BAB III. PELAKSANAAN PENELITIAN
IV. HASIL DAN PEMBAHASAN
4.2 Pembahasan
Penelitian ini menguji pengaruh pemberian kombinasi FGF (Fibroblast Growth Factor) dengan ekstrak etanol buah mengkudu (Morinda citrifolia L.) dan ekstrak etanol buah okra (Abelmoschus esculentus (L.) Moench), terhadap kadar glukosa darah mencit putih jantan yang diinduksi aloksan.
Penelitian ini menggunakan FGF dari penelitian Grace Kisty et al (2019) dan ekstrak etanol buah mengkudu yang diperoleh dari penelitian Rahmawati (2019) sebelumnya. Buah mengkudu diperoleh dari Pekanbaru, Riau dan buah okra diperoleh oleh peneliti dari Balai Benih Induk Holtikultura, Lubuk Minturun, Padang. Sumatera Barat yang diidentifikasi di Herbarium Universitas Andalas. Identifikasi bertujuan untuk memperoleh identitas sampel untuk menghindari kesalahan dalam pengumpulan bahan dan menghindari tercampurnya bahan dengan tanaman lain. Dari hasil identifikasi yang telah dilakukan, diperoleh hasil bahwa sampel buah mengkudu termasuk spesies Morinda Citrifolia L. dari famili Rubiaceae dan sampel buah okra termasuk spesies Abelmoschus esculentus (L.) Moench dari famili Malvaceae (Lampiran 1, Gambar 7).
Ekstrak kental etanol buah mengkudu yang dilakukan oleh Rahmawati (2019) dengan berat 92,5 gram memperoleh rendemen 26,68 % yang secara teoritis dalam buku Farmakope Herbal Indonesia edisi 1 tahun 2008 rendemen ekstrak tidak kurang dari 10,9%, ini menunjukan mutu ekstrak etanol buah mengkudu baik sedangkan ekstrak kental buah okra dengan berat 40.86 gram memperoleh rendemen 7.86 % (Lampiran 5, Tabel 2) dan jika dibandingkan dengan hasil penelitian Putri (2017) dengan ekstrak kental buah okra 40 gram
45 memperoleh rendemen 8%. Perbedaan ini mungkin dihasilkan karena perbedaan sumber buah okra yang digunakan.
Ekstrak kental etanol yang diperoleh dikarakterisasi untuk melihat mutu dari ekstrak. Ekstrak kental etanol buah mengkudu yang dilakukan oleh Rahmawati (2019) adalah berwarna kecokelatan, rasa getir, dan bau khas, hasil pemeriksaan ekstrak etanol buah mengkudu sesuai dengan yang tercantum pada Farmakope Herbal Indonesia (Depkes RI, 2008). Mengkudu mempunyai bau khas yang akan semakin kuat seiring matangnya buah. Bau tersebut disebabkan kandungan asam butirat yang meningkat (McClatchey, 2002). Bau khas buah mengkudu tersebut sama ketika mengkudu dalam bentuk simplisia maupun ekstrak kental. Sedangkan ekstrak etanol buah okra memiliki warna hijau kehitaman, bentuk kental, bau khas dan rasa pahit (Lampiran 5, Tabel 3), hasil pemeriksaan ekstrak etanol buah okra yang didapat sesuai dengan yang telah diteliti oleh Cahyaningrum et al (2018) bahwa ekstrak etanol 96% buah okra berbentuk kental, warna hijau kehitaman, bau khas dan rasa pahit.
Berdasarkan hasil skrining fitokimia dapat diketahui golongan senyawa metabolit sekunder yang terdapat didalam ekstrak etanol buah mengkudu yang telah dilakukan oleh Rahmawati (2019) mengandung flavonoid, steroid, fenolik dan saponin yang jika dibandingkan dengan penelitian Sudewi dan Lolo (2016) bahwa ekstrak etanol 96% buah mengkudu juga mengandung flavonoid, steroid, saponin dan alkaloid. Sedangkan hasil skrining fitokimia ekstrak etanol buah okra yang didapat adalah flavonoid, terpenoid, steroid, dan fenolik (Lampiran 5, Tabel 4) dan serupa dengan penelitian yang telah dilakukan oleh Reine et al (2018) yang juga menemukan flavonoid, sterol, dan terpen sebagai metabolit sekunder
46 pada buah okra.
Menurut Huliselan et al (2015) tumbuhan mengandung metabolit sekunder yang dapat berpotensi sebagai antioksidan, diantaranya adalah alkaloid, flavonoid, fenol, steroid, dan terpenoid. Senyawa antioksidan sintetik maupun alami (dari berbagai tanaman) mampu mengontrol kadar glukosa darah dan mencegah komplikasi diabetes. Senyawa aktif golongan polifenol pada tanaman mempunyai aktivitas antioksidan dan hipoglisemik (Widowati, 2008). Serta terpenoid seperti triterpenoid dapat meningkatkan penyerapan glukosa dengan bertindak meniru kerja insulin dan sebagai insulin sensitizer (Lee and Thuong, 2010).
Pengujian kadar abu ekstrak etanol buah mengkudu yang telah dilakukan oleh Rahmawati (2019) didapatkan persentase 0,81 % dan dari hasil kadar abu yang diperoleh sesuai dengan standar yang tertera pada Farmakope Herbal Indonesia edisi 1 tahun 2008 tidak lebih dari 0,8 % sedangkan hasil kadar abu ekstrak etanol buah okra yang didapatkan adalah 6.02 % (Lampiran 5, Tabel 5).
Pengukuran kadar abu menunjukkan total mineral dalam suatu bahan pangan.
Bahan-bahan organik dalam proses pembakaran akan terbakar tetapi komponen anorganiknya tidak (Zahro, 2013).
Pengujian susut pengeringan ekstrak etanol buah mengkudu yang diperoleh adalah 8,24% (Lampiran 5, Tabel 6) dan jika dibandingkan dengan penelitian Sogandi dan Nilasari (2019) susut pengeringan ekstrak etanol 96%
yang diperoleh adalah 8,93% dan ekstrak etanol buah okra adalah 4,51%
(Lampiran 5, Tabel 7). Penetapan susut pengeringan menggambarkan persentase senyawa yang menghilang selama proses pemanasan (tidak hanya
47 menggambarkan air yang hilang, tetapi juga senyawa menguap lain yang hilang (Handayani, et al 2017).
Hewan percobaan sebelum dilakukan perlakuan diaklimatisasi terlebih dahulu selama 7 hari agar diperoleh hewan percobaan yang sehat dan selama aklimatisasi berat badannya tidak berubah lebih dari 10%. Setelah semua mencit diaklimatisasi dan dilakukan penginduksian dengan aloksan kecuali kelompok normal, mencit putih jantan (mus musculus) sebanyak 60 ekor dikelompokkan menjadi 6 kelompok, tiap kelompok terdiri dari 10 ekor mencit.
Pada penelitian ini, dilakukan pemberian sediaan uji kombinasi FGF 800 mg/kg BB dan ekstrak etanol buah mengkudu 1000 mg/kg BB dengan 3 variasi dosis ekstrak etanol buah okra (500; 700; 1000) mg/kg BB dan dosis IV (FGF 800 mg/kg BB). Pengukuran kadar glukosa darah dilakukan sebanyak 5 kali, yakni pengukuran kadar glukosa darah sebelum diinduksi sebagai tolak ukur kadar glukosa darah normal, dan setelah diinduksi untuk melihat keberhasilan induksi dan sebagai tolak ukur kadar glukosa hiperglikemi, sedangkan pada hari ke-7, 14, dan 21 setelah pemberian sediaan uji bertujuan untuk melihat pengaruh lamanya pemberian kombinasi ekstrak etanol buah mengkudu dan ekstrak etanol buah okra dengan FGF (diberikan tiap hari secara peroral) terhadap kadar glukosa darah mencit selama rentang 7 hari. Alat yang digunakan untuk mengukur kadar glukosa darah adalah glukometer menggunakan glucose test strips dengan cara menusukkan jarum pada ekor mencit tetesan darah pertama dibuang kemudian tetesan darah selanjutnya diteteskan pada glukometer strip lalu dimasukkan dalam glukometer dan dibaca kadarnya.
48 Aloksan digunakan sebagai zat diabetogenik yang diberikan secara intraperitonial dengan dosis sebesar 150 mg/kg BB. Serbuk aloksan dilarutkan dalam aqua pro injeksi dingin. Aloksan ini dipilih karena dapat meningkatkan pelepasan insulin dan protein dari sel beta pankreas tetapi tidak berpengaruh pada sekresi glukagon, efek ini spesifik untuk sel beta pankreas sehingga aloksan dengan konsentrasi tinggi tidak berpengaruh pada jaringan lain (Watkins 2008).
Proses awal yang terjadi adalah proses reduksi aloksan di dalam sel β Langerhans, proses reduksi tersebut menghasilkan asam dialurat yang mengalami reoksidasi menjadi aloksan sehingga saling bereaksi membentuk oksigen reaktif yang dapat merusak DNA sel β Langerhans pankreas. Kerusakan sel β pancreas tersebut menyebabkan produksi insulin menurun atau berhenti sehingga terjadi keadaan hiperglikemia (Nugroho, 2006).
Sebelum seluruh mencit (kecuali kelompok normal) diinduksi dengan aloksan, mencit terlebih dahulu dipuasakan selama 10-12 jam dan setelah ittu dilakukan penimbangan berat badan dan pengukuran kadar glukosa darah. Mencit dipuasakan karena aloksan dan glukosa akan berkompetisi masuk ke dalam sel β pankreas, sehingga dapat meminimalkan jumlah glukosa dalam darah mencit (Radenkovi et al., 2015). Alasan dilakukan penimbangan berat badan dilakukan sebagai tolak ukur dalam volume penyuntikan aloksan dan pengukuran kadar glukosa darah sebagai tolak ukur kadar glukosa darah mencit normal sebelum dilakukan perlakuan.
Aloksan dapat diberikan secara intravena, intraperitoneal, atau subkutan pada binatang percobaan (Szkudelski, 2001). Dalam penelitian ini peneliti menggunakan rute intraperitoneal. Hal ini dikarenakan lebih mudah dikerjakan
49 dan menurut Turner et a.l, (2011) mencit memiliki luas permukaan rongga perut yang besar, pemberian cara intraperitoneal paling sering dilakukan serta kecepatan absorbsinya tergolong tinggi dibandingkan rute pemberian obat intravena. Dan menurut Suckow et al., (2000) kelemahan rute subkutan memiliki bioavailabilitas lebih rendah dibandingkan injeksi intraperitoneal.
Pada penelitian ini Na-CMC 0.5% digunakan sebagai kontrol normal, kontrol negatif dan sebagai suspending agent. Hal ini dimaksudkan untuk membandingkan ada tidaknya efek hiperglikemia terhadap kontrol negatif oleh aloksan dan ada tidaknya efek antihiperglikemia dari FGF, ekstrak etanol buah mengkudu dan ekstrak etanol buah okra pada mencit.
Gambar 5. Diagram rata-rata kadar glukosa darah mencit selama pengamatan
Keterangan :
Dosis I :FGF 800 mg/kg BB dengan ekstrak etanol buah mengkudu 1000 mg/kg BB dan ekstrak etanol buah okra 500 mg/kg BB
Dosis II : FGF 800 mg/kg BB dengan ekstrak etanol buah mengkudu 1000 mg/kg BB dan ekstrak etanol buah okra 700 mg/kg BB Dosis III : FGF 800 mg/kg BB dengan ekstrak etanol buah mengkudu
1000 mg/kg BB dan ekstrak etanol buah okra 1000 mg/kg BB Dosis IV : FGF 800 mg/kg BB
50 Berdasarkan diagram diatas rata-rata kadar glukosa darah sebelum diinduksi dengan aloksan menunjukkan kadar glukosa darah yang hampir sama antar kelompok perlakuan, hal ini dikarenakan belum terjadi kerusakan pada sel β pankreas oleh aloksan, sedangkan rata-rata kadar glukosa darah setelah diinduksi dengan aloksan (kecuali kontrol normal) mengalami kenaikan jika dibandingkan dengan kadar glukosa darah kontrol normal. Hal ini menunjukkan bahwa induksi aloksan dapat meningkatkan kadar glukosa darah mencit. Sedangkan pada kontrol normal yang merupakan acuan kadar glukosa darah normal menunjukan bahwa rata-rata kadar glukosa darah stabil pada rentang kadar normal. Setelah 2-4 jam penginduksian aloksan mencit diberikan minum glukosa 15% untuk mempertahankan keadaan hiperglikemia pada mencit.
Pengamatan kadar glukosa darah pada kelompok normal (tanpa diinduksi aloksan) yang hanya diberikan Na-CMC 0,5% didapatkan rata-rata kadar glukosa darah pada hari ke-7; 14; 21 setelah pemberian sediaan uji masih dalam batas rentang normal.
Pengamatan kadar glukosa darah mencit setelah diberi sediaan uji menunjukan penurunan kadar glukosa darah dari hari ke-7 sampai hari ke-21.
Kadar glukosa darah mencit saat pemberian sediaan uji dosis I (kombinasi FGF 800 mg/kgBB dengan ekstrak etanol buah mengkudu 1000 mg/kgBB dan ekstrak etanol buah okra 500 mg/kgBB ), dosis II (kombinasi FGF 800 mg/kgBB dengan ekstrak etanol buah mengkudu 1000 mg/kgBB dan ekstrak etanol buah okra 700 mg/kgBB), dosis III (kombinasi FGF 800 mg/kgBB dengan ekstrak etanol buah mengkudu 1000 mg/kgBB dan ekstrak etanol buah okra 1000 mg/kgBB), menunjukan hasil semakin tinggi dosis maka semakin tinggi penurunan kadar
51 glukosa darah mencit. Sedangkan dosis IV (FGF800 mg/kgBB) menunjukan hasil penurunan kadar glukosa darah yang paling rendah, hal ini dikarenakan dosis I, dosis II, dan dosis III terdapat senyawa aktif pada ekstrak etanol buah mengkudu dan ekstrak etanol buah okra yang dapat bekerja sinergis dengan FGF terhadap penurunan kadar glukosa darah.
Rata-rata kadar glukosa darah kelompok III (dosis I) yang diberikan kombinasi FGF 800 mg/kgBB dengan ekstrak etanol buah mengkudu 1000 mg/kgBB dan ekstrak etanol buah okra 500 mg/kgBB pada hari ke-7 mampu menurunkan kadar glukosa darah namun belum mencapai kadar glukosa darah normal. Rata-rata kadar glukosa darah pada hari ke-21 sudah mencapai rata-rata kadar glukosa darah normal yaitu 102.8 mg/dl.
Rata-rata kadar glukosa darah kelompok IV (dosis II) yang diberikan kombinasi FGF 800 mg/kgBB dengan ekstrak etanol buah mengkudu 1000 mg/kgBB dan ekstrak etanol buah okra 700 mg/kgBB pada hari ke-7 mampu menurunkan kadar glukosa darah namun belum mencapai kadar glukosa darah normal. Rata-rata kadar glukosa darah pada hari ke-21 mampu menurunkan lebih rendah dari rata-rata kadar glukosa darah normal yaitu 96.8 mg/dl.
Rata-rata kadar glukosa darah kelompok V (dosis III) yang diberikan kombinasi FGF 800 mg/kgBB dengan ekstrak etanol buah mengkudu 1000 mg/kgBB dan ekstrak etanol buah okra 1000 mg/kgBB pada hari ke-14 sudah mampu menurunkan sampai kadar glukosa darah normal yaitu 98,4 mg/dl.
Rata-rata kadar glukosa darah kelompok VI (dosis IV) yang hanya diberikan FGF 800 mg/kg BB juga mengalami penurunan kadar glukosa darah
52 pada hari ke-7; 14; 21 namun belum mampu mencapai kadar glukosa darah normal jika dibandingkan dengan kontrol normal.
Pengamatan kadar glukosa darah yang telah diperoleh dilakukan uji statistik dengan uji two way ANOVA yang kemudian dilanjutkan dengan uji duncan untuk menunjukkan adanya perbedaan kadar glukosa darah antar perlakuan dan melihat dosis yang terbaik.
Berdasarkan hasil analisa statistik dengan uji two way anova didapatkan nilai signifikansi sebesar 0,000 (p<0,05), artinya dapat disimpulkan bahwa terdapat pengaruh lamanya waktu pengamatan serta variasi dosis selama pemberian FGF, ekstrak etanol buah mengkudu dan ekstrak etanol buah okra terhadap penurunan kadar glukosa darah (Lampiran 6, Tabel 10 ) dan dilakukan uji lanjutan uji duncan untuk membandingkan beda rata-rata keenam kelompok perlakuan dan mengetahui adakah pasangan yang berbeda signifikan dari rata- rata pasangan yang lain.
Dari hasil uji lanjutan duncan terlihat bahwa kontrol negatif yang mengalami hiperglikemia dengan signifikansi yang berbeda nyata dengan semua kelompok, akan tetapi kelompok dosis III signifikansinya sama dengan kelompok normal dan kelompok dosis II signifikansinya juga sama dengan kelompok dosis I (Lampiran 6, Tabel 11).
53 Gambar 6. Diagram batang persentase penurunan kadar glukosa darah
Diagram diatas menunjukan persentase penurunan kadar glukosa darah yang dapat menggambarkan potensi sediaan uji dalam menurunkan kadar glukosa darah. Semakin tinggi persentase penurunan kadar glukosa darah maka semakin berpotensi pula sediaan uji tersebut dalam menurunkan kadar glukosa darah.
Berdasarkan persentase penurunan kadar glukosa darah dapat dilihat bahwa semakin lama pemberian sediaan uji pada masing-masing kelompok perlakuan mengalami kenaikan persentase penurunan kadar glukosa darah, dimana pada hari ke-21 persentase yang tertinggi terdapat pada dosis III yaitu 46,98 % sedangkan pada pemberian FGF saja yaitu 14,92 %. Jika hasil penelitian ini dibandingkan dengan penelitian Rahmawati (2019), pemberian kombinasi ekstrak etanol buah mengkudu 1000 mg/kgBB dan FGF 800 mg/kgBB menunjukan persentase penurunan kadar glukosa darah sampai 44,9%
dibandingkan dosis sediaan uji lainnya dan pada pemberian FGF saja 13.56 % yang menunjukan bahwa pada kombinasi FGF dengan ekstrak etanol buah mengkudu dan ekstrak etanol buah okra tidak mempunyai perbedaan yang signifikan jika dibandingkan dengan penelitian sebelumnya.
54 Besarnya efek penurunan kadar glukosa darah mencit pada kelompok dosis I, II dan III merupakan akibat dari aktivitas asam amino yang mencapai reseptor dan jenis ikatanya dengan reseptor. Menurut teori pendudukan reseptor (receptor occupancy), intensitas efek obat berbanding lurus dengan fraksi reseptor yang diikatnya dan intensitas efek mencapai maksimal jika seluruh reseptor diikat oleh obat. Apabila seluruh reseptor telah diduduki oleh obat, maka peningkatan dosis obat menjadi tidak berarti (Indijah and Fajri, 2016).
Pada penelitian ini diharapkan asam amino yang terkandung dalam ekstrak etanol buah mengkudu dan ekstrak etanol buah okra mampu diikat oleh reseptor tirosin kinase aktif. Seperti yang telah dilaporkan oleh Chunhieng (2003) bahwa terdapat asam glutamat, asam aspartat, isoleusin dalam buah mengkudu dan Sami et al., (2013) juga telah melaporkan bahwa buah okra mengandung asam aspartat, prolin, dan asam glutamat yang merupakan asam amino mayor, sedangkan sistein dan tirosin adalah asam amino minor yang selanjutnya memberikan sinyal regenerasi dan difrensiasi sel β sehingga sel β dapat berfungsi kembali secara normal untuk menghasilkan insulin.
Selain asam amino pada kelompok dosis I, II dan III yang diberi kombinasi FGF, ekstrak etanol buah mengkudu, ekstrak etanol buah okra menunjukan persentase penurunan kadar glukosa darah yang lebih tinggi dari pada kelompok dosis IV yang hanya diberikan FGF, juga dikarenakan senyawa aktif yang terkandung didalam buah mengkudu seperti flavonoid, fitoestrogen (glukosida flavon) dan xeronin dan pada buah okra terkandung flavonoid utama dalam okra yaitu quercetin yang bertindak sebagai antidiabetes (Fan et al., 2014).
Penelitian pada hewan menunjukkan quercetin mengurangi glukosa darah,
55 melindungi sel dan fungsi integritas sel beta pankreas yang dapat digunakan dalam pencegahan komplikasi diabetes (Aguirre et al., 2011).
Selain itu asam oleanolik, beta sistostenol, myricetin, kaempferol yang merupakan empat senyawa utama yang berperan dalam menunjukkan efek anti- diabetes (Prabhune et al., 2017), dan buah okra juga kaya akan fitoestrogen antara lain lignan, isoflavonoid dan coumesterol (Kuhnle et al., 2009) bekerja secara sinergis dengan FGF dalam menurunkan kadar glukosa darah. Fitoestrogen telah terbukti memiliki efek menguntungkan dengan meningkatkan lipid serum dan memodifikasi oksidasi LDL, laju metabolisme basal, insulin yang merangsang oksidasi glukosa serta mengurangi insulin serum dan resistensi insulin. Isoflavon dan lignan juga mempngaruhi metabolisme energi. Pengamatan ini menunjukkan bahwa konsumsi makanan yang kaya fitoestrogen memiliki efek menguntungkan pada obesitas dan diabetes (Bhathena and Velasquez, 2002) , sementara sediaan uji yang hanya diberi FGF bekerja sendiri tanpa ada bantuan zat aktif dalam menurunkan kadar glukosa darah saja yang merupakan pembanding tanpa pemberian senyawa lain.
56