNC Menginokulasi bakteri
Lab. Mikrobiologi Lembaga Eijkman 22. Mesinthermal
cycler/PCR
Applied
BioSystems 9700
Mengamplifikasi sekuens DNA tertentu
Ruang PCR Lembaga Eijkman 23. Spektrofotometer Nano Drop
ND-1000
Mengukur kuantifikasi DNA
Lab. Konversi Energi (Lab 1) Lembaga Eijkman 24. Apparatus
elektroforesis
Bio-Rad Memisahkan molekul DNA berdasarkan ukurannya
Lab. Mikrobiologi Lembaga Eijkman 25. Power Pac Basic Bio-Rad Sumber arus listrik
untukrunning elektroforesis
Lab. Mikrobiologi Lembaga Eijkman 26. Gel-Doc 1000 Bio-Rad Visualisasi hasil
elektroforesis gel
Ruang PCR Lembaga Eijkman
27. Jarum ose Menginokulasi isolat
mikroba
Lab. Mikrobiologi Lembaga Eijkman 28. Pembakar bunsen Menciptakan suasana
aseptis
Lab. Mikrobiologi Lembaga Eijkman 29. Tabung reaksi Duran Menyimpan suspensi
cair
Lab. Mikrobiologi Lembaga Eijkman 30. Water bath Barnstead Menjaga suhu media
tetap hangat
Lab. Mikrobiologi Lembaga Eijkman 31. Alumunium foil Klin-Pak Menutup erlenmeyer Lab. Mikrobiologi Lembaga Eijkman
32. Tissue Multi Membersihkan meja
kerja
Lab. Mikrobiologi Lembaga Eijkman 33. PCRCabinet Scie-Plas Memasukkan sampel
DNA yang akan diamplifikasi
Lab. Mikrobiologi Lembaga Eijkman
34. Lilin Sumber panas Lab. Mikrobiologi
Lembaga Eijkman 35. Jar (toples kaca) Menyimpan media
berisi biakan kultur bakteri anaerob
Lab. Mikrobiologi Lembaga Eijkman 36. Rak tabung reaksi Menyimpan tabung
reaksi
Lab. Mikrobiologi Lembaga Eijkman 37. Biological Safety
Cabinet
Nuaire Tempat bekerja secara aseptis
Lampiran 2. (lanjutan)
No. Nama Bahan Spesifikasi Kegunaan
1. Isolat murniStreptococcus pneumoniaetidak peka terhadap Eritromisin
1,5 mL Isolat bakteri yang tidak peka terhadap Eritromisin
2. Darah domba 5% Sebagai media tumbuhS.
pneumoniae
3. Gentamisin 50 mg/mL Untuk menghindari
kontaminasi bakteri lain terutamaStaphylococcus
4. ddH2O 500 mL Sebagai pelarut
5. Etanol 70% Desinfektan
6. Mueller-Hinton Broth 1 mL Larutan nutrisi bakteri untuk uji sensitivitas antibiotik 7. Mueller-HintonAgar 500 g Media uji sensitivitas
antibiotik
8. Gel agarosa 1% Media untuk elektroforesis
gel
9. Go-Taq GreenMaster Mix 2x Buffer untuk reaksi PCR 10. McFarland Standard No. 0,5 Blangko untuk mengukur
turbiditas suspensi pada uji sensitivitas antibiotik 11. Glukosa (Glucose
anhydrous Molecular Biology Grade)
180.16 g/mol Sumber karbohidrat pada media
12. Gliserol 87% Sumber lemak pada media
13. Tryptone Soya Broth 500 g Bahan untuk pembuatan media STGG
14. Tryptone Soya Agar 500 g Bahan untuk pembuatan media agar darah
15. Bubuk Skim-Milk Bahan untuk pembuatan
media agar darah dan STGG 16. Forward and reverse
primermef(A)
50 µM Primer untuk genmef(A) 17. Forward and reverse
primererm(B)
50 µM Primer untuk generm(B)
18. DNA ladder 100 bp DNA Marker pada PCR
19. DNA templateS. pneumoniae
20 ng/µL DNAtemplateyang
digunakan untuk amplifikasi
20. TE Buffer 1x Buffer ekstraksi DNA
21. Eritromisindisk 15 µg Antibiotik jenis makrolida
22. TBE Buffer 1x Buffer elektroforesis gel
23. SYBRSafe 400 µl Pemberi warna yang
Lampiran 3. Komposisi Media Agar Darah Domba 5% + Gentamisin.
Bahan
Komposisi
Darah domba
50 ml
Tryptone Soya-Agar
40 g
Gentamisin
50 µl
Lampiran 4. Komposisi Media STGG
Bahan
Komposisi
Skim milk
2 g
Tryptone Soya-Broth
3 g
Glukosa
0,5 g
Gliserol
10 ml
Lampiran 5. Komposisi Media Agar
Mueller-Hinton
+ Darah Domba 5%
Bahan
Komposisi
Mueller Hinton Agar
38 g
Darah domba
50 ml
Lampiran 6. Komposisi
Go Taq Green
2x
Bahan
Konsentrasi / Kegunaan
dATP
400 M
dTTP
400 M
dGTP
400 M
dCTP
400 M
MgCl2
3mM
Pewarna kuning
Pewarna dengan kecepatan migrasi lebih cepat
dari fragmen DNA berukuran < 50 bp
Pewarna biru
Pewarna dengan kecepatan migrasi yang sama
dengan DNA berukuran 3-5 kb DNA
Taq Polymerase
Enzim yang mengkatalisis reaksi polimerisasi
Buffer
Meningkatkan densitas sampel
Lampiran 7. PCR Mix dan Kondisi untuk
Duplex
PCR
PCR Mix
Volume (µL)
Konsentrasi Akhir
Go Taq Green Mastermix (2x) 12,5 1x
erm(B) f-primer (50 µM) 0,5 1 µM
erm(B) r-primer (50 µM) 0,5 1 µM
mef(A) f-primer (50 µM) 0,5 1 µM
mef(A) r-primer (50 µM) 0,5 1 µM
DNA template @ 2 20 ng/µl*
ddH
2O 8,5
Total 25 µl
50oC 0.30 94oC
0.30 72
o C
1.30
72oC
5.00
25oC
35 Siklus
Lampiran 8. PCR Mix dan Kondisi
Singleplex
PCR
mef
(A)
PCR Mix
Volume (µL)
Konsentrasi Akhir
Go Taq Green Mastermix (2x) 10 1x
mef(A) f-primer (50 µM) 0,5 1 µM
mef(A) r-primer (50 µM) 0,5 1 µM
DNA template @ 2 20 ng/µl*
ddH
2O 12
Total 25 µl
72oC 1.00 93oC
3.00 93oC
1.00
52 o
C 1.00
72oC 5.00
25oC
Lampiran 9. PCR Mix dan Kondisi untuk
Singleplex
PCR
erm
(B)
PCR Mix
Volume (µL)
Konsentrasi Akhir
Go Taq Green Mastermix (2x) 10 1x
erm(B) f-primer (50 µM) 0,5 1 µM
erm(B) r-primer (50 µM) 0,5 1 µM
DNA template @ 2 20 ng/µl*
ddH
2O 12
Total 25 µl
50oC 0.30 94oC
0.30 72
o C
1.30
72oC
5.00
25oC
35 Siklus
