METODE
2.1 Lokasi dan Waktu
Praktikum dilaksanakan di Laboratorium Pendidikan, Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor. Praktikum dilaksanakan pada 27 September 2023.
2.2 Alat dan Bahan
Adapun alat yang digunakan yakni cawan petri, gelar ukur, tabung reaksi, Erlenmeyer, Bunsen, jarum ose, pinset, rak tabung reaksi, gelas ukur, alumunium foil, wrap, autoclave, laminar air flow, timbangan, microwave, mikroskop, pipet tetes, spuit dan stirrer.
Adapun bahan yang digunakan yakni isolat bakteri, media NA, media King’s B, kristal violet, etanol, safranin, iodin, blood agar, tanaman tembakau, aquadest, KOH 3% dan UV transilluminator
2.3 Pengamatan morfologi koloni bakteri pada media NA, King’s B dan YDCA Pengamatan morfologi koloni bakteri dari isolat Actinomycetes, Bacillus, Burkholderia glumae, Pseudomonas fluorescens, Seratia dan Xanthomonas oryzae.
Pengamatan dilakukan untuk melihat morfologi koloni bakteri. Isolat juga dilihat di UV transilluminator bertujuan mempermudah untuk melihat dan menganalisis sampel fluoresen lebih akurat. Alat ini bekerja dengan memancarkan gelombang cahaya tertentu seperti sinar ultraviolet atau cahaya biru. Ketika sampel fluoresen diletakkan di atas transilluminator, energi dari sumber cahaya akan dieksitasi oleh pewarna fluoresen dalam sampel. Selanjutnya pewarna fluoresen akan memancarkan cahaya dengan panjang gelombang lebih tinggi yang dapat dilihat dengan jelas. Sampel yang mengandung pewarna fluoresen seperti DNA, RNA, dan protein akan terlihat.
2.4 Uji gram (positif dan negatif)
Koloni bakteri yang murni diuji reaksi gramnya, apakah termasuk bakteri gram positif atau gram negatif. Koloni bakteri diambil dari biakan murni pada medium YDCA dengan menggunakan jarum ose kemudian diletakkan diatas gelas preparat yang telah ditetesi larutan KOH 3 %. Secara teratur koloni bakteri dan larutan tersebut diaduk dengan jarum ose hingga benar-benar tercampur sambil diangkat-angkat setinggi 0,5-1 cm. Koloni yang nampak berlendir dan melekat menunjukkan adanya reaksi positif yang menunjukkan bakteri tersebut tergolong Gram Negatif (G-), dan sebaliknya yang tidak berlendir dan terlepas adalah reaksi negatif yang merupakan bakteri Gram Positif (G+) (Lelliot dan Stead, 1987)
Pengujian gram juga dilakukan dengan cara pewarnaan pada koloni bakteri yang hasilnya dilihat pada mikroskop. Uji sifat Gram menggunakan pewarnaan Gram
dilakukan dengan cara mengambil satu lup isolat bakteri yang berumur 24 jam kemudian dicampurkan dengan akuades. Hasil campuran difiksasi diatas bunsen kemudian ditetesi kristal violet selama satu menit dan dibilas dengan akuades. Setelah itu, preparat ditetesi dengan iodin lugol selama satu menit dan dibilas dengan akuades. Olesan bakteri ditetesi etanol 95% sebagai warna pemucat selama 30 detik dan dibilas kembali dengan akuades. Sebagai warna tandingan, safranin ditambahkan pada olesan bakteri selama 30 detik dan dibilas dengan akuades. Setelah itu, kaca preparat ditiriskan menggunakan kertas tisu (Schaad et al. 2001). Bentuk sel bakteri diamati menggunakan mikroskop compound dengan perbesaran 40x. Bentuk sel bakteri yang berwarna merah muda yang akan dipilih untuk pengujian selanjutnya.
2.5 Uji agar darah (khusus gram +)
Pengujian hemolisis digunakan untuk mengetahui isolat berpotensi patogen atau tidak baik pada manusia maupun hewan. Isolat ditumbuhkan pada media Blood Agar. Setelah diinkubasi selama 18-24 jam pada suhu ruang, apabila ada zona bening di sekeliling koloni, menunjukkan isolat berpotensi sebagai patogen.
2.6 Uji HR (hypersensitive reaction)
Uji hipersensitif ditujukan untuk mengetahui apakah isolat bakteri yang diperoleh bersifat patogenik atau apatogen. Suspensi bakteri dengan kerapatan ± 108 cfu/ml diinfiltrasikan ke dalam jaringan daun tembakau secara perlahan-lahan sehingga suspensi menempel menyebar di dalam jaringan hingga batas urat-urat daun.
Gejala water soaked symptom (seperti terendam air) akan terlihat setelah diinkubasi selama 24 jam dinyatakan positif. Percobaan diulang dua kali. Sebagai kontrol digunakan air suling.
