METODE PENELITIAN
3.1 Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Penelitian 1 , Laboratorium Farmakognosi dan Fitokimia, Laboratorium Steril Fakultas Kesehatan dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta. Penelitian dimulai pada bulan September 2015 - Juli 2016.
3.2 Alat
Laminar Air Flow, incubator (Memmert), timbangan (Scout Pro), mikroskop cahaya (Shimadzu), autoklaf (Jall American), autoklaf digital (ALP), hot plate (ARE Heating Magnetic Stirrer), vacum rotary evaporator, kertas saring steril, paper disc, micro pipet dan tip, magnetic stirrer, pinset, cawan petri, tabung reaksi, jarum ose, ose bulat, beaker glass, gelas ukur, tabung reaksi, bunsen, glass object, cover glass, kaca arloji, batang pengaduk, batang penyebar kaca segitiga, spatula, labu Erlenmeyer, labu ukur, botol fermentasi dan alat-alat gelas lainnya yang umum digunakan pada Laboratorium Mikrobiologi.
3.3 Bahan 3.3.1 Tanaman
Sample uji tanaman yang digunakan pada penelitian ini adalah daun kayu jawa (Lannea coromandelica) diperoleh dari daerah Watampone, Kabupaten Bone, Sulawesi Selatan. Daun di kemas dalam tempat terpisah dari akar dan batang. Daun dipilih yang masih hijau,belum terdapat cacat dan dikirim dalam satu tangkai utuh agar bisa di variasikan. dikirim sudah dalam kondisi bersih dan dikirim 6 oktober 2015 tiba 8 oktober 2015. Tanaman dideterminasi di Pusat Penelitian Indonesia (LIPI) Kebun Raya Bogor.
3.3.2 Bahan Kimia
Larutan Natrium Hipoklorit (NaOCl) 5,25% (Baycline), Alkohol 70%, Alkohol 96% dan akuades steril, Metanol teknis, n-heksan teknis, Etil asetat teknis.
3.3.3 Media Pertumbuhan Mikroba
Nutrient Agar (NA) (Merck), Potato Dextrose Agar (PDA) (Merck), Mueller Hinton Agar (MHA) (Merck), Dextrose Broth (Merck), Yeast Extract (Merck).
3.3.4 Bahan untuk identifikasi kapang: pewarna Methylen blue 3.3.5 Bakteri Uji
Bakteri yang digunakan :
Staphylococcus aureus ATCC 25923, Escherichia coli ATCC 25922, Helicobacter pylori ATCC 43504, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853.
3.4 Pembuatan Media Pertumbuhan Kapang Endofit 3.4.1 Pembuatan Media PDA
Potato Dextrose Agar 39 g ditimbang dan ditakar 1 liter akuades. Untuk pembuatan media PDA 10% ditimbang Potato Dextrose Agar 2,4; agar 15 gram;
kloramfenikol 0,5 g; akuades 1 L. Panaskan masing-masing campuran bahan hingga homogen. Sterilisasi dengan autoclave selama 15 menit dengan suhu 121°C. Tuang ke dalam cawan petri, masing-masing 15 mL, kemudian dibiarkan media membeku (Atika, 2011).
3.4.2 Media Agar Miring PDA
Ditimbang Potato Dextrose Agar 39 gram, dan ditakar 1 L akuades.
Campuran bahan dipanaskan hingga homogen. Sterilisasi dengan autoclave selama 15 menit dengan suhu 121°C. Masukkan ke dalam tabung masing-masing 10 mL . Letakkan tabung dengan posisi miring ± 45° dan biarkan media membeku (Purwanto,2011).
3.4.3 Pembuatan Media PDY (Potato Dextrose Yeast)
Ditimbang 200 g kentang yang telah dikupas dan dibersihkan, ditambahkan 200 mL akuades, kemudian dipanaskan sampai mendidih. Ekstrak kentang disaring, kemudian ditambahkan Dextrose sebanyak 10 g, Yeast Extract 2 g, dan ditambahkan akuades sampai 1000 mL. Campuran bahan dihomogenkan sambil diaduk sampai mendidih diukur pHnya sampai 6. Medium dimasukkan ke dalam botol fermentasi sebanyak 250 mL, kemudian disterilisasi dengan autoclave selama 15 menit, pada suhu 121°C (Maryanti,2015).
3.5 Isolasi Kapang Endofit 3.5.1 Sterilisasi Permukaan
Bagian daun tanaman Lannea Coromandelica yang masih segar atau yang masih terlihat hijau dipilih. Daun Tanaman dibersihkan hingga terbebas dari pengotor seperti tanah, debu, dan lumut. bagian daun dipotong dengan ukuran 1x1 cm2. Setelah itu, bagian permukaan daun disterilisasi permukaannya.
Mula-mula masing-masing potongan daun uji direndam ke dalam etanol 70% selama 1 menit, lalu di pindahkan potongan daun uji ke dalam larutan NaOCl 5,25% rendam selama 5 menit, terakhir direndam tanaman uji di dalam etanol 70% selama 30 detik dan yang terakhir rendam dengan akuades steril 5 detik.
Daun yang sudah steril kemudiaan dikeringkan diatas kertas saring, kemudiaan daun dipotong menjadi potongan-potongan kecil berukuran ±1,0 cm.
Daun ditanam diatas permukaan media PDA dan kemudiaan diinkubasi pada suhu kamar selama 5 – 21 hari (Rustanti, 2007 ; Purwanto, 2011). Setiap cawan petri dapat ditanam 2 potongan daun. Sebagai kontrol, diinokulasikan akuades bilasan terakhir pada medium PDA. Proses isolasi dilakukan secara triplo dengan variasi bagian daun yang muda, daun sedang, dan daun tua.
3.5.2 Pemurniaan Kapang Endofit
Kapang endofit yang tumbuh pada media isolasi selanjutnya dimurnikan pada cawan petri berisi PDA. Pemurnian dilakukan berdasarkan kenampakan morfologi secara makroskopis yang meliputi warna dan bentuk koloni dan hifa yang tumbuh. Sedikit hifa kapang dipindahkan dengan jarum ose steril ke dalam cawan petri yang berisi PDA, lalu hasil pemurnian tersebut diinkubasi pada suhu
ruang 250C selama 7-14 hari (Rachmayani, 2008). Isolat kapang yang telah murni dipindahkan ke agar miring PDA untuk dijadikan stock culture dan working culture dan disimpan pada suhu 40C (Handayani, 2007)
3.6 Identifikasi Kapang Endofit
Pengamatan morfologi kapang secara makroskopik dilakukan dengan mengamati karakteristik koloni suatu biakan, antara lain meliputi: warna dan struktur permukaan koloni; ada atau tidaknya tetes eksudat; dan ada atau tidaknya lingkatan kosentris. Pengamatan koloni dilakukan sejak awal penanaman hingga beberapa waktu tertentu, dan segala macam perubahan yang terjadi harus dicatat (Gandjar et al., 1999).
Pengamatan secara mikroskopis dilakukan dengan menggunakan metode Slide Culture (Atlas et al., 1984). Tahapan metode Slide Culture yaitu : kertas kering diletakkan pada dasar cawan petri dan diatasnya diletakkan kaca objek dan cover glass, kemudian cawan petri tersebut disterisasi dalam auotoklaf pada suhu 121°C selama 15 menit. Setelah itu, kertas saring dalam cawan Petri dibasahi dengan akuades steril (Kumala,2008). Kaca objek ditetesi medium PDA dan dibiarkan memadat, kemudian isolat kapang endofit diinokulasikan pada medium.
Kaca objek yang telah mengandung medium dan isolat kapang ditutup dengan cover glass. Kapang endofit diinkubasi selama 7 hari pada suhu ruang. Hasil inkubasi diamati di bawah mikroskop pada pembesaran 20 kali, 40 kali dan 100 kali (Atlas et al., 1984 dalam Jauhari, 2010 dengan modifikasi)
Pengamatan pada mikroskopik meliputi hifa berseptum atau tidak, miselium terang atau keruh, miselium berwarna atau tidak berwarna, jenis spora aseksual : sporangiospora, konidia atau arhospora (oidia), ciri kepala pembawa spora : Sporangium (ukuran, warna, bentuk), kepala spora pembawa konidia : tunggal, berantai, pertunasan atau kumpulan, bentuk , penampakan spora aseksual terutama konidia, penampakan sporangiofora atau konidiofora : sederhana atau bercabang, jika bercabang bentuk percabangan, ukuran dan bentuk kulumela pada ujung sporangiofora, konidiofora tunggal atau bergrombol (Waluyo,2007).
3.7 Fermentasi
Hasil metabolit sekunder yang dihasilkan oleh kapang endofit dapat diperoleh melalui suatu proses fermentasi. Koloni kapang endofit yang telah dikultur dalam medium PDA selama 7 hari, diambil menggunakan sedotan steril berdiameter 6 mm empat potongan, bulatan agar yang mengandung isolat kapang endofit dipindahkan menggunakan jarum ose dimasukkan ke dalam 250 mL media PDY cair. Kemudian kultur tersebut diinkubasi pada suhu kamar selama 21 hari dengan kultur diam (statis) (Phongpaichit et al., 2006) (Kumala et al.,2006 dengan modifikasi).
3.8 Ekstraksi Hasil Fermentasi
Koloni kapang yang diperoleh dari proses fermentasi dibagi menjadi 2 bagian. Bagian pertama, biomassa dihaluskan dengan lumpang dan alu kemudian ditambahkan pelarut metanol ke dalam biomassa kemudiaan diamkan dalam tempat gelap selama 48 jam, kemudian saring dan ambil filtrat kemudian dipekatkan dengan vacum rotary evaporator hasilnya adalah ekstrak kental fraksi metanol digunakan sebagai ekstrak uji 1. Bagian kedua medium air pertumbuhan yang diperoleh dari fermentasi kapang diekstraksi dengan cara partisi dengan n- heksan dan etil asetat yang kemudiaan juga dipekatkan dengan vacum rotary evaporator hasilnya adalah ekstrak pekat yang digunakan sebagai uji 2 dan 3, dan bagian medium fermentasinya diuji sebagai uji 4 sebagai uji fraksi airnya.
Tujuan ekstraksi dibagi menjadi 2 antara biomassa dan medium pertumbuhannya adalah pada biomassa diharapkan eksudat di dalam sel keluar dengan cara pengahalusan sehingga metabolit sekundernya keluar dari selnya sedangkan ekstraksi dengan cara partisi pada medium fermentasi bertujuan untuk menarik eksudat yang keluar dan jatuh kedalam medium fermentasi selama proses fermentasi.
3.9 Identifikasi Bakteri Uji
Identifikasi bakteri uji dilakukan secara makroskopik dan mikroskopik pada bakteri uji yang berusia 18-24 jam. Identifikasi makroskopik dilakukan dengan mengamati morfologi dan pertumbuhan koloni. Bakteri uji diambil satu ose diletakkan diatas kaca objek yang telah ditetesi sedikit NaCl 0,9%. Bakteri
disebar pada kaca objek dengan menggunakan ose bulat kemudian difiksasi dengan cara dilewatkan di atas api. Larutan kristal violet diteteskan di atas preparat dan dibiarkan selama 1 menit, kemudian preparat dicuci dengan air mengalir. Preparat kemudian ditetesi cairan lugol dan dibiarkan selama 45-60 detik, kemudian dicuci dengan air mengalir. Preparat dicuci lagi dengan etanol 96% dan digoyang-goyangkan selama 30 detik. Setelah itu safranin diteteskan di atas preparat dan dibiarkan selama 1-2 menit. Preparat dicuci dengan air dan dikeringkan dengan tisu. Amati di bawah mikroskop dengan perbesaran 100x, 200x, dan 400x (Rachmayani, 2008).
3.10 Uji Aktivitas Antibakteri 3.10.1 Medium Nutrient Agar (NA)
Medium yang digunakan untuk peremajaan bakteri adalah nutrient agar (NA). NA dibuat berdasarkan aturan pakai yang tertera pada kemasan (Merck).Serbuk NA sebanyak 10 gram dilarutkan dalam 500 mL aquadest dan dipanaskan hingga mendidih dan agar tercampur rata. Kemudian disterilkan menggunakan autoklaf pada suhu 121°C selamat 15 menit. Setelah disterilisasi medium dapat digunakan dan disimpan di lemari pendingin.
3.10.2 Mueller Hinton Agar (MHA)
Ditimbang sebanyak 37 g bubuk Mueller Hinton Agar (MHA), ditambahkan 1000 mL aquades, kemudian dihomogenkan dengan menggunakan magnetik stirer dan dipanaskan di atas hot plate. Medium disterilisasi dalam autoklaf pada suhu 121°C selama 15 menit (Suciatmih, 2008).
3.10.3 Peremajaan Bakteri Uji
Peremajaan terhadap bakteri S.aureus,E.coli, H.pylori , dan P.aeruginosa.
dapat menggunakan medium nutrient agar (NA). Medium NA steril dituangkan ke dalam tabung reaksi sebanyak ± 5 mL. Medium NA didinginkan pada suhu ruang dengan posisi miring hingga memadat. Diambil satu ose bakteri uji dari stok kultur, dioleskan secara zig-zag pada media NA miring dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37°C (Leboffe,Michael J. and Burton E. Pierce, 2010).
3.10.4 Pembuatan Suspensi Bakteri
Bakteri dibiakan dengan cara di inkubasi dengan nutrien agar miring selama 24 jam pada suhu 37°C, kemudian diambil dengan ose dan disuspensikan dengan cara dimasukan kedalam tabung berisi 3 mL NaCl fisiologis 0,9% lalu divortex sampai homogen dan dilihat kekeruhannya yang menandai bahwa ada pertumbuhan bakteri, kekeruhan disetarakan dengan Mc. Farland no. III yaitu setara dengan 109 sel bakteri/mL. Kemudian diencerkan dengan NaCl fisiologis 0,9% steril sampai diperoleh konsentrasi 106 sel bakteri/mL (Kuete,2011).
Penggunaan konsentrasi 106 sel bakteri/mL pada suspensi bakteri berdasarkan kerentanan anaerobik yaitu 106 – 104 (pokyni,2010).
3.10.5 Pembuatan Larutan Uji
Larutan uji ekstrak n-heksan, etil asetat dan metanol kapang endofit dari daun kayu jawa (Lannea Coromandelica), dibuat dengan cara menimbang ekstrak n-heksan, etil asetat dan metanol dan dilarutkan dalam pelarutnya masing-masing.
3.11 Uji Aktivitas Antibakteri dengan menggunakan difusi cakram
Uji aktivitas antibakteri dilakukan dalam LAF dengan metode difusi cakram dalam kondisi aseptis. Larutan uji yaitu ekstrak isolat kapang diserapkan sebanyak 20 μL pada kertas cakram steril dengan konsentrasi 1000 µg/ml.
Cakram yang sudah diresapi larutan uji diletakkan pada permukaan medium uji.
Kontrol positif yang digunakan pada uji aktivitas antibakteri yaitu menggunakan cakram kloramfenikol 30 µg. Kontrol negatif yang digunakan yaitu masing- masing pelarutnya. Bakteri uji diinkubasi selama 18-24 jam pada suhu 35°C, Suspensi bakteri uji dimasukan kedalam cawan petri secara aseptis kemudian ditambahkan medium agar MHA yang telah disterilkan sebanyak 10 ml kemudian cawan petri digoyangkan perlahan untuk memperoleh suspensi bakteri yang tersebar merata pada medium MHA (Rachmayani, 2008).
3.12 Pengamatan dan Pengukuran Zona Hambat
Cawan petri diinkubasi dalam inkubator pada suhu 37°C selama 24 jam.
Zona hambat antibakteri diamati berdasarkan diameter hambat yang ditunjukkan dengan daerah bening yang terbentuk di sekeliling kertas cakram dan diukur dengan menggunakan jangka sorong. Lalu hasil pengukuran dicatat. Pengujian aktivitas antibakteri dilakukan duplo. Pengamatan dilakukan setelah 24 jam masa inkubasi. Daerah bening merupakan petunjuk kepekaan bakteri terhadap antibiotik atau bahan antibakteri lainnya yang digunakan sebagai bahan uji yang dinyatakan dengan lebar diameter zona hambat (zona bening) (Vandepitte et al., 2005).
Kemudian diameter zona hambat tersebut dikategorikan kekuatan daya antibakterinya berdasarkan penggolongan Davis and Stout (1971)
Menurut Davis and Stout (1971), kriteria kekuatan daya antibakteri sebagai berikut : diameter zona hambat 5 mm atau kurang dikategorikan lemah, zona hambat 5-10 mm dikategorikan sedang, zona hambat 10-20 mm.
3.13. Penapisan Fitokimia Daun Kayu Jawa dan Ekstrak Kapang Endofit Yang Berpotensi
Analisis fitokimia merupakan analisis kualitatif yang dilakukan untuk mengetahui komponen bioaktif yang terkandung dalam daun kayu jawa dan membandingkannya dengan ekstrak yang berpotensi sebagai antibakteri dari ekstrak isolat daun kayu. Tujuan dilakukannya skrining fitokimia ini adalah untuk melihat apakah senyawa metabolit sekunder yang dikandung oleh tanaman induknya akan sama dengan kandungan metabolit sekunder yang terdapat pada kapang endofitnya, Analisis fitokimia yang dilakukan meliputi uji alkaloid, saponin, terpenoid dan steroid, flavonoid, tanin dan polifenol.
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
Penelitian ini dilakukan untuk mengetahui aktivitas antibakteri ekstrak isolat kapang endofit terhadap beberapa bakteri patogen. Sampel tanaman yang digunakan adalah daun Kayu jawa yang diperoleh dari diperoleh dari daerah Watampone, Kabupaten Bone, Sulawesi Selatan. Tanaman ini telah banyak digunakan secara tradisional untuk mengobati berbagai penyakit. Menurut Strobel, & Daisy (2003), salah satu kriteria tanaman yang dapat dipilih untuk menghasilkan kapang endofit adalah tanaman yang memiliki sejarah etnobotani seperti digunakan dalam pengobatan tradisional. Secara empiris, daun Kayu jawa digunakan untuk mengobati penyakit diare, muntah, tukak peptik, dan luka bakar (Beknal et al., 2010).
Secara garis besar penelitian ini terbagi menjadi beberapa tahap, yaitu tahap isolasi dan pemurnian kapang endofit dari sampel tanaman, tahap karakterisasi isolat kapang endofit, tahap fermentasi kapang endofit, tahap ekstraksi senyawa metabolit sekunder kapang endofit, dan pengujian aktivitas antibakteri dari ekstrak hasil fermentasi kapang endofit.
4.1 Determinasi Tanaman
Tanaman kayu jawa Lannea coromandelica (Houtt.)Merr. yang digunakan dalam penelitian ini diambil dari Bone-Sulawesi selatan dan telah dilakukan determinasi di Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI) Pusat Konservasi Tumbuhan Kebun Raya Bogor. Hasil determinasi menunjukan bahwa sampel tanaman yang digunakan adalah Lannea coromandelica (Houtt) Merr., suku Anacardiacceae. Hasil determinasi tanaman kayu jawa dapat dilihat pada lampiran 2 halaman 47.
4.2 Penyiapan Sampel
Sampel daun dikemas dalam tempat terpisah dari akar dan batang. Daun dipilih yang masih hijau, belum terdapat cacat dan dikirim dalam satu tangkai utuh agar bisa divariasikan. dikirim sudah dalam kondisi bersih pada tanggal 6 oktober 2015 tiba 8 oktober 2015.
Daun tersebut diambil dari berbagai bagian yang berbeda, yaitu: daun bagian atas yang terdapat di bawah daun pucuk, daun bagian tengah, dan daun bagian bawah dekat dengan percabangan batang. Perbedaan bagian dalam pengambilan sampel ini bertujuan agar kapang endofit yang dihasilkan lebih banyak dan memberikan hasil yang beraneka ragam. Sampel selanjutnya dibersihkan dari debu, tanah, dan pengotor-pengotor lain dengan menggunakan air bersih mengalir lalu permukaan daun dilakukan sterilisasi permukaan.
Gambar 2. Sampel daun Lannea Coromandelica a. Bagian tua daun (DT)
b. Bagian muda daun (DM) c. Bagian pucuk daun (DA)
a
b C
4.3 Isolasi dan Pemurnian Kapang Endofit
Isolasi kapang endofit diawali dengan proses sterilisasi permukaan. Proses ini dilakukan untuk menghilangkan mikroorganisme yang berada pada permukaan tanaman sehingga koloni yang tumbuh pada media isolasi merupakan koloni endofit (Strobel, & Daisy, 2003). Daun bagian pucuk, muda dan tua kemudian dicuci dibawah air mengalir selama 10 menit. Tujuan pencucian dengan air mengalir adalah untuk menghilangkan debu dan kotoran yang menempel pada permukaan daun (Hafsari dan Asterina, 2013). Masing-masing daun kemudian direndam ke dalam etanol 70% selama 1 menit, larutan NaOCl 5,25% selama 5 menit, etanol 70% selama 30 detik dan terakhir dibilas dengan akuades steril selama 3-5 detik. Proses sterilisasi permukaan menggunakan etanol 70% dan larutan NaOCl 5,25% sebagai desinfektan. Etanol dan natrium hipoklorit yang digunakan memiliki aktivitas yang berbeda. Etanol mendenaturasikan protein dengan mendehidrasi dan menginaktifkan enzim (Rutala et al, 2008). Efek bakterisida dari etanol 70% lebih baik dibandingkan etanol murni, karena protein didenaturasi lebih cepat dengan adanya air (Rutala et al., 2008). Natrium hipoklorit merupakan senyawa yang mengandung klorin yang bekerja dengan mengoksidasi secara irreversible gugus sulfihidril pada enzim dan menganggu fungsi metabolik dari sel bakteri (Valera, 2008; Rutala et al., 2008). Pembilasan dengan aquades steril dilakukan untuk membersihkan mikroorganisme yang mati oleh desinfektan (Hafsari dan Asterina, 2013) dan untuk menghilangkan sisa etanol dan natrium hipoklorit yang masih menempel pada daun yang dapat mengganggu pertumbuhan kapang (Kumala, 2014). Aquades bilasan terakhir ini digunakan sebagai kontrol untuk mengetahui dan menentukan apakah kapang yang tumbuh merupakan kapang endofit atau bukan. Jika pada media kontrol terdapat pertumbuhan kapang, maka kapang yang tumbuh dari isolasi daun bukanlah kapang endofit. Media yang digunakan untuk isolasi dan pemurnian kapang endofit adalah media PDA (Potato Dextrose Agar). Media ini bersifat selektif terhadap kapang dan mengandung kentang sebagai sumber karbohidrat yang merupakan sumber nutrisi bagi pertumbuhan kapang (Ariyono et al , 2014).
Daun kayu jawa diisolasi dari tiga variasi daun yaitu daun pucuk, daun muda dan daun tua dengan media potato dextrose agar. Tujuannya dilakukan variasi adalah agar mendapatkan kapang endofit yang beranekaragam
Tabel 1 Hasil Isolasi dari Variasi Daun Kayu Jawa Isolasi Daun Tua (DT)
Isolasi Daun Pucuk (DA)
DA1 DA2 DA3
Isolasi daun Muda (DM)
DM1 DM2 DM3
Hasil isolasi menunjukan dari ketiga variasi daun pada daun tua tidak ada kapang endofit yang tumbuh, akan tetapi melihat ciri-ciri secara makroskopik yang tumbuh pada isolasi daun tua adalah khamir, karena pada isolasi menggunakan media PDA sangat dimungkinkan tumbuh kapang dan khamir. Pada daun pucuk dan daun muda tumbuh kapang dilihat dari bentuk dan ciri-ciri secara makroskopik dan mikroskopik, kemudian dilakukan proses pemurnian dimana kapang endofit dari daun muda dan pucuk yang sama secara makroskopik dan mikroskopik dianggap satu jenis.
Tabel 2. Hasil Pemurnian Kapang Endofit Daun Kayu Jawa
Sampel Bagian Daun Jumlah Isolat Kode Isolat
Daun Lannea coromandelica
Houtt.(Merr.)
Daun dekat dengan percabangan batang
[Daun Tua] (DT) - - Daun bagian tengah/
Daun Muda (DM) 2
DM1K DM2K Daun bagian atas atau
pucuk daun (DA) 2
DA2K DA3K
Pemurniaan dilakukan berdasarkan morfologi kapang secara mikroskopik dan makroskopik (Ariyono, 2014). Setiap bentuk, warna, dan karakteristik yang berbeda dari kapang, ditumbukan dalam satu cawan. Pemurnian dilakukan berulang kali sehingga diperoleh satu isolat kapang murni.
Hasil dari pemurniaan ditanaman kembali dalam media PDA miring sebagai stok kultur dan kultur kerja. Stok kultur digunakan sebagai persediaan yang dapat diremajakan kembali yang diimpan dalam lemari pendingin, sedangkan stok kerja digunakan untuk kelanjutan pekerjaan. Dari dua kali proses isolasi dan pemurniaan didapatkan 4 isolat kapang endofit, tabel 2 menunjukan bahwa kapang endofit dari daun kayu jawa ditemukan pada bagian pucuk dan daun muda.
4.4 Karakterisasi Isolat Kapang Endofit
Karakterisasi kapang endofit dilakukan terhadap 4 isolat yang diperoleh, pengamatan karakteristik makroskopik yang dilakukan dengan mengamati warna koloni, warna sebalik, permukaan koloni (granular, seperti tepung, menggunung, licin ada atau tidak tetes eksudat), diameter pertumbuhan koloni kapang dan lingkaran-lingkaran konsentris (Kumala, 2014). Sedangkan pengamatan karakteristik secara mikroskopik meliputi ada atau tidaknya sekat pada hifa, pertumbuhan hifa (bercabang atau tidak bercabang), ada tidaknya konidia, dan bentuk konidia (Ariyono,2014). Diperoleh 4 isolat, yaitu isolat DA2K, DA3K,
DM1K, DM2K. .
4.4.1 Isolat DA2K
Permukaan koloni kapang abu-abu tua dan bagian pinggir berwarna putih permukaan kapang bergelombang tidak rata, dan dengan diameter 7,5 cm pada pertumbuhan hari ke 12.Warna sebaliknya dari kapang ini yaitu hitam dan bagian pinggir berwarna putih. Secara mikroskopik koloni kapang ini memiliki hifa yang bersekat dan pertumbuhan hifa pada kapang ini bercabang dan memiliki konidia bentuk bulat.
(a) (b)
(c)
Gambar 3. Isolat DA2K secara makroskopik dan mikroskopik (a) Isolat DA2K umur 12 hari tampak depan
(b) Isolat DA2K umur 12 hari tampak sebalik
(c) Pengamatan pada mikroskop cahaya perbesaran 1000x
4.4.2 Isolat DA3K
Permukaan koloni kapang coklat tua agak kehitaman dan bagian pinggir berwarna hitam permukaan kapang rata atau tidak bergelombang dan dengan diameter 5,5 cm pada hari ke 12. Warna sebaliknya dari kapang ini yaitu hitam dan bagian pinggir berwarna hitam. Secara mikroskopis koloni kapang ini memiliki hifa yang bersekat dan pertumbuhan hifa pada kapang ini bercabang dan tidak memiliki konidia.
(a) (b)
(c)
Gambar 2. Isolat DA3K secara makroskopik dan mikroskopik (a) Isolat DA3K umur 12 hari tampak depan
(b) Isolat DA3K umur 12 hari tampak sebalik
(c) Pengamatan pada mikroskop cahaya perbesaran 1000x
4.4.3 Isolat DM1K
Permukaan koloni kapang coklat tua agak kehitaman dan bagian pinggir berwarna hijau tua permukaan kapang pinggir kapang bergelombang dan dengan diameter 8 cm pada hari ke 12. Warna sebaliknya dari kapang ini yaitu hitam dan bagian pinggir berwarna hitam. Secara mikroskopis koloni kapang ini memiliki hifa yang bersekat dan pertumbuhan hifa pada kapang ini bercabang dan memiliki konidia
(a) (b)
(c)
Gambar 5. Isolat DM1K secara makroskopik dan mikroskopik (a) Isolat DM1K umur 12 hari tampak depan
(b) Isolat DM1K umur 12 hari tampak sebalik
(c) Pengamatan pada mikroskop cahaya perbesaran 1000x