BAB II KAJIAN TEORITIK
D. Perhitungan Jumlah Bakteri
32
rekasi positif, sedangkan jika terbentuk cincin berwarna kuning berarti negatif.
5) Uji Motilitas
Uji motilitas digunakan untuk melihat kemampuan bakteri dalam bergerak. Adanya pertumbuhan menyebar di sekitar tusukan menunjukkan motilitas positif (terbentuk serupa awan pada sisi kiri dan kanan tusukan), sedangkan sebaliknya menunjukkan hasil negatif.
6) Uji Gula-Gula
Uji gula digunakan untuk melihat penggunaan gula-gula oleh bakteri. Jenis-jenis gula yang dipakai ditetapkan dalam suatu deret dan letaknya tidak boleh berubah. Warna kuning menunjukkan hasil yang positif, sedangkan warna tidak berubah (tetap berwarna ungu) menunjukkan hasil negatif.48
33
Pemeriksaan tersebut terdiri atas 3 langkah berurutan yaitu : 1) uji dugaan (presumptive test), 2) uji yang diperkuat (confirmed test) dan uji lengkap (completed test).49
1. Uji pendugaan (presumtif test)
Uji pendugaan didasarkan pada dugaan adanya bakteri koliform pada suatu sampel air yang ada disuatu tempat. Uji pendugaan ini dilakukan dengan cara mengisolasikan sampel ke dalam media LBDS (Lactose Broth Double Strengt) dan LBSS (Lactose Broth Single Strenght) yang telah diberi tabung durham. Sampel air yang akan diuji diinokulasikan pada tiap tabung seri perlakuan (3 seri).
Ketiga seri larutan uji kemudian diinkubasikan selama 24 jam.
Inkubasi dilakukan untuk memberikan waktu bagi bakteri untuk tumbuh berkembang serta melakukan aktifitas metabolisme. Setelah masa inkubasi berakhir, setiap tabung reaksi diamati. Pengamatan dilakukan meliputi ada atau tidaknya gas terperangkap dalam tabung durham.
Terbentuknya gas tersebut menunjukkan hasil yang positif dan dapat digunakan sebagai dasar pengujian berikutnya. Selain terbentuknya gas, pengamatan juga dilakukan juga terhadap perubahan warna. Perubahan media menjadi kuning menunjukkan hasil yang positif.
2. Uji konfirmasi (confirmated test)
Uji konfirmasi dilakukan untuk mengetahui bakteri dalan air sampel. 1 ml dari masing-masing kultur yang menunjukkan hasil positif
49 Michael J. Pelczar, Dasar-Dasar Mikrobiologi Jilid 2. h.874.
34
diinokulasikan ke dalam dua media baru, yaitu BGLBB (Brilliant Green lactose Bile Broth). Media BGLBB mempunyai kemampuan untuk membatasi pertumbuhan mikroba yang tidak diharapkan yang dapat mengganggu pengamatan.
Sebelum dilakukan inokulasi biakan, semua tabung yang berisi BGLBB kemudian diberi tabung durham untuk mengetahui adanya gas yang dihasilkan oleh bakteri yang ada dalam sampel air. Kemudian media yang telah diinokulasi dengan biakan media sebelumnya diinkubasi selama 24 jam pada suhu yang berbeda (44ºC dan 37ºC).
Pembedaan suhu inkubasi ini bertujuan untuk menggolongkan jenis bakteri koliform yang ada dalam air sampel termasuk dalam coli fekal atau tidak. Jika biakan dalam inkubasi 44ºC tersebut menghasilkan gas, maka dapat diartikan bahwa bakteri koliform yang ada dalam media adalah coli fekal. Jika terbentuk gas pada kultur yang diinkubasi pada suhu 37ºC maka bakteri yang ada didalamnya bukan termasuk golongan coli fekal.
Uji konfirmasi bisa juga dilakukan dengan cara menginokulasi bakteri yang ada dalam media positif ke media agar berupa EMBA (Eosin Methylen Blue Agar). Inkubasi dilakukan selama 24 jam hingga bakteri tumbuh. Pengamatan yang dilakukan meliputi warna koloni bakteri yang tumbuh. Hasil positif ditunjukkan dengan adanya warna hijau metalik pada koloni bakteri yang dapat diasumsikan bahwa koloni bakteri tersebut adalah koloni E. coli.
35 3. Uji kelengkapan (completed test)
Uji kelengkapan dilakukan jika uji sebelumnnya menunjukkan hasil yang positif. Koloni yang menunjukkan hasil positif yaitu koloni yang berwarna hijau metalik pada media agar EMBA, kemudian diinokulasikan pada media yang baru dalam tabung reaksi yang sebelumnya sudah diberi tabung durham, yaitu LB dan diinkubasi dalam suhu 37ºC selama 24 jam. Pengamatan yang meliputi perubahan warna dan terbentuknya gas dalam tabung durham. Hasil yang positif kemudian dicatat dan kemudian dan dilakukan uji pewarnaan gram50.
Pertumbuhan mikroorganisme yang membentuk koloni dapat dianggap bahwa setiap koloni yang tumbuh berasal dari satu sel, maka dengan menghitung jumlah koloni dapat diketahui penyebaran bakteri yang ada pada bahan. Jumlah mikroba pada suatu bahan dapat dihitung dengan berbagai macam cara, tergantung pada bahan dan jenis mikrobanya. Metode penghitungan sel mikroorganisme di bagi menjadi 2 yaitu :
1. Secara tidak langsung yaitu jumlah mikroba dihitung secara keseluruhan baik yang mati atau yang hidup atau hanya untuk menentukan jumlah mikroba yang hidup saja.
a. Total Plate Count
Akan tetapi sering kali secara sukarela masih diadakan pengujian dengan menggunakan cara “menghitung jumlah koloni pada agar-agar lempengan yang telah ditetapkan” disingkat “Penjumlahan pada
50Nining Purwati, Petunjuk Praktikum Mikrobiologi (Mataram:IAIN Mataram, 2014), h.35-36.
36
lempengan” (Standard Plate Count). Satu atau lebih ml air contoh di campurkan ke dalam cawan agar-agar yang belum beku yang mengandung glukosa tripton. Setelah itu sebagian dari cawan-cawan disimpan dalam suhu 20 selama 48 jam. Kalau jam-jam yang sudah ditentukan itu berakhir, jumlah koloni-koloni dihitung. Jika jumlah yang ditemukan kurang dari pada standard yang telah ditetapkan, maka air dianggap murni.51
b. Menggunakan Centrifuge
Caranya adalah 10 cc biakan cair mikroba dipusingkan dengan menggunakan centrifuge biasa dan digunakan untuk dipertanggung jawabkan, maka kecepatan dan waktu centrifuge harus diperhatikan.
Setelah diketahui volume mikroba keseluruhannya, maka dapat dipakai untuk menentukan jumlah sel-sel mikroba tiap cc, yaitu dengan membagi volume mikroba keseluruhan dengan volume rata-rata tiap sampel. Dengan kecepatan 3500-6000 rpm dan dengan waktu 5-10 menit.
c. Berdasarkan kekeruhan (turbiditas/turbidimetri)
Turbidimetri merupakan metode yang cepat untuk menghitung jumlah bakteri dalam suatu larutan menggunakan spektrofotometer. Metode ini menggunakan tabung-tabung dengan suspense dari berbagai derajat kekeruhan (menurut Brown). Tiap derajat tersebut dengan tingkat kekeruhan ekivalen dengan jumlah tertentu per milliliter. Suspense
51Dwidjoseputro, Dasar-Dasar Mikrobiologi, (Jakarta: Dajambatan, 2010), h. 192.
37
bakteri yang ingin diperiksa jumlahnya dibandingkan dengan kekeruhannya dalam tabung yaitu dengan ukuran yang sama dengan kekeruhan tabung Brown yang telah dibakukan dan jumlah organismenya dapat dilihat pada table derajat kekeruhan baku.
Suspense yang diperiksa bila perlu harus diencerkan.52 d. Menggunakan Perhitungan Elektronik (Elektronic Counter)
Alat ini dapat digunakan untuk menentukan beribu-ribu sel tiap detik secara tepat. Prinsip kerja alat ini yaitu adanya gangguan-gangguan pada aliran ion-ion (listrik) yang bergerak diantara dua electrode.
Penyumbatan sementara oleh sel mikroba pada pori sekat yang terdapat diantara kedua electrode itu menyebabkan terputusnya aliran listrik.
Jumlah pemutusan aliran tiap satuan waktu dihubungkan dengan kecepatan aliran cairan yang mengandung mikroba merupakan ukuran jumlah mikroba dalam cairan tersebut.
e. Berdasarkan Analisa Kimia
Cara ini didasarkan atas hasil analisa kimia sel-sel mikroba. Makin banyak sel-sel mikroba, makin besar hasil analisa kimianya secara kuantitatif. Yang dipakai sebagai dasar penentuan umumnya kandungan protein, asam-asam nukleat (DNA dan RNA) atau fosfor dari asam- asam nukleat.
52Koes Irianto, Mikrobiologi…, h.136.
38 f. Berdasarkan Berat Kering
Cara ini terutama digunakan untuk penentuan jumlah jamur benang misalnya dalam industri mikrobiologi. Kenaikan berat kering suatu mikrobia berarti juga kenaikan sintesa dan volume sel-sel yang dipakai untuk menentukan jumlah mikrobia.
g. Menggunakan Cara Pengenceran
Cara pengenceran ini dipakai untuk menentukan jumlah mikroba yang hidup saja. Dasar perhitungannya adalah dengan mengencerkan sejumlah volume tertentu suatu suspensi bahan atau biakan mikroba secara bertingkat, setelah diinokulasikan ke dalam medium dan diinkubasikan, dilihat pertumbuhan mikrobanya. Misalnya suatu seri pengenceran dengan kelipatan sepuluh pada pengenceran 1:10000, tetapi pada pengenceran 1:100000 tidak ada pertumbuhan, berarti secara teoritis jumlah mikroba pada suspense bahan atau biakan mikroba antara 10000 dan 100000 tiap cc per ml sampel.
2. Secara langsung yaitu jumlah mikroba dihitung secara keseluruhan, baik yang mati atau yang hidup.
a. Metode Bilik Hitung
Perhitungan ini dapat menggunakan hemositometer. Peteroff Hauser Bacteria Counter atau alat-alat lain yang sejenis. Dasar perhitungannya ialah dengan menempatkan satu tetes suspense bahan atau biakanmikroba pada alat tersebut ditutup dengan gelas penutup kemudian diamati dengan mikroskop yang perbesarannya tergantung
39
pada besar kecilnya mikroba. Dengan menentukan jumlah sel rata-rata tiap petak (ruangan) yang telah diketahui volumenya, dari alat tersebut dapat ditentukan jumlah sel mikroba tiap cc.Prinsip dari perhitungan Petroff-Hauser yaitu melakukan perhitungan dengan pertolongan kotak-kotak skala, di mana dalam setiap ukuran skala seluas 1 mm2terdapat 25 buah kotak besar dengan luas 0,04 mm2, dan setiap kotak besar terdiri dari 16 kotak kecil. Alat haemocytometer digunakan di bawah mikroskop, sisinya mempunyai ukuran 0,05 mm.
Sedangkan satu kotak sedang berukuran nilai 0,2 mm. Dan tebal nya adalah 0,1 mm.
b. Menggunakan Cara Pengecatan dan Pengamatan Mikroskopik
Pada cara ini mula-mula dibuat preparat mikroskopik pada gelas benda, suspensi bahan atau biakan mikroba yang telah diketahui volumenya diratakan diatas gelas benda pada suatu luas tertentu.
Setelah itu preparat dicat dan dihitung jumlah rata-rata sel mikroba tiap bidang pemandangan mikroskopik. Luas bidang pemandangan mikroskopik dihitung dengan mengukur garis tengahnya. Jadi jumlah mikroba yang terdapat pada gelas benda seluruhnya dapat dihitung.
Dengan perhitungan dapat diperoleh jumlah mikroba tiap cc bahan/cairan yang diperiksa.
Cara yang hampir sama dan biasa dipakai untuk menghitung jumlah bakteri , ialah dengan mencampurkan 1 cc biakan bakteri dengan 1 cc darah manusia. Setelah homogen dibuat preparat mikroskopik. Dari
40
perbandingan jumlah rata-rata jumlah sel bakteri dan jumlah sel darah merah dalam tiap bidang pemandangan, jumlah bakteri tiap cc dapat dihitung, sebab darah manusia yang normal mengandung 5 juta sel darah merah tiap cc. Perbandingan darah dengan bakteri yaitu 1:1.
c.
Menggunakan Filter MembranMula-mula disaring sejumlah volume tertentu suatu suspensi bahan atau biakan mikroba, kemudian disaring dengan filter membran yang telah disterilkan terlebih dahulu. Dengan menghitung jumlah sel rata- rata tiap saat satuan luas pada filter membran, dapat dihitung jumlah sel dari volume suspense yang disaring. Jika perhitungan secara biasa susah, perlu dilakukan pengecatan pada filter membran, kemudian filter membran dijenuhi dengan minyak imersi supaya tampak transparan.
Prinsip dari metode hitungan cawan adalah bila sel mikroba yang masih hidup ditumbuhkan pada medium, maka mikroba tersebut akan berkembang biak dan membentuk koloni yang dapat dilihat langsung, dan kemudian dihitung tanpa menggunakan mikroskop. Metode ini merupakan cara paling sensitif untuk menentukan jumlah jasad renik, dengan alasan:
1. Hanya sel mikroba yang hidup yang dapat dihitung.
2. Beberapa jasad renik dapat dihitung sekaligus.
3. Dapat digunakan untuk isolasi, dan identifikasi mikroba karena koloni yang terbentuk mungkin berasal dari mikroba yang mempunyai penampang spesifik.
41
Selain keuntungan-keuntungan tersebut diatas, metode hitungan cawan juga mempunyai kelemahan sebagai berikut:
1.
Hasil perhitungan tidak menunjukkan jumlah sel yang sebenarnya, karena beberapa sel yang berdekatan mungkin membentuk koloni.2. Medium dan kondisi inkubasi yang berbeda mungkin menghasilkan jumlah yang berbeda pula.
3. Mikroba yang ditumbuhkan harus dapat tumbuh pada medium padat dan membentuk koloni yang kompak, jelas dan tidak menyebar.
4. Memerlukan persiapan dan waktu inkubasi relatif lama sehingga pertumbuhan koloni dapat dihitung.