METODE ELISA
(Pemeriksaan Hepatitis B)
Here starts the lesson!
Anggota :
1. Nabila Siti Latifah (1010191074)
2. Marisha Adella Putri (1010191065) 3. Suci Rama Dini (1010191116)
4. Putri Dinda Chairunnisa (10101910194)
5. Rahmawati Tri Handayani
(1010191102)
Hepatitis B
Pengertian Hepatitis B : Hepatitis B adalah virus tergolong famili
Hepadnaviridae (Hepatitis B- like viruses)yang dapat
menyebabkan peradangan hati
akut atau menahun yang pada
Sebagian kecil kasus dapat
berlanjut menjadi sirosis hati
dan kanker hati.
Struktur Tubuh Virus Hepatitis B
1. Karakteristik virion berselubung.
2. Memiliki Protein permukaan (Anti-HBsAg)
S-HBsAg
M-HBsAg
L-HBsAg
3. Memiliki Envelope 4.Memiliki nukleokapsid 4. Materi genetik-nya DNA
CARA PENULA
RAN dan
TANDA G EJALA
ELISA
Pengertian ELISA : Elisa (Enzyme Linked
Immunosorbent Assay) adalah salah satu metode yang sensitif
untuk mendeteksi antibodi, antigen, hormon maupun
bahan-bahan toksik.
Alasan Mengapa Disebut Metode ELISA
1.
Karena antigen atau antibodi yang dicari diabsorbsi ke permukaan Microwell (Sumuran)
2.
Antigen akan dikenali dengan antibodi spesifik
3.
Antibodi ini dikenali oleh antibody kedua yang telah ditempeli enzim.
4.
Substrat akan bereaksi dengan enzim untuk
menghasilkan produk akhir berupa warna.
Fungsi ELISA
● Untuk menganalisis adanya interaksi antigen dengan antibodi di dalam suatu sampel.
● Untuk melihat adanya antigen atau antibodi dalam sampel, metode ini berguna untuk menentukan
konsentrasi antibodi (seperti pada Tes HIV atau pada skrining COVID-19)
● Untuk mendeteksi alergen makanan yang potensial.
● Sebagai tes darah serologis untuk mendeteksi penyakit
● Pada toksikologi sebagai skrining awal untuk mendeteksi
beberapa jenis obat-obatan.
DIRECT ELISA
INDIRECT ELISA
SANDWICH ELISA
JENIS-JENIS METODE ELISA
JENIS – JENIS METODE ELISA
● ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) DIRECT/ Langsung
Pemeriksaan ELISA langsung dilakukan di mana antigen diimobilisasi ke permukaan dari plat dan dideteksi dengan antibodi spesifik
terhadap antigen dan secara langsung terkonjugasi dengan HRP atau
molekul deteksi lain.
JENIS – JENIS METODE ELISA
● ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) INDIRECT/ Tidak Langsung
Dalam teknik ELISA indirect yang dideteksi dan diukur konsentrasinya merupakan antibody. ELISA indirect menggunakan suatu antigen
spesifik (monoklonal) serta antibody sekunder spesifik tertaut enzim
signal untuk mendeteksi keberadaan antibody yang diinginkan pada
sampel yang diuji.
JENIS – JENIS METODE ELISA
● ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) SANDWICH
Pemeriksaan ELISA ini membutuhkan dua spesifik antibodi untuk epitop berbeda dari antigen. Kedua antibodi biasanya disebut sebagai pasangan antibodi yang cocok. Salah satu antibodi akan berikatan pada permukaan dari plat dan digunakan sebagai antibodi penangkap untuk memfasilitasi imobilisasi dari antigen. Antibodi
yang lain akan berkonjugasi dan memfasilitasi deteksi dari antigen.
KELEBIHAN DAN KEKURANGAN
KELEBIHAN
● Kelebihan indirect ELISA yaitu memiliki sensitifitas tinggi dan sinyal amplifikasi yang tinggi
KEKURANGAN
● Metode ELISA memerlukan alat yang cukup mahal
● Pada pemeriksaan ELISA harga antibodi monoklonal relatif lebih mahal
● Selain itu teknik ELISA
membutuhkan waktu
pengerjaan yang sangat
lama dan rumit
TATA CARA MENJAGA STABILITAS ELISA KIT
● ELISA Kit dapat langsung disimpan pada refrigerator 4°C selama 1 bulan, atau hingga waktu expired date-nya.
● Hindari paparan langsung dengan sinar matahari.
● Semua tutup botol reagen harus diperketat untuk mencegah penguapan dan kontaminasi mikroba.
● Silakan kenakan jas lab, pelindung mata, dan sarung tangan lateks untuk perlindungan.
● Setiap kit telah secara ketat lulus tes QC. Maka dari itu budayakan
membaca kit insert terlebih dahulu sebelum digunakan.
Pemeriksaaan HBsAg Metode ELISA
Prinsip pemeriksaan :
Antibodi ganda “sandwich” imunosai yang menggunakan antibodi anti-HBsAg spesifik: antibodi monoklonal HBsAg yang berada di dasar sumur mikrotiter dan antibodi poliklonal HBsAg ditambahkan dengan Horseradish Peroxidase (HRP) sebagai larutan konjugat. Selama pemeriksaan, adanya HBsAg dalam spesimen akan bereaksi dengan antibodi-antibodi tersebut untuk membentuk kompleks imun “antibodi-HBsAg-antibodi- HRP”. Setelah materi yang tidak terikat tercuci selama pemeriksaan, substrat ditambahkan untuk menunjukkan hasil tes. Munculnya warna biru di sumur mikrotiter mengindikasikan HBsAg reaktif. Tidak adanya warna menunjukkan hasil non reaktif di spesimen
1. Yang berada pada permukaan plat terlebih dahulu adalah Antibodi penangkap.
2. Terdapat beberapa jenis antibodi yang digunakan:
• Antibodi monoklonal (Antibodi monospesifik)
• Antibodi poliklonal (Antibodi yang sudah berikatan dengan enzim)
3. Sandwich ELISA juga terbagi menjadi direct sandwich dan indirect sandwich
KARAKTERISTIK METODE SANDWICH ELISA
Alat :
1. Mikroplate well 2. Mikropipet
3. Tip Kuning dan Tip Biru 4. Rotator
5. ELISA Reader 6. ELISA Washer
Bahan :
1. Enzim Konjugat 2. Kontrol Positif 3. Kontrol Negatif 4. Sampel diluent 5. Color A dan B 6. Stop Solution 7. Wash Buffer
8. Sampel serum pasien
Alat & Bahan
Cara Kerja
a. Pembuatan Wash Buffe
1.) Wash buffer pekat dicampurkan dengan aquadest perbandingan (1:19) 2.) Campuran yang sudah jadi disimpan pada suhu ruang selama seminggu b. Prosedur Pemeriksaan
1.)Semua reagen dan specimen dikondisikan pada suhu ruang.
2) Siapkan nomor yang dibutuhkan untuk sumur, yang terdiri dari 1 sumur blanko, 2 sumur control positif, 2 sumur untuk control negatif dan 1 sumur untuk setiap specimen. Tulis nomor seri untuk control dan specimen pada kolom.
3) Spesimen diluents ditambahkan sebanyak 20μl pada masing-masing sumur.
4) Spesimen, control negative, control positif ditambahkan sebanyak 100μl sesuai kolom data.
(sediakan 1 sumur untuk blanko) 5) Kemudian dihomogenkan
6) Plate diinkubasi pada incubator suhu 37°C ± 1 jam
7) Enzyme conjugate ditambahkan pada setiap sumur ± 50μl.
8) Plate diinkubasi pada incubator suhu 37°C ± 30 menit.
9) Setiap sumur dicuci dengan wash buffer dengan prosedur :
Lanjutan Cara Kerja
- Pencucian yang dilakukan harus sesuai dengan petunjuk apabila ada pencucian yang tidak sempurna maka akan mempengaruhi hasil.
- Semua isi sumur dimasukkan pada labu cuci. Kemudian ditambahkan wash buffer 350/lebih.
- Pastikan tidak ada cairan di dalam tip dan setelah pemipetan terakhir.
10) Color A & B dimasukkan pada setiap sumur sebanyak 50μl 11) Plate diinkubasi pada waterbath/inkubator 37° C± 30 menit
12) Hentikan reaksi dengan penambahan 50μl stopping solotion disetiap sumur 13) Absorbansi setiap sumur dibaca pada 450nm.
Hasil pemeriksaan valid jika :
1) Nilai OD blanko kurang dari 0.100 ( sumur dari kontrol blanko hanya berisi kromogen dan stop solution) 2) Nilai OD kontro negatif harus sama atau kurang dari (<) 0.100. Dieliminasi kontrol negatif dengan nilai
OD lebih besar dari (>) 0.100. Jika 2 nilai keluar dari batas, pemeriksaan invalid dan harus di ulangi.
3) Nilai OD kontrol positif sama atau lebih besar (>) 0.500. Jika nilai OD kurang dari 0.500, pemeriksaan invalid dan harus di ulangi
Interpretasi hasil :
4) Spesimen dengan absorbansi kurang dari (<) nilai cut-off dinyatakan negatif.
5) Spesimen dengan nilai absorbansi lebih besar atau sama dengan (>) nilai cut-off dinyatakan positif.
Terima
Kasih
