Laporan Praktikum Bioteknologi Laut
POLYMERASE CHAIN REACTION DAN ELEKTROFORESIS
Disusun Oleh :
Nama : MHD ZAMRI
NIM : 2011101010054
Kelompok : 1 Shift 2
Asisten : Nanda Ulfa Khaira
PROGRAM STUDI ILMU KELAUTAN FAKULTAS KELAUTAN DAN PERIKANAN
UNIVERSITAS SYIAH KUALA DARUSSALAM, BANDA ACEH
OKTOBER, 2023
i
LEMBAR PENGESAHAN
POLYMERASE CHAIN REACTION DAN ELEKTROFORESIS
Disusun oleh :
Nama : MHD ZAMRI NIM : 2011101010054 Program Studi : Ilmu Kelautan
Disetujui
Asisten Koor Asisten
Nanda Ulfa Khaira Nanda Ulfa Khaira
1811101010040 1811101010040
ii
ABSTRAK
Telah dilakukan percobaan praktikum Bioteknologi Laut yang berjudul “Polymerase Chain Reaction dan Elektroforesis” yang dilakukan pada Sabtu, 28 Oktober 2023, bertempat dilaboratorium Kimia Laut, Fakultas Kelautan dan Perikanan, yang bertujuan untuk mengetahui prinsip kerja PCR, memahami teknik dasar PCR dan dapat mengoperasikan alat SensoQuest Lab cycler Spin, dan untuk mengetahui gambaran DNA hasil elektroforesis pada gel agarose. PCR merupakan suatu teknik yang melibatkan beberapa tahap yang berulang (siklus) dan pada setiap siklus terjadi duplikasi jumlah target DNA untai ganda. Elektroforsis DNA gel merupakan sebuah metode untuk memisahkan molekul DNA berdasarkan ukurannya. Pada percobaan ini menggunakan metode kuantitatif yaitu mengamati perubahan yang terjadi suatu zat atau sampel pada ikan pari. Pada percobaan ini didapatkan hasil KT03-02 Amplification (+) Positif, Ada Bent DNA, dan Sedangkan KT05-01 Amplification (+) Positif, Ada Bent DNA, Ladder Amplication (+) Positif, Ada Bant DNA, Dan Kontrol Negatif Amplication (-) Negatif, Tidak Ada Bant DNA. Manfaat dari percobaan ini yaitu dapat mengetahui prinsip kerja PCR, teknik dasar PCR dan mengoperasikan alat SensoQuest Lab cyler Spin, dan gambaran DNA hasil elektroforsis pada gel agarose.
Kata Kunci : PCR, Elektroforesis, DNA, Agarose, SensoQuest.
iii
KATA PENGANTAR
Puji syukur kehadirat Allah SWT, yang telah memberikan rahmat dan karunia-Nya, sehingga penulis dapat menyelesaikan laporan praktikum ini dengan materi yaitu Polymerase Chain Reaction dan Elektroforesis. Sholawat beriringan salam tidak lupa pula penulis sanjungkan kepada Nabi Muhammad SAW yang telah membawa umat manusia dari zaman yang tidak ada mempunyai ilmu pengetahuan menuju ke zaman yang penuh dengan ilmu pengetahuan seperti sekarang ini.
Penulis ucapkan terima kasih kepada dosen dan para asisten laboratorium mata kuliah Bioteknologi Laut yang telah membimbing penulis dalam praktikum ini, semoga Allah SWT membalas pahala atas ilmu yang diberikan.
Dalam penyelesaian laporan praktikum ini penulis masih menyadari banyak kekurangan, oleh karena itu segala kritikan dan saran yang sangat diharapkan oleh penulis agar kedepannya laporan praktikum yang ada menjadi lebih baik lagi.
Banda Aceh, 1 November 2023
Penulis
iv
DAFTAR ISI
Halaman
LEMBAR PENGESAHAN ... . i
ABSTRAK ………...………. ii
KATA PENGANTAR ... iii
DAFTAR ISI ... iv
DAFTAR TABEL ... v
DAFTAR GAMBAR ... vi
DAFTAR LAMPIRAN ... vii
BAB I PENDAHULUAN ... 1
1.1 Latar Belakang ... 1
1.2 Tujuan Praktikum ... 2
1.3 Manfaat Praktikum ... 2
BAB II TINJAUAN PUSTAKA ... 3
BAB III METODE KERJA ... 6
3.1 Waktu dan Tempat Praktikum ... 6
3.2 Alat dan Bahan ... 6
3.3 Cara Kerja ... 7
3.3 Analisa Data ... 9
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ... 10
4.1 Hasil Pengamatan ... 10
4.2 Pembahasan ... 10
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ... 12
5.1 Kesimpulan ... 12
5.2 Saran ... 12
DAFTAR PUSTAKA ... 13
LAMPIRAN ... 15
v
DAFTAR TABEL
Halaman Tabel 3.2.1 Alat Praktikum ... 5 Tabel 3.2.2 Bahan Praktikum ... 6 Tabel 4.1 Hasil Pengamatan ... 9
vi
DAFTAR GAMBAR
Halaman
Gambar 3.1.1 Lokasi Praktikum di Laboratorium ... 6
Gambar 2.1 Red Master Mix ... 15
Gambar 2.2 Ddh2O (Steril) ... 15
Gambar 2.3 Sample Fish F2 ... 15
Gambar 2.4 Sample Fish R2 ... 15
Gambar 2.5 Alat Incubator ... 15
Gambar 2.6 Hasil Akhir PCR DNA ... 15
vii
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman Lampiran 1. Analisa Data ... 15 Lampiran 2. Dokumentasi ... 15
1
BAB I PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Ikan Pari, Batoidea merupakan ikan yag sangat digemari oleh masyarakat karena memiliki kandungan gizi yang tergolong tinggi, yaitu protein sekitar 20%, dan kandungan lemak sebesar 5% serta mengandung omega-3. Ikan Pari merupakan jenis ikan yang berasal dari famili Latidae dengan nama genus Lates. Ikan Pari putih memiliki beragam nama dari beberapa negara, tetapi yang lebih sering dikenal sebagai seabass atau barramundi. Selain ikan Pari populer di Indonesia, juga merupakan jenis ikan yang bernilai ekonomis tinggi di pasar regional dan internasional (Irmawati dan Alimuddin, 2019).
Analisis molekuler menggunakan DNA sebagai objeknya diawali dengan proses ekstraksi/isolasi DNA untuk mendapatkan DNA yang murni dengan konsentrasi tinggi sehingga dapat digunakan untuk analisis molekuler selanjutnya, seperti PCR, RLFP, dan RAPD. Ekstraksi DNA dapat dilakukan dengan berbagai metode, baik konvensional maupun menggunakan kit. Seiring perkembangan ilmu pengetahuan dan teknologi, ekstraksi DNA dapat dilakukan menggunakan kit berbagai merk. Masing-masing metode memiliki tahapan yang berbeda sehingga perlu dilakukan optimasi isolasi DNA (Fitriya et al., 2019).
Teknik RAPD merupakan salah satu dari beberapa teknik penanda berbasis DNA dengan melibatkan penggunaan mesin PCR (Polymerase Chain Reaction).
Teknik PCR-RAPD dapat digunakan untuk mengidentifikasi perbedaan genotipe tipe liar dan hasil domestikasi, berdasarkan perbedaan pada pita DNA yang dapat teramplifikasi dengan random primer. Berdasarkan hal tersebut sehingga penelitian ini dilakukan dengan tujuan untuk menganalisis abnormalitas dan keragaman genetik ikan pari tipe liar dan hasil domestikasi (Sari, 2021).
Elektroforesis Agarosa adalah metode umum yang digunakan untuk memisahkan fragmen DNA dengan memanfaatkan prinsip pergerakannya pada medium gel yang dialiri medan listrik. Prinsip kerja elektroforesis adalah dengan memisahkan DNA berdasarkan ukuran (berat molekul). Teknik ini sering digunakan
2
dalam bidang biologi molekuler untuk menentukan ukuran suatu fragmen DNA, memisahkan fragment DNA, sekaligus untuk menguji kualitas dan kuantitas sampel (Lee et al., 2022).
Elektroforesis terdiri dari medium pemisah yang terhubung dengan dua elektroda dan media pemisah berupa gel agarose. Gel agarose adalah partikel agar yang diisolasi dari alga merah. Partikel agar pada gel agarose akan menjadi matriks berpori, besar kecilnya pori disebabkan banyak sedikitnya bubuk agarose yang digunakan. Konsentrasi gel agarose mempengaruhi laju migrasi DNA pada proses elektroforesis. Semakin rendah konsentrasi agarose maka pori-pori gel akan semakin besar dan fragmen DNA dapat dipisah semakin jauh begitupun sebaliknya, semakin tinggi konsentrasi agarose maka pori-pori gel semaik kecil dan sulit untuk dipisah (Zahra, 2022).
1.2 Tujuan Praktikum
Tujuan dari praktikum untuk mengetahui prinsip kerja PCR, memahami teknik dasar PCR dam dapat mengoperasikan alat SensoQuest Lab cycler Spin, dan mengetahui gambaran DNA hasil elektroforesis pada gel agarose.
1.3 Manfaat Praktikum
Manfaat dari praktikum Polymerase Chain Reaction dan Elektroforesis ini yaitu:
1. Mampu mengetahui prinsip kerja PCR.
2. Mampu mengetahui teknik dasar PCR.
3. Mampu mengoperasikan alat SensoQuest Lab cycler Spin.
4. Mampu mengetahui gambaran DNA hasil elektroforesis pada gel agarose.
5. Mampu membedakan PCR dan Elektroforesis.
3
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
PCR merupakan metode menghasilkan sejumlah besar fragmen DNA spesifik dengan panjang dan sekuens yang telah ditentukan dari sejumlah kecil template kompleks. PCR didasarkan pada amplifikasi enzimatik fragmen DNA dengan menggunakan dua oligonukloutida primer sebagai primer untuk memungkinkan DNA template dikopi oleh DNA polymerase dengan melakukan pemanasan. Suhu pada reaksi selanjutnya diturunkan untuk membiarkan terjadinya perpasangan sekuens maka terjadilah proses polimerisasi (Anggereini, 2018).
Isolasi DNA bertujuan untuk memisahkan DNA dari partikel-partikel lainnya seperti lipid, protein, polisakarida, dan zat lainnya. Isolasi DNA berguna untuk beberapa analisis molekuler dan rekayasa genetika seperti editing genom, transformasi dan PCR. Banyak metode isolasi yang dapat digunakan, tetapi pada dasarnya tahapan dari isolasi DNA pada semua bahan dan semua metode sama, yakni lisis sel atau jaringan yang efektif, denaturasi kompleks nukleuprotein, dan inaktivasi nuclease. Hasil isolasi DNA selanjutnya diamplifikasi dengan metode PCR-RAPD (Hariyadi et al., 2018).
Proses PCR membutuhkan tiga syarat dasar dalam siklus PCR yaitu DNA cetakan, penempelan sepasang primer oligonukleotida pada DNA cetakan utas tunggal, pemanjangan secara enzimatik untuk menghasilkan salinan DNA dalam proses siklus berikutnya. Ada beberapa macam enzim yang dijual secara komersial yang dapat dipilih dari kemampuan terhadap panas, posesivitas, dan ketepatan penempelan. Reaksi pelipatgandaan suatu fragmen DNA dimulai dengan melakukan denaturasi DNA cetakan sehingga rantai DNA yang berantai ganda akan terpisah menjadi rantai tunggal (Kurnia, 2020).
Metode molekuler ini memiliki beberapa tahapan yang sangat penting dalam pelaksanaannya. Tahapan tersebut adalah tahap ekstraksi dan tahap PCR (Polymeras Chain reaction). Ekstraksi adalah tahap molekuler awal untuk memisahkan DNA dan sel. Sedangkan PCR atau yang biasa dikenal dengan amplifikasi merupakan metode untuk meningkatkan jumlah DNA yang diperoleh setelah tahap ekstraksi. Kedua
4
metode ini merupakan metode yang menentukan berhasil atau tidaknya peneliti dalam melakukan identifikasi molekuler. Namun dalam pelaksanaan identifikasi molekuler karang lunak, kedua tahapan ini masih banyak ditemui kendala. Hal ini dikarenakan adanya perbedaan ketebalan atau ketipisan jaringan pada spesies (Kusuma, 2022).
Pengurutan DNA adalah untuk menentukan urutan basa neuklotida yang terkandung dalam DNA. Semua sampel berhasil diidentifikasi secara molekuler, hal ini menunjukkan bahwa primer primer yang digunakan pada saat Polymerasse Chain Reaksi Polymerasse Chain Reaction (PCR) DNA tepat sasaran Sampel yang telah diidentifikasi positif mengandung DNA di dalamnya DNA di dalamnya kemudian dikirim ke Fasilitas Pengurutan DNA UC Berkeley Sequencing Facility UC Berkeley untuk dianalisa dan mendapatkan hasil sekuens yang nantinya akan dianalisa untuk menentukan hasil sekuens akan dianalisis untuk menentukan menentukan jenis dan spesies dari sampel yang diperoleh. Pengurutan DNA dilakukan dengan cara menyusun plate yang telah diberi ID. ID ini merupakan identitas sampel yang akan digunakan pada saat saat mengedit sampel dan memberikan nama pada hasil sekuensing (Bramasta et al., 2021).
Elektroforesis DNA gel merupakan sebuah metode untuk memisahkan molekul DNA berdasarkan ukurannya. Proses interpretasi gambar DNA sendiri secara manual untuk mendapatkan hasil yang akurat sangat susah, membutuhkan waktu, dan kemungkinan error cukup besar. Hal ini bisa disebabkan kompleksitas pergerakan molekul DNA itu sendiri. DNA yang akan dianalisa dibandingkan dengan DNA marker atau DNA yang telah diketahui (Sahilah et al., 2023).
Molekul yang bergerak dalam DNA akan berhenti pada jarak migrasi tertentu tergantung pada muatan, bentuk, dan ukurannya. Sehingga, kecocokan suatu DNA dapat dianalisa berdasarkan hasil elektroforesis DNA tersebut. Salah satu standar bahan yang digunakan dalam elektroforesis DNA yaitu gel agarosa. Pada DNA hasil elektroforesis gel agarosa, molekul DNA dianalisa berdasarkan letaknya setelah mengalami migrasi pada proses elektroforesis tersebut (Arian et al., 2021).
5
Terdapat banyak studi terkini yang berkaitan dengan DNA, salah satunya adalah penggunaan metode isolasi DNA optimal untuk identifikasi khamir dari sarang lebah madu Apis mellifera. Metode ini menghasilkan isolasi DNA dengan kemurnian antara 1,8-2,0 dan konsentrasi yang cukup tinggi, berkisar antara 10,32- 20,06, sehingga dapat digunakan sebagai template DNA pada amplifikasi DNA.
Untuk protokol PCR (Polymerase Chain Reaction), yang optimal digunakan adalah yang menghasilkan visualisasi fragmen DNA yang utuh, jelas, tebal, dengan ukuran panjang berturut-turut sebesar 504, 504, 588, dan 444 bp (Nugroho et al., 2019).
Studi lainnya yang terkait dengan DNA dan hasil elektroforesis melibatkan penggunaan metode pengolahan citra, yang otomatis membandingkan gambar DNA hasil elektroforesis dengan DNA marker untuk menentukan ukurannya. Metode pengolahan citra saat ini sering digunakan untuk berbagai tujuan seperti pengolahan citra, pengenalan pola, deteksi tepi objek, pengenalan bentuk, dan sebagainya.
Meskipun terdapat berbagai metode isolasi DNA, tahapan dasarnya tetap sama, yaitu lisis sel atau jaringan yang efektif, denaturasi kompleks nukleoprotein, dan inaktivasi nuklease (Novita et al., 2017).
Elektroforesis gel agarosa merupakan metode yang sering digunakan untuk pemisahan dan identifikasi DNA. Teknik ini sederhana, cepat dalam pengerjaan, dan mampu memisahkan campuran fragmen DNA. Sampel DNA yang digunakan berasal dari spermatozoa segar dan yang sudah dibekukan. Dari hasil running, dapat dilihat profil band DNA pada gel agarosa dibawah sinar UV. Dengan pemeriksaan profil band spermatozoa beku, kita akan mengetahui indikasi lebih awal kerusakan dari segi molekuler. Oleh karena itu, penting mengamati profil band DNA spermatozoa segar dan beku sehingga dapat mengetahui kualitas spermatozoa untuk keperluan Inseminasi Buatan (Lisnanti, 2020).
6
BAB III METODE KERJA
3.1 Waktu dan Tempat Praktikum
Praktikum Bioteknologi Laut dilaksanakan pada hari Sabtu, 28 Oktober 2023 pukul 12.00 s/d 14.00 WIB, bertempat di Laboratorium Kimia Laut Fakultas Kelautan dan Perikanan, Universitas Syiah Kuala, Darussalam, Banda Aceh.
Gambar 3.1.1 Lokasi Praktikum di Laboratorium Kimia Laut Fakultas Kelautan dan Perikanan, Universitas Syiah Kuala, Darussalam Banda Aceh.
3.2 Alat dan Bahan
Alat dan Bahan yang digunakan pada praktikum ini adalah:
3.1 Alat
Tabel 3.1 Alat Praktikum
No Nama Alat Jumlah Kegunaan
1. Cool Rack 1 Unit Untuk mendinginkan
2. Microtube 1.5 ml 2 Unit Untuk menyimpan sample
3. PCR Tube 2 Unit Untuk menyimpan sample
4. Mikropipet 1 Unit Untuk mengambil larutan
5. Tip Mikropipet 1 Unit Untuk mengambil larutan ukuran mikro
6. Tisu 1 Unit Untuk mengelap peralatan
7. SensoQuest Lab cycler spin 1 Unit Untuk homogenkan Sample
8. Vortex 1 Unit Untuk mencampurkan larutan
9. Spin 1 Unit Untuk mengontrol penggunaan daya
7 3.2 Bahan
Tabel 3.2 Bahan Praktikum
No Nama Bahan Jumlah Kegunaan
1. Ikan Pari 2 mm Sebagai Objek yang diamati/Sampel 2. Etanol 96% Secukupnya Sebagai pelarut
3. Etanol 70% Secukupnya Sebagai pelarut
4. Red Master Mix 37,5 µL Sebagai peningkatan hasil
5. Primer Forward 3 µL Sebagai pembatasan fragmen DNA 6. Primer Reverse 3 µL Sebagai pembatas fragmen DNA 7. Ddh2O (steril) 25.5 µL Sebagai menjaga DNA penyimpan.
3.3 Cara Kerja
3.1 Polymerase Chain Reaction
Digunakan jas laboratorium ketika melakukan kegiatan, Dipastikan selalu menggunakan glove dan masker, Dibersihkan meja kerja menggunakan etanol teknis 70%, Isi form pemakaian alat yang tertempel didekat alat PCR, Isi form PCR yang telah tersedia, Isi logbook penelitian sesuai dengan format penelitian, Dikeluarkan sampel hasil ekstraksi yang akan di analisis, Disiapkan reagen berupa : Red Master Mix, Primer Reverse, Primer Forward, DDH20 dengan takaran sesuai yang tertulis di form, Dipastikan meletakkan tube reagen didalam Cooler rack agar suhu dingin tetap terjaga, Diberi label pada tube PCR sesuai dengan label ekstraksi, Setelah memasukkan semua komposisi, set program PCR sesuai dengan sampel yang akan dianalisis, Di Running, Setelah selesai pengerjaan, pastikan meletakkan reagen kembali ke freezer, Diletakkan kembali pipet dan rak tip kembali ke raknya, Standarisasi pipet dengan mengembalikan ke angka 0, Dan Dibersihkan meja kerja dengan etanol teknis 70%.
8 3.2 Prosedur Pembedahan
Digunakan jas laboratorium ketika melakukan kegiatan. Dipastikan selalu menggunakan glove dan masker, Dibersihkan meja kerja menggunakan ethanol teknis 70%, Disiapkan cetakkan agar dan letakkan sisir agar untuk membuat sumur yang nantinya akan diletakkan hasil dari PCR, Kemudian campurkan TBE 1X dengan agarose kedalam Erlenmeyer, Setelah dicampurkan, masukkan Erlenmeyer kedalam microwave sampai agarose larut, Angkat Erlenmeyer dari microwave menggunakan glove karet dan masukan Red Stain sebanyak 2 µL dan aduk hingga merata, Setelah diaduk, tuangkan secara perlahan kedalam cetakan agar Jika dibagian sisir terdapat gelembung, pinggirkan gelombung tersebut, Tinggalkan selama kurang lebih 25 menit pada suhu ruangan, Dicabut sisir dari agar yang sudah keras dan masukan agar tersebut kedalam tank elektroforesis, Pada bagian awal agar, masukan ladder sebanyak 2 µL, Kemudian atur tegangan 100 volt waktu selama 30 menit.
Kemudian tekan run dan tunggu, Setelah seleasai, agar tersebut dimasukan kedalam Gel Doc dan tutup pintu box. Nyalakan lampu UV. Pengaturan dikendalikan oleh Software UVITEC Fire Reader V10 yang sudah terinstal didalam komputer Pilih
“UV-Gel” kemudian klik “Auto”, Untuk melihat panjang band gunakan pilihan 3D, Setelah didapat, klik save. Format penyimpanan bisa dalam bentuk Tif. Simpan file dengan format tanggal-jam, Edit penamaan gel berdasarkan tube PCR menggunakan aplikasi Paint, Dan Setelah gambar diambil, matikan mesin UV dan buang agar ke limbah khusus agarose. Kemudian bersihkan permukaan gel doc dengan alcohol atau DDH2O.
3.4 Analisa Data 3.4 Analisa Data
Pada praktikum Polymerase Chain Reaction dan Elektroforesis ini tidak menggunakan Analisa Data.
9
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil Pengamatan
Hasil pengamatan untuk Polymerase Chain Reaction dan Elektroforesis pada praktikum bioteknologi laut adalah sebagai berikut:
Tabel 4.1 Hasil Pengamatan
NO Sample ID Amplification Comment
1. KT03-02 (+) Positif Ada bent DNA
2. KT05-01 (+) Positif Ada Bent DNA
3. Ladder (+) Positif Ada Bent DNA
4. Kontrol Negatif (-) Negatif Tidak Ada Bent DNA
4.2 Pembahasan
Pada praktikum ini yaitu Polymerase Chain Reaction dan Elektroforesis terhadap kakap tua. PCR adalah suatu teknik yang melibatkan beberapa tahap yang berulang (siklus) dan setiap siklus terjadi duplikasi jumlah target DNA untai ganda.
Untai ganda DNA templet (unamplified DNA) dipisahkan dengan denaturasi termal dan kemudian didinginkan hingga mencapai suatu suhu tertentu untuk memberikan waktu pada primer menempel (anneal primers) pada daerah tertentu dari target DNA.
Proses PCR melibatkan beberapa tahap yaitu, Pra-denaturasi DNA templat, denaturasi DNA templat, penempelan primer pada templat (annealing), pemanjangan primer (extension) dan Pemantapan (Final extension).
10
Agarosa merupakan salah satu komponen penyusun agar, dimana agar merupakan senyawa polisakarida yang dihasilkan dari ekstraksi rumput laut, seperti Gelidium sp dan Gracilaria sp. Agarose gel electroforesis digunakan untuk analisis kualitas dari sampel DNA. Dengan menggunakan ukuran marker yang tepat, itu digunakan untuk menaksir integritas DNA and menghitung ukuran konsentrasi dari berbagai fragmen DNA. Dalam elektroforesis, agarosa digunakan untuk mendeteksi kompleks-kompleks antigen-antibodi, dan untuk analisis molekul DNA, RNA dan molekul protein. Perkembangan ilmu pengetahuan dan teknologi dalam analisis molekul DNA cukup pesat.
Konsentrasi agarose digunakan untuk menentukan besarnya matriks yang dapat memisahkan fragmen DNA. Semakin rendah konsentrasi agarose yang digunakan, maka akan semakin rendah matriks gel agarose, dan fragmen DNA akan terpisah semakin jauh. Perlengkapan alat elektroforesis terdiri dari yaitu, cetakan gel yang digunakan untuk membuat gel agarosa, alat pencetak sumur yang digunakan untuk membuat sumur-sumur pada sisi atas dari gel agarosa, yaitu tempat memasukkan DNA ke dalam gel, tangki elektroforesis dan Sumber arus. Dengan gel agarosa dapat dilakukan pemisahan sampel DNA dengan ukuran dari beberapa ratus hingga 20.000 pasang basa (pb). Molekul DNA bermuatan negatif sehingga di dalam medan listrik akan bermigrasi melalui matriks gel menuju kutub positif (anode).
Pada dasarnya, tes PCR adalah prosedur yang melibatkan 3 proses, yaitu ekstraksi material genetik dari sampel, penggandaan (amplifikasi) materi genetik, dan pembacaan hasil. Nantinya, hasil pemeriksaan ini akan ditampilkan dengan nilai CT value. Hasil tes PCR akan menunjukkan hasil berupa positif dan negatif. Di dalam proses PCR, primer berfungsi sebagai pembatas fragmen DNA target yang akan diamplifikasi dan sekaligus menyediakan gugus hidroksi (-OH) pada ujung 3' yang diperlukan untuk proses eksistensi DNA.
DNA polimerase yang biasanya digunakan pada teknik proses PCR disebut dengan Taq polymerase, yaitu enzim DNA polimerase stabil yang berhasil diisolasi dari bakteri termofilik ekstrem Thermus aquaticus yang hidup pada dinding geyser vulkanik. Langkah kerja PCR melewati 3 tahap berikut: Denaturation / denaturasi
11
(96°C): Pada proses denaturasi, panas mempengaruhi strand DNA akan terpisah menjadi DNA beruntai tunggal (single-stranded).
Pada prinsip kerja PCR, digunakan sebanyak 2 primer yang didesain mengapit daerah DNA yang ingin diperbanyak. Setelah primer berikatan dengan DNA templat, untai tunggal DNA akan diperpanjang oleh enzim DNA polimerase dan daerah yang diapit akan terkopi. Larutan Tris-HCl berfungsi sebagai penjaga kestabilan pH dengan kondisi pH yang optimum. Pemurnian DNA dengan silika menjadi bahan alternatif dalam metode isolasi DNA yang efisien dan efektif. Pada percobaan ini didapatkan hasil KT03-02 Amplification (+) Positif, Ada Bent DNA, dan Sedangkan KT05-01 Amplification (+) Positif, Ada Bent DNA.
12
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
5.1 Kesimpulan
Kesimpulan yang didapatkan pada praktikum Polymerase Chain Reaction dan Elektroforesis adalah:
1. PCR adalah suatu teknik yang melibatkan beberapa tahap yang berulang (siklus) dan pada setiap siklus terjadi duplikasi jumlah target DNA untai ganda.
2. Proses PCR melibatkan beberapa tahap yaitu, Pra-denaturasi DNA templat, denaturasi DNA templat, penempelan primer pada templat (annealing), pemanjangan primer (extension) dan pemantapan (Final extension).
3. Teknik Polymerase Chain Reaction (PCR) menggunakan primer forward dan reverse dari gen Cytochrome Oxidase sub unit 1 (CO1) untuk amplifikasi sampel produk ekstraksi.
4. Percobaan ini didapatkan hasil KT03-02 Amplification (-) Negatif, Tidak Ada Bent DNA, dan Sedangkan KT05-01 Amplification (+) Positif, Ada Bent DNA.
5. Elektroforsis DNA gel merupakan sebuah metode untuk memisahkan molekul DNA berdasarkan ukurannya.
5.2 Saran
Saran saya yaitu buat kak nanda, ijin memberi saran kak, pada saat menjelaskan/mendikte materi jangan terburu buru. Karena sangat susah untuk dipahami kak, Terima Kasih Kak Nanda sehat selalu ya kak.
13
DAFTAR PUSTAKA
Anggereini, E. (2018) Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD), Suatu Metode Analisis DNA dalam Menjelaskan Berbagai Fenomena Biologi.
Journal Iopecies, 1(2), 73–76.
Arian, P., Artika, I. M., & Falah, S. (2021). Amplification and analysis of cytochrome oxidase I of Polypedates leucomystax from Bogor Agricultural University Area. Curr Biochem, 3, 13-19.
Bramasta, R. C., Faiqoh, E., Hendrawan, I. G., Sembiring, A., & Yusmalinda, N. L.
A. (2021). Identifikasi Hiu Yang Diperdagangkan Di Bali Menggunakan Metode DNA Barcoding dan Analisis Filogenetik. Journal of Marine and Aquatic Sciences, 7(1), 84-93.
Fitriya, R. T., Ibrahim, M., & Lisdiana, L. (2019). Keefektifan metode isolasi DNA kit dan CTAB/NaCl yang dimodifikasi pada Staphylococcus aureus dan Shigella dysentriae. LenteraBio, 4(1), 87-92.
Hariyadi, S., Narulita, E., & Rais, M. A. (2018, October). Perbandingan Metode Lisis Jaringan Hewan dalam Proses Isolasi DNA Genom pada Organ Liver Tikus Putih (Rattusnovergicus). In Proceeding Biology Education Conference, 15(1), 689-692.
Irmawati, A. T., & Alimuddin, A. (2019). Budidaya Ikan Pari Putih (Lates calcarifer Bloch) Berbasis Ekosistem. Dokumen Kebijakan. Hal, 27.
Kurnia, N. (2020) Autentifikasi Ikan Tuna (Thunnus sp) dengan Metode Berbasis PCR- Sequencing. Institut Pertanian Bogor.
Kusuma, A. B. (2022). Optimalisasi Ekstraksi DNA Dan PCR Untuk Identifikasi Molekuler Pada 4 Jenis Karang Lunak Berbeda. Jurnal Enggano, 7(2), 175- 182.
Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., & Kim, Y. H. (2012). Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. JoVE (Journal of Visualized Experiments), (62), 1-10.
14
Lisnanti, E. F. (2020). Profil Band DNA Spermatozoa Segar dan Beku Sapi Perah Friesian Holstein. Jurnal Cendekia, 11(3), 91-101.
Novita, H., Siswoyo, T. A., & Sugiharto, B. (2017). Isolation and characterization of the expression of gene for sucrose transporter proteins in sugarcane plant (Saccharum officinarum). Jurnal Ilmu Dasar, 8(2), 118-127.
Nugroho, K., Terryana, R. T., & Lestari, P. (2019). Metode ekstraksi DNA tanaman tanpa presipitasi etanol untuk kegiatan polymerase chain reaction (PCR). Jurnal Bioteknologi dan Biosains Indonesia, 6(1), 29-38.
Sahilah, A. M., Radu, S., Lum, K. Y., & Samuel, L. (2023). Molecular typing among poultry isolates of Salmonella agona by PCR-based techniques and pulsed field gel electrophoresis (PFGE). Journal of Tropical Agriculture and Food Science, 31, 35-42.
Sari, N. F. (2021). Keragaman Genetik dan Abnormalitas Ikan Pari Putih (Lates calcarifer Bloch, 1790) Tipe Liar dan Hasil Domestikasi (Doctoral dissertation, Universitas Hasanuddin).
Zahra, R. (2022). Gambaran Konsentrasi Gel Agarosa Pada Elektroforesis DNA Bakteri Escherichia Coli (Doctoral dissertation, Universitas Bakti Tunas Husada Tasikmalaya).
15
LAMPIRAN
Lampiran 1. Analisa Data
Pada praktikum Polymerase Chain Reaction dan Elektroforesis ini tidak menggunakan Analisa Data.
Lampiran 2. Dokumentasi
Gambar 2.1 Red Master Mix Gambar 2.2 Ddh20 (Steril)
Gambar 2.3 Sample Fish F2 Gambar 2.4 Sample Fish R2
Gambar 2.5 Alat Incubator Gambar 2.6 Hasil Akhir PCR DNA
