3.3 Prosedur Penelitian .1 Pengambilan Sampel
3.3.4 Analisis Kualitatif
Setiap ekstrak herba seledri ( Apium graveolens L) dianalisis untuk melihat adanya variasi fitokimia seperti steroid, triterpenoid, saponin, alkaloid, karbohidrat, flavonoid, glikosida dan fenolat melalui prosedur fitokimia standar (Rivai et al., 2010).
3.3.4.1 Protein dan asam amino
Sebanyak 1 mL larutan NaOH 40% ditambahkan 2 tetes larutan CuSO4
1% akan menghasilkan warna biru kemudian ditambahkan ke dalam 1 mL ekstrak. Terbentuknya warna merah muda atau ungu violet menunjukkan adanya protein (Rivai et al., 2010).
3.3.4.2 Uji Minyak dan lemak
a. Sebanyak 0,5 mL ekstrak, ditekan diantara kertas saring kemudian kertas saringnya tersebut diamati, terlihatnya kertas saring yang tembus pandang
35
menandakan adanya minyak. Sebagai pembanding digunakan minyak zaitun (Rivai et al., 2010).
b. Sebanyak 1 mL ekstrak, ditambah dengan asam sulfat 25 %. Pengamatan dilakukan dengan pemanasan dan positif ditandai dengan terbentuknya warna coklat muda. Pada glikolipid terbentuk warna coklat kemerahan, sedangkan sulfolipid terbentuk merah terang. (Hanani,2015)
3.3.4.3 Uji Karbohidrat a. Uji Molish
Sebanyak 1 mL ekstrak dimasukkan ke dalam tabung reaksi, ditambahkan 5 tetes reagen Molish dan dikocok. Kemudian ditambahkan 2 mL asam sulfat pekat dengan hati-hati, terbentuknya cincin berwarna ungu pada batas cairan menunjukkan adanya karbohidrat.
b. Uji Fehling
Pada 1 mL ekstrak, ditambahkan sama banyak larutan Fehling A dan Fehling B, kemudian dipanaskan, terbentuknya endapan merah bata menunjukkan adanya gula pereduksi. Dalam hal-hal tertentu reduksi terjadi di dekat titik didih dan ditunjukkan oleh endapan merah bata (Rivai et al., 2010).
3.3.4.4 Uji Flavonoid
Sebanyak 10 mL ekstrak cair diuapkan pelarutnya hingga kering.
Kemudian ditambahkan dengan 10 mL metanol P dan direfluks selama 10 menit. Hasil disaring dengan menggunakan kertas saring saat masih panas. Filtrat diencerkan dengan 10 mL air dan kemudian didinginkan. Setelah dingin,
36
ditambahkan petroleum eter dan kocok secara hati-hati kemudian didiamkan.
Lapisan metanol diuapkan pada suhu 400C dibawah tekanan. Sisa di larutkan dengan 5 mL etil asetat, lalu disaring.
a. Sebanyak 1 mL larutan percobaan diuapkan hingga kering, sisanya dilarutkan dalam 1-2 mL etanol 96%, ditambahkan 0,5 g serbuk seng dan 2 mL asam klorida 2 N, didiamkan selama satu menit. Ditambahkan 10 mL asam klorida pekat, jika dalam waktu 2-5 menit terjadi warna merah yang intensif maka positif (-) menunjukkan adanya flavonoida dan apabila tidak terbentuk warna merah, maka menunjukkan hasil negatif (-) untuk senyawa flavonoid.
b. Sebanyak 1 mL larutan percobaaan diuapkan hingga kering, sisanya dilarutkan dalam 1 mL etanol 96%, ditambahkan 0,1 g magnesium dan 10 tetes asam klorida pekat, terjadi warna merah jingga sampai merah ungu intensif maka positif (+) menunjukkan adanya flavonoida dan apabila tidak terbentuk warna merah jingga sampai merah ungu, maka menunjukkan hasil negatif (-) untuk senyawa flavonoid (Departemen Kesehatan Republik Indonesia, 1995).
3.3.4.5 Uji Alkaloid
Sebanyak 10 mL ekstrak di uapkan hingga kering, sisa kering dari ekstrak ditambahkan 1 mL asam klorida 2N dan 9 mL air kemudian dipanaskan diatas penangas air selama 2 menit. Didinginkan lalu disaring. Filtrat kemudian digunakan untuk percobaan berikut.
a. Diambil 0,5 mL filtrat, lalu ditambahkan 2 tetes pereaksi Mayer, akan terbentuk endapan putih atau kuning
37
b. Diambil 0,5 mL filtrat, lalu ditambahkan 2 tetes pereaksi Wagner, akan menunjukkan endapan coklat
c. Diambil 0,5 mL filtrat, lalu ditambahkan 2 tetes pereaksi Dragendorff, akan terbentuk endapan coklat atau jingga kecoklatan
Alkaloid positif jika terjadi endapan atau kekeruhan paling sedikit dua dari tiga percoban (Departemen Kesehatan Republik Indonesia, 1995).
3.3.4.6 Steroid dan Terpenoid a. Steroid
Sebanyak 2 mL ekstrak ditambahkan asam asetat anhidrat 2 mL. Kemudian ditambahkan dengan 2 mL asam sulfat pekat secara hati-hati pada dinding tabung. Perubahan warna dari violet ke hijau atau biru menunjukkan adanya steroid.
b. Terpenoid
Sebanyak 5 mL ekstrak dicampur dengan 2 mL kloroform dan 3 mL asam sulfat pekat secara hati-hati pada dinding tabung. Adanya warna coklat kemerahan diantara lapisan yang terbentuk menunjukkan adanya terpenoid (Ajiboye, et al., 2013)
3.3.4.7 Fenolat dan Tanin a. Uji Fenolat
Ekstrak diambil sebanyak 1 mL dan ditambahkan 1-2 tetes larutan pereaksi besi (III) klorida 1%. Larutan akan terjadi warna biru atau hijau kehitaman menunjukkan adanya senyawa fenolat.
38 b. Uji Tanin
Ekstrak diambil sebanyak 2 mL kemudian ditambahkan larutan pereaksi besi (III) klorida 1%. Larutan akan terjadi warna biru atau hijau kehitaman menunjukkan adanya tanin. Ekstrak diambil sebanyak 2 mL kemudian ditambahkan pereaksi timbal (II) asetat, adanya endapan putih menunjukkan positif tanin ( Rivai et al., 2010)
3.3.4.8 Saponin
Sebanyak 10 mL ekstrak cair diuapkan di penagas air hingga kering.
Sisa kering ditambahkan dengan 10 mL air panas, didinginkan kemudian dikocok kuat selama 10 detik. Apabila terbentuk busa yang mantap selama tidak kurang dari 10 menit, setinggi 1-10 cm dan ketika dilakukan penambahan 1 tetes asam klorida 2N buih tidak hilang menandakan bahwa adanya saponin (Departemen Kesehatan Republik Indonesia, 1995).
3.3.4.9 Uji Glikosida
Sebanyak 10 mL ekstrak diuapkan di penangas air, kemudian ditambahkan dengan 30 mL campuran (7 bagian volume etanol 95% dan 3 bagian volume air) dan ditambahkan asam klorida 2 N hingga pH ±2 kemudian direfluks selama 10 menit, didinginkan dan disaring. Pada 20 mL filtrat ditambahkan 25 mL air suling dan 25 timbal (II) asetat 0.4 M, dikocok, didiamkakan selama 5 menit lalu disaring. Filtrat disari sebanyak 3 kali, tiap kali penyarian digunakan 20 mL campuran kloroform-isopropanol (3:2). Pada kumpulan sari ditambahkan natrium sulfat anhidrat P, disaring, dan diuapkan pada suhu tidak lebih dari 50ᵒC.
39
Sisa dilarutkan dalam 2 mL metanol P. Kemudian diambil 1 mL larutan percobaan dimasukkan kedalam tabung reaksi, diuapkan diatas penangas air. Pada sisa ditambahkan 2 mL air dan 2 tetes pereaksi Molish, ditambahkan dengan hati hati 2 mL asam sulfat pekat. Jika terbentuk cincin berwarna ungu pada batas kedua cairan menunjukkan adanya glikosida (Departemen Kesehatan Republik Indonesia, 1995).
3.3.5 Pengujian Kuantitatif Senyawa 3.3.5.1 Penetapan Kadar Alkaloid Total
Sebanyak 20 mL sampel ekstrak cair dilarutkan dengan 100 mL metanol P dan 10 mL amoniak P, kemudian dipanaskan diatas penangas air selama 30 menit. Penyarian diulangi sebanyak 2 kali menggunakan jenis dan pelarut yang sama. Ditambahkan 50 mL asam klorida 1 N LP pada kumpulan filtrat, diuapkan hingga volume kurang dari 25 mL, disaring dalam corong pisah.
Filtrat dibasakan dengan amoniak P sampai pH ± 10, disari 3 kali dengan 25 mL kloroform. Fase kloroform dikumpulkan dan diuapkan pada suhu 50ᵒC, kemudian dikeringkan pada suhu 100ᵒC hingga bobot tetap. Sisa pengeringan dihitung sebagai alkaloid total (Departemen Kesehatan Republik Indonesia, 2008).
3.3.5.2 Penentapan Kadar Saponin Total
Sebanyak 50 mL ekstrak yang telah dikeringkan pelarutnya ditambah dengan 25 mL etanol 20%. Sampel dipanaskan diatas waterbath selama 4 jam dengan pengadukan secara kontiniu pada suhu 55ᵒC. Campuran disaring dan
40
residunya diekstrak kembali dengan 50 mL etanol 20%. Kumpulan ekstrak dipekatkan pada suhu 90ᵒC hingga volume 10 mL. Ekstrak yang telah dipekatkan ditambah dengan 5 mL dietil eter yang akan membentuk lapisan dietil eter.
Lapisan dietil eternya dibuang dan lapisan air nya disimpan. Pemurnian didiulangi kembali. Lapisan air yang tersisa ditambahkan dengan 15 mL butanol yang akan membentuk 2 lapisan. Lapisan butanol di simpan dan lapisan air disari kembali dengan 15 mL butanol. Kumpulan butanol ditambahkan dengan 5 natrium klorida 5%. Larutan kemudian diuapkan di waterbath. Setelah menguap sampel dikeringkan di oven hingga berat konstan (Ajiboye et al., 2013).
Analisa data kadar saponin yang dihitung menggunakan rumus :
% Kadar Saponin Total = x 100 % X1 = bobot kertas saring (g)
X2 = bobot kertas saring + endapan saponin (g), A = volume ekstrak ekstrak (g)
3.3.5.3 Penetapan Kadar Fenolat Total (Rivai, 2012)
a. Pembuatan Larutan Induk Asam Galat (1000 µg/mL)
Ditimbang sebanyak 10 mg asam galat, dimasukkan kedalam labu ukur 10 mL kemudian diadkan aquadest hingga tanda batas. Sehingga didapatkan larutan induk 1000 µg/mL.
41
b. Pembuatan Larutan Standar Asam Galat dengan Berbagai Konsentrasi.
Dari larutan induk dipipet sebanyak 0,5; 0,75; 1; 1,25; 1,5 mL dimasukkan masing-masingnya ke dalam labu ukur 10 mL. Kemudian diadkan hingga tanda batas sehingga didapatkan konsentrasi 50, 75, 100, 125, 150 µg/ mL.
c. Penentuan Panjang Gelombang Maksimum
Larutan asam galat 100 ppm dipipet sebanyak 0,5 mL, kemudian ditambahkan dengan 5 mL reagen Folin Ciocalteau 10% dan 4 mL natrium karbonat 1 M, didiamkan selama 15 menit. Kemudian diukur panjang gelombang maksimumnya dengan menggunakan Spektrofometri Ultraviolet- Visibel Pada rentang 400-800 nm.
d. Pembuatan Kurva Kalibrasi
Larutan standar asam galat masing masing nya diambil 0,5 mL ditambahkan dengan 5 mL reagen Folin Ciocalteau dan 4 mL natrium karbonat. Kemudian larutan didiamkan selama 15 menit lalu absorbansi dibaca pada panjang gelombang maksimum yang didapatkan.
e. Penetapan Kadar Fenolat Total dalam Ekstrak
Ekstrak yang menunjukkan hasil positif pada uji kualitatif diuji kadar fenolat totalnya. Masing-masing ekstrak dipipet 2,5 mL kemudian dimasukkan kedalam labu ukur 25 lalu diadkan dengan pelarut masing masing ekstrak hingga tanda batas sehingga diperoleh konsentrasi 10.000 µg/mL. Setiap ekstrak diambil 0,5 mL kemudian ditambahkan 5 mL reagen Folin Ciocalteau dan 4 mL natrium karbonat 1 M lalu didiamkan selama 15 menit. Sampel diuji
42
absorbannya pada panjang gelombang maksimum yang telah ditentukan sebelumnya.
3.3.5.4 Penetapan Kadar Flavonoid Total (Departemen Kesehatan Republik Indonesia, 2008)
a. Penyiapan larutan Induk Kuersetin (1000 µg/mL)
Sebanyak 10 mg kuersetin ditimbang dan dimasukkan kedalam labu ukur 10 mL kemudian diadkan dengan etanol 80% sampai tanda batas sehingga didapat konsentrasi 1000 µg/mL.
b. Pembuatan Larutan Standar Kuersetin dengan Berbagai Konsentrasi Larutan induk dipipet sebanyak 0,6; 0,8; 1; 1,2; 1,4 mL kedalam labu 10 mL kemudian diadkan dengan etanol 80% hingga tanda batas. Sehingga didapatkaan konsentrasi 60, 80, 100, 120 dan 140 µg/mL.
c. Penentuan Panjang Gelombang Maksimum
Larutan Kursetin 100 µg/mL dipipet 0,5 mL kemudian ditambahkan 1,5 mL etanol P, 0,1 mL aluminium klorida( AlCl3) 10%, 0,1 natrium asetat 1 M dan 2,8 air suling. Setelah itu didiamkan selama 30 menit. Kemudian dilakukan pembacaan panjang gelombang maksimumnya dengan menggunakan spektrofotometri Ultraviolet-Visibel pada panjang gelombang 350- 450 nm.
d. Pembuatan Kurva Kalibrasi
Larutan standar yang sudah disiapkan, dipipet masing masing nya 0,5 mL kedalam labu ukur yang berbeda, kemudian ditambahkan 1,5 mL etanol 95 %, 0,1 mL aluminium klorida 10%, 0,1 natrium asetat 1M dan 2,8 air
43
suling. Setelah itu diamkan selama 30 menit. Kemudian absorban dibaca pada panjang gelombang maksimum yang didapatkan.
e. Penentuan Kadar Senyawa Flavonoid Total dalam Ekstrak
Ekstrak yang menunjukkan hasil positif pada uji kualitatif ditentukan kadar flavonoidnya totalnyaa dengan menggunakan metode kolorimetri.
Masing-masing ekstrak dipipet 5 mL kemudian dimasukkan kedalam labu ukur 25 lalu diadkan dengan pelarut masing masing ekstrak hingga tanda batas sehingga diperoleh konsentrasi 20.000 µg/mL. Setiap ekstrak diambil 0,5 mL kemudian ditambahkan 1,5 mL etanol 95 %, 0.1 mL aluminium klorida 10%, 0,1 natrium asetat 1 M dan 2,8 air suling. Setelah itu diamkan selama 30 menit. Kemudian absorban dibaca pada panjang gelombang maksimum yang didapatkan.
3.3.5.5 Penetapan Kadar Tanin Total (Departemen Kesehatan Repubik Indonesia, 2010)
Larutan pembanding dibuat dengan cara mengeringkan katekin dalam oven pada suhu 105ᵒC sampai bobot tetap. Sebanyak 10 mg ditimbang secara seksama dan dimasukkan kedalam labu ukur 10 mL, dilarutkan dengan etil asetat P, disonikasi selama 5 menit. Larutan dipipet sebanyak 2 mL larutan, dimasukkan kedalam labu erlenmeyer bersumbat kaca 100 mL, ditambahkan 50 mL etil asetat, disonikasi kembali selama 5 menit.
Larutan uji dibuat dengan cara, diambil sebanyak 5 mL ekstrak cair dan dimasukkan kedalam labu ukur 10 mL kemudian dicukupkan dengan etanol 70%
LP hingga tanda batas. Larutan disaring dan filtrat yang didapat diuapkan,
44
dikeringkan pada suhu 105ᵒC sampai bobot tetap. Sisa dilarutkan dengan etil asetat P, dan disonikasi selama 5 menit. Dipipet sebanyak 2 mL larutan , dimasukkan kedalam labu erlenmeyer bersumbatkaca 100 mL, tambahkan 50 mL etil asetat, sonikasi kembali selama 5 menit.
Larutan blangko yang digunakan adalan etil asetat P. Pengukuran dilakukan menggunakan spektrofotometri pada panjang gelombag 279 nm dan 300 nm
Persentase katekin dalam simplisia pada panjang gelombang 279 dengan rumus :
% Kadar Tanin Total=
x 100%
Keterangan : Au = Serapan larutan uji
AP = Serapan larutan pembanding AB = Serapan Larutan blangko Cp = Kadar Larutan Pembanding
V = Volume larutan uji sebelum pengenceran (dalam mL) W = Bobot serbuk (dalam gram)
F = Faktor Pengenceran
45 BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN