Isolasi dan Pemurnian
Laksmi Ambarsari
Pemurnian Enzim
memahami apa yang terjadi di dalam sel dan antara sel. Enzim /protein murni diperlukan untuk mempelajari reaksi, kinetika, regulasi, dll
memahami penyimpangan dalam proses metabolisme atau regulasi normal, dll (mis enzim yang abnormal/protein seperti globins ->
thalassemia dan penyakit sel sabit)
Why ?
membuat desain obat, berdasarkan struktur 3D-protein.
banyak protein/enzim memiliki nilai tambah, sebagai biokatalis (protease, lipase, glukosa isomerase), terapi (insulin,
interleukin), dll
Why ? Pemurnian Enzim
Apa yang dimurnikan ??
• Ekstrak dari sel atau jaringan (mungkin berisi lebih
dari 1000 protein yang berbeda dan banyak biomolekul lainnya
• untuk produksi perlu dipilih jaringan yang memiliki jumlah besar
Apa yang dimurnikan ??
• gunakan jaringan segar atau segera ditempatkan dalam larutan es (keadaan selalu dingin, 40C)
•untuk sel-sel bakteri disentrifugasi pada 16.000 g dan dipisahkan dari media pertumbuhan dan Pelet (sel
bakteri) disuspensi dalam buffer
Animal tissue Plant materials Microorganisms
Extracellular enzymes
Intracellular enzymes Disruption Disruption Filtration
Filtration Concentration
Concentration PurificationPurification Pure EnzymePure Enzyme Fermentation
Extraction Grinding
General Flow Chart of Purification
Enzyme in solution
Cell biomass (useful waste product)
Extracellular
enzyme Intracellular
enzyme Break open cells by
grinding or ultra-sonics Filter
Concentrate by evaporation at low temperature and pressure or by
osmosis
Crude enzyme in solution eg protease in chemical industry
Precipitate Powdered crude enzyme eg pectinase
Chromatography Pure enzyme for medicine eg glucose oxidase
Isolasi Enzim
Cara lemah:
• Lisis sel, tek osmosis
• Enzim, lisosim, lipase
• Otolisis, scr kimia dgn toluen
• Homogenisasi, porter elvehjem
Cara lemah:
• Lisis sel, tek osmosis
• Enzim, lisosim, lipase
• Otolisis, scr kimia dgn toluen
• Homogenisasi, porter elvehjem
Cara keras:
• French press (sel ditekan, 20000 psi)
• Ultrasonikasi Cara keras:
• French press (sel ditekan, 20000 psi)
• Ultrasonikasi
Pemecahan Sel
Cara sedang:
• Homogenisasi, waring blender
• Penggerusan campur serbuk gosok pasir
Cara sedang:
• Homogenisasi, waring blender
• Penggerusan campur serbuk gosok pasir
Pemurnian
• Pengendapan
• Pemisahan berdasarkan ukuran molekul
• Pemisahan berdasarkan muatan
• Pemisahan berdasarkan interaksi spesifik dengan biomolekul lainnya
• Pemisahan berdasarkan prinsip lainnya
Pemurnian (
contoh)• Pengendapan ammonium sulfat
• Filtrasi gel
• Kromatografi penukar ion
• Kromatografi afinitas
• Kromatografi interaksi hidrofobik, kromatografi hidroksiapatit
Ultrafiltrasi
• Ultrafiltrasi: Suspensi protein dilewatkan
saringan ultra halus. Air dan garam dapat lewat, protein tertinggal
• Garam berkompetisi dengan air
• Protein mengalami
agregasi melalui interaksi van der Waals dan
hidrofobik dan
mengendap dalam bentuk native
• %kejenuhan (NH4)2SO4
Solubility (Salting Out)
Dialisis
• Dialisis: Suspensi protein yang mengandung garam
dimasukkan kantong dialisis yang memiliki pori ultra halus.
• Air (yang melarutkan garam) bebas melalui pori, sedangkan protein tertinggal
Kolom Kromatografi
• Muatan: Kromatografi Penukar Ion
• Kepolaran: Kromatografi Interaksi Hidrofobik
• Ukuran: Dialisis, Ultrafiltrasi, Gel
elektroforesis, Kromatografi Filtrasi Gel, Ultrasentrifugasi
• Spesifisitas: Kromatografi afinitas
Kromatografi Penukar Ion
CM cellulose
cation exchanger
CH2-COO- CH2-COO-
+ + ++
Positively
charged (basic) protein or enzyme
DEAE cellulose anion exchanger
CH2-CH2 -NH+(CH2CH2) - - - -
Negatively
charged (acidic) protein or enzyme CH2-CH2 -NH+(CH2CH2)
CM cellulose
cation exchanger
CH2-COO- CH2-COO-
+ + ++
Positively charged protein or enzyme bind to the
column
- - - -
- - - -
Negatively
charged proteins pass through the column
Kromatografi Penukar Ion
1
2
Kromatografi Penukar Ion
CM cellulose
cation exchanger
CH2-COO- CH2-COO-
+ + ++
CM cellulose
cation exchanger
CH2-COO-
CH2-COO- +
+ ++ Na+
Na+ Na+2 Cl- Cl-
Cl- Cl-
Na+2
+ Increasing [NaCl] of the elution buffer
Kromatografi Penukar Ion
Elusi dengan gradien NaCl dan
Kromatogram kolom penukar kation
Kromatografi Penukar Ion
Jenis matriks penukar ion
Kromatografi Filtrasi Gel
size Molecular mass (daltons)
10,000
30,000
100,000
flow
Kromatografi Filtrasi Gel
flow
Kromatografi Filtrasi Gel
flow
Kromatografi Filtrasi Gel
flow
Kromatografi Filtrasi Gel
flow
Kromatografi Filtrasi Gel
Kromatografi Filtrasi Gel
Tahap pemisahan dan Kromatogram kolom kromatografi filtrasi gel
Kromatografi Filtrasi Gel
Jenis matriks filtrasi gel
Kromatografi Afinitas Gel
Inert support
Spacer arms
+ +
Ligand
Inert support Affinity material
prepared
Inert support
Mixture of proteins
Inert support
Unwanted proteins
Kromatografi Filtrasi Gel
Inert support
Remove from competitive ligand by dialysis.
Inert support
Elute with competitive ligand.
Kromatografi Affinitas
Bagaimana Pemurnian Diukur
1. Ditentukan aktivitas enzim 2. Dibuat tabel pemurnian
3. Dilakukan metode metode fisik:
SDS-PAGE, filtrasi gel
1. Aktivitas enzim: dinyatakan dalam Unit (U) definisi: jumlah produk yang dihasilkan
per ml enzim per menit pada kondisi optimum
Kemurnian :
Aktivitas spesifik enzim setelah pemurnian per aktivitas spesifik sebelum pemurnian
2. Tabel Pemurnian
Setiap tahap pemurnian diukur:
• volume enzim (ml)
• kadar protein (mg/ml)
• aktivitas enzim (U/ml)
Aktivitas Spesifik (U.mg-1):
Aktivitas (U.ml-1) / protein (mg.ml-1) Yield (%):
Enzim total setelah tahap pemurnian Per enzim total sebelum pemurnian
Total enzyme (U):
Aktivitas (U.ml-1) x vol(ml)
Tahap Vol (ml)
Total akt (U)
Total prot (mg)
Akt spe (U/mg)
Yield
(%) Kemurnian
CE 500 3000 15000 0,2 100 -
AS 100 2400 4000 0,6 80 3,0
IEC 45 1440 500 2,9 48 14,5
GF 50 1000 125 8,0 33 40,0
CE: Crude cell extract
AS: ammonium sulfate fractionation IEC: ion exchange chromatography GF : gel filtration
Contoh Tabel Pemurnian
Tugas Mandiri
1. What are enzymes and what do they do 2. Properties of enzymes
3. Advantages of using enzymes
Dikumpulkan hari sabtu tgl: 11 April 2020 ke email ibu [email protected]
Jawaban singkat, jelas (maksimum 4 halaman)
