MIKROBIOLOGI UMUM
PENGHITUNGAN JUMLAH MIKROBA
Oleh:
Muhamad Bahrul Hikam (245021111003)
JURUSAN TEKNOLOGI PANGAN DAN HASIL PERTANIAN FAKULTAS PERTANIAN
2025
A. PENDAHULUAN
Mikroba Sebagai organisme mikroskopis memainkan peran vital dalam berbagai aspek kehidupan, seperti proses biogeokimia, kesehatan manusia, dan industri. Salah satu langkah penting untuk memahami interaksi mikroba dengan lingkungan dan efeknya terhadap kesehatan adalah menghitung berapa banyak mikroba yang ada dalam sampel seperti air, tanah, dan produk pangan.
Menghitung jumlah mikroba dapat dilakukan dengan berbagai cara. Beberapa di antaranya adalah hemasitometer, penghitungan total gelas/Total Plate Count (TPC), dan metode paling mungkin angka/Most Probable Number (MPN).
Setiap metode memiliki fitur yang berbeda, yang berdampak pada akurasi dan keandalan hasil penghitungan (Ardiansyah, 2015). Dua metode utama dapat digunakan untuk menghitung jumlah mikroba dalam praktikum yaitu secara langsung atau tidak langsung. Metode langsung, misalnya dengan hemasitometer, memungkinkan penghitungan sel mikroba yang akurat. Metode tidak langsung, misalnya Total Plate Count (TPC), menghitung jumlah koloni yang tumbuh pada media agar dan Most Probable Number (MPN) menghitung konsentrasi mikroorganisme yang layak hidup dalam sampel dengan mereplikasi pertumbuhan kaldu cair dalam diluisi sepuluh kali lipat (Majid et al., 2020). Ketiganya sangat bermanfaat untuk analisis mikrobiologi dan pengujian kualitas produk.
Hemasitometer adalah alat yang digunakan untuk melakukan perhitungan sel secara cepat dan akurat, contoh metode langsung yang memungkinkan penghitungan sel mikroba secara akurat. Hemasitometer digunakan untuk menghitung jumlah sel dalam suatu sampel dengan melihat sel mikroba hidup di bawah mikroskop. Metode ini sangat sensitif karena hanya dapat menghitung sel mikroba yang hidup, sehingga memberikan estimasi yang lebih tepat tentang kepadatan mikroba dalam sampel. Metode ini sangat berguna dalam industry (Vembadi et al., 2019). Ruang hitung hemasitometer terdiri dari 9 kotak besar dengan luas 1 mm², di mana satu kotak besar dibagi menjadi 25 kotak sedang dan setiap kotak sedang dibagi lagi menjadi 16 kotak kecil. Dengan demikian, satu kotak besar dapat berisi 400 kotak kecil. Penghitungan kepadatan sel mikroorganisme dilakukan dengan mengamati Hemasitometer setelah sampel ditempatkan di dalamnya (Muliyah et al., 2020).
Gambar 1. Alat Hemasitometer
Sebaliknya, metode tidak langsung seperti Total Plate Count (TPC) dan Most Probable Number (MPN) juga digunakan secara luas untuk menghitung jumlah mikroba. TPC bergantung pada koloni mikroba yang berkembang biak dalam media agar. Prinsip dasar metode ini adalah bahwa koloni mikroba yang hidup dapat dihitung dengan mata telanjang. Metode ini memungkinkan estimasi jumlah mikroba dalam sampel yang lebih mudah dan efektif. Namun, metode ini memerlukan pengenceran jika jumlah koloni terlalu padat. Jumlah koloni yang tumbuh harus antara 30 dan 300 koloni per cawan, dan hasilnya dianggap sah (john. G et al., 1994). TPC sering digunakan untuk menguji keamanan produk makanan dan minuman. Metode hitungan cawan dapat dilakukan dengan menggunakan metode tuang (pour plate) dan metode permukaan (surface/spread plate). Penghitungan jumLah mikroba dianggap valid jika dalam satu cawan tumbuh koloni sebanyak 30-300, sehingga jika pertumbuhan mikroba terlalu padat, maka harus dilakukan pengenceran terlebih dahulu (Muliyah et al., 2020). JumLah koloni dihitung dengan rumus:
Koloni per mL (cfu/mL) = JumLah koloni x (1/FP) Dimana:
FP = Faktor pengenceran
FP = pengenceran awal x pengenceran selanjutnya x jumLah yang ditumbuhkan (volume yang dimasukkan dalam cawan petri (0,1 mL atau 1 mL)
Metode paling mungkin angka (MPN) adalah metode lain yang umum digunakan untuk memperkirakan konsentrasi mikroorganisme dalam sampel, terutama dalam pengujian kualitas air. MPN bergantung pada replikasi pertumbuhan mikroba dalam media cair dan dapat menunjukkan keberadaan bakteri koliform, yang merupakan indikator kontaminasi fekal. Adanya bakteri koliform dalam air dapat menunjukkan bahaya bagi kesehatan manusia, sehingga pengujian ini (Hryniszyn et al., 2013).
Manfaat praktikum ini adalah untuk mempelajari berbagai metode untuk menghitung jumlah sel mikroba, seperti hemasitometer, TPC, dan MPN.
Diharapkan bahwa pemahaman dan penerapan metode ini akan meningkatkan pengetahuan dan keterampilan analisis mikrobiologi. Hasil praktikum ini juga
dapat membantu pengujian kualitas air dan produk pangan, yang pada akhirnya dapat membantu kesehatan masyarakat dan keberlanjutan lingkungan. Dengan menghitung jumlah mikroba yang tepat, kita dapat lebih memahami peran mikroba dalam ekosistem dan dampaknya terhadap kesehatan manusia.
B. TUJUAN
Mengetahui berbagai metode penghitungan jumLah sel mikroba C. PROSEDUR PRAKTIKUM
1. Penghitungan mikroba dengan Hemasitometer Alat dan Bahan:
▪ Akuades steril
▪ Alkohol 70%
▪ Mikroskop
▪ Pipet
▪ Tabung reaksi steril
▪ Tissue
▪ Yeast (Saccharomyces cerevisiae)
Cara Kerja:
a. Bersihkan hemasitometer dan gelas penutupnya (coverslip) dengan menggunakan larutan deterjen, bilas dengan akuades lalu bersihkan lagi dengan alkohol, kering anginkan atau tempelkan lap atau pengering berbahan lembut (jangan menggunakan tisu dengan serat yang kasar karena akan menggores kotak-kotak hemasitometer)
b. Letakkan hemasitometer beserta gelas penutupnya pada mikroskop, cari kotak-kotak (ruang pengamatan) yang ada di hemasitometer dengan menggunakan perbesaran lemah terlebih dahulu, jika sudah berhasil menemukan, dilanjutkan perbesaran yang lebih kuat. Tentukan 5 kotak pengamatan yang akan dihitung (umumnya dipilih kotak ukuran sedang pada pojok kanan atas, kanan bawah, kiri atas, kiri bawah dan tengah) c. Encerkan sampel yeast hingga pengenceran 10-3
d. Homogenkan suspensi mikroba (bakteri/yeast) yang akan dihitung jumLah selnya dengan vortex
e. Ambil sampel mikroba pipet steril dari media cair secukupnya (0,1-0,5 mL) lalu masukkan ke dalam parit-parit pada hemasitometer (jangan sampai berlebihan). Perhatikan / cari kembali kotak-kotak pengamatan f. Amati dengan mikroskop dimulai dengan pembesaran terkecil
g. Hitunglah kerapatan sel dengan rumus sebagai berikut:
C = 𝑡 𝑥 𝑑 𝑥106 𝑛 𝑥 0,25 Dimana
C : adalah kerapatan sel mikroba (sel/mL) t : adalah jumLah sel yang dihitung.
d : adalah faktor pengenceran.
n : adalah jumLah kotak besar yang dihitung.
0.25 : adalah faktor koreksi untuk menghitung sel dalam 1 mm².
106 : adalah konversi ke satuan sel per mililiter 2. Uji MPN
Alat dan Bahan
▪ Sampel air keran, air selokan, air kolam sebanyak 100mL
▪ Tabung reaksi steril
▪ Akuades steril
▪ Pipet steril
▪ Tabung durham
▪ Lampu spirtus
▪ Alkohol 70%
▪ Media lactose broth steril Cara kerja:
a. setiap sampel air membutuhkan 15 tabung reaksi yang masing-masing berisi 10 mL kaldu laktosa (Lactose broth) dan sebuah tabung durham yang terbalik yang telah disterilisasi terlebih dahulu
b. Selanjutnya, 5 buah tabung berisi kaldu laktosa diisi dengan 10 mL air sampel A, 5 buah lainnya diisi dengan 1 mL air sampel B, dan sisanya diisi dengan 0,1 mL air sampel C
c. Seluruh tabung diinkubasi pada suhu 37 oC selama 24 jam. Apabila terdapat bakteri koliform, maka akan terbentuk gas di dalam tabung durham. Jika tidak ada tabung yang menunjukkan hasil positif, maka inkubasikan kembali selama 48 jam.
d. Bandingkan jumLah tabung yang memberikan reaksi positif dengan tabel standar (Gambar 14) dan catat jumLah bakteri yang hadir di dalamnya.
Penghitungan MPN juga dapat dilakukan tanpa tabel dengan menggunakan Thomas formula (Thomas, 1948) sebagai berikut
D. HASIL DAN PEMBAHASAN
Dua metode utama yang kami gunakan dalam praktikum ini adalah uji hemacytometer dan uji Most Probable Number (MPN). Uji hemacytometer menghitung jumlah sel mikroba secara langsung dengan bantuan bilik hitung khusus dan mikroskop, sedangkan uji MPN merupakan perkiraan jumlah mikroba berdasarkan kemungkinan pertumbuhan dalam media yang dipilih.
1. Penghitungan Mikroba dengan Hemasitometer
Dalam praktikum ini, kami menggunakan metode hemacytometer untuk menghitung jumlah mikroba. Metode ini bekerja dengan meneteskan
Gambar 2. Tabel MPN Index
sampel mikroba ke dalam bilik hitung yang telah dikalibrasi, kemudian mengamati dan menghitung jumlah sel yang terlihat dalam kotak- kotak hitungan di bawah mikroskop.
Namun, kami kesulitan menemukan mikroba pada pengamatan mikroskop selama pengamatan. Mikroba yang seharusnya terlihat seperti titik-titik kecil yang tersebar di dalam kotak hitungan tidak dapat ditemukan meskipun telah mencoba selama beberapa menit. Karena masalah ini, asisten praktikum kemudian memberikan kuis yang menunjukkan berapa banyak mikroba yang telah diketahui, dan kami diminta untuk menghitungnya menggunakan rumus dan jumlah mikroba yang telah ditentukan (perhitungan spora).
Diketahui:
n = 5x16 = 80 t = 30
d = 103
Ditanyakan:
C?
Dengan rumus:
C= 𝑡 𝑥 𝑑 𝑥 106 𝑛 𝑥 0,25 = 30 x 103 x 106 80 x 0,25 = 30 x 103 x 106 20
= 1,5 x 103 x 106 = 1,5 x 103 sel/mL
Dari pengalaman dan contoh perhitungan tersebut, selanjutnya untuk mengetahui hasil praktikum, asisten praktikum memberikan informasi tentang perhitungan spora yang telah diberikan, seperti data berikut:
▪ Kotak A: 3
▪ Kotak B: 2
▪ Kotak C: 5
▪ Kotak D: 7
▪ Kotak E: 10
Dari data ini, kami melakukan perhitungan menggunakan metode hemacytometer, dan hasilnya disajikan di bawah ini.
Diketahui:
Kotak A: 3 Kotak B: 2 Kotak C: 5 Kotak D: 7 Kotak E: 10
n = 5x16 = 80 Ditanyakan:
t?
C?
Jawabannya:
t = A+B+C+D+E = 3+2+5+7+10 = 27
C= 𝑡 𝑥 𝑑 𝑥 106 𝑛 𝑥 0,25 = 27 x 106 80 x 0,25 = 27 x 106 20
= 1, 35 x 106 sel/mL
*nilai d tidak ada karena sampel perhitungan diambil dari suspensi tanpa pengenceran
Pembahasan untuk penghitungan mikroba dengan hemasitometer yaitu bahwasannya metode hemacytometer menggunakan bilik hitung terkalibrasi untuk menempatkan sampel mikroba. Kemudian, menggunakan rumus yang menghitung pengenceran, volume, dan jumlah sel rata-rata per kotak, jumlah sel dihitung secara visual di bawah mikroskop (Febrilianti, 2023). Namun, dalam praktikumini, mikroba/spora tidak teramati pada mikroskof meski sudah mencobanya selama beberapa menit, tapi tetap tidak teramatai/ tidak terlihat. Beberapa faktorkemungkinan yang menyebabkan ini terjadi:
1) Konsentrasi sampel terlalu rendah akibat pengenceran berlebihan atau kepadatan awal mikroba di bawah batas deteksi hemacytometer (10⁴ sel/ml) (Andryukov et al., 2020).
2) Teknik preparasi kurang tepat, seperti ketidakhomogenan sampel atau kesalahan pengisian bilik hitung yang menyebabkan sel tidak tersebar merata (Malyshev et al., 2024).
3) Ukuran mikroba/spora yang terlalu kecil (<2 µm) sehingga sulit dibedakan dari debris tanpa pewarnaan atau mikroskop fase kontras, serta (Chen et al., 2024).
4) Kesalahan pengaturan mikroskop (fokus, kontras cahaya) (Górny, 2020).
Menurut penelitian ilmiah (Vembadi et al., 2019), hemacytometer tidak bekerja dengan baik untuk sel bakteri kecil jika tidak menggunakan metode tambahan seperti pewarnaan atau fase kontras. Selain itu, kesalahan teknis seperti overdilution sering terjadi. Hasil ini menunjukkan betapa
pentingnya perbaikan prosedur, seperti penggunaan pewarna (metilen biru), validasi pengenceran, atau penggabungan metode MPN untuk sampel berkepadatan rendah, agar data yang dihasilkan akurat dan representative (Sharma et al., 2023).
Jadi, faktor teknis seperti pengenceran dan persiapan sampel serta metode hemacytometer yang terbatas untuk sel kecil menyebabkan mikroba tidak dapat diamati dalam praktikum. Meskipun hasil ini sejalan dengan literatur, untuk meningkatkan akurasi diperlukan penyesuaian protokol seperti pewarnaan dan fase kontras. Meskipun uji MPN hanya memberikan estimasi statistik, dapat menjadi alternatif untuk sampel dengan kepadatan rendah.
2. Uji Most Probable Number (MPN)
Dalam praktikum kedua setelah perhitungan mikroba dengan metode hemasitometer ini, kami melanjutkan praktikum menggunakan metode Most Probable Number (MPN) untuk menghitung jumlah mikroba dalam sampel. Metode MPN ini bekerja dengan memasukan sampel air keran dan kolam ke dalam media cair yang telah disiapkan dalam tabung-tabung seri pengenceran, kemudian menginkubasinya selama 24 jam. Setelah inkubasi, pertumbuhan mikroba diamati berdasarkan terbentuknya gelembung gas dalam tabung, yang menunjukkan adanya aktivitas fermentatif dari mikroba yang tumbuh. Namun, hasil menunjukan kesalahan atau anomaly karena tidak adanya gelembung gas. Data hasil uji/metode Most Probable Number (MPN) disajikan dalam tabel berikut:
Tabel 1, Hasil uji MPN
Sampel
Jumlah Tabung Positif
5 Tabung Indeks
MPN per 100 ml
Gambar 10 mL
Air Positif
1 mL Air Sampel
0,1 mL Air Sampel
Air
Kolam 0 0 0 0 <2
Gambar 3. Hasil akhir sampel air kolam setelah di inkubasi selama 24 jam
Air
Keran 0 0 0 0 <2
Metode Most Probable Number (MPN) menggunakan beberapa sampel yang diencerkan (seperti air keran atau kolam) ke dalam media cair yang dipilih. Kemudian, sampel diinkubasi selama 24 jam untuk mengukur pertumbuhan mikroba melalui indikator seperti gelembung gas dalam tabung Durham yang menunjukkan aktivitas fermentasi (Listi et al., 2022).
Namun, dalam praktikum ini, gelembung gas dalam tabung reaksi tidak terlihat, diduga karena beberapa factor yang mempengaruhi diantaranya:
1) Konsentrasi mikroba terlalu rendah, terutama pada air keran yang mungkin mengandung klorin penghambat pertumbuhan (Lechevallier et al., 1996).
2) Media tidak kompatibel dengan mikroba target (misal, bakteri non- fermentatif tidak menghasilkan gas (Raharja, 2015).
3) Kesalahan teknis seperti inkubasi terlalu singkat (24 jam kurang untuk mikroba lambat tumbuh), tabung durham rusak, atau suhu inkubasi tidak optimal (Adolph, 2016).
4) Mikroba tidak viable akibat kondisi lingkungan (Oliver, 2010).
Menurut penelitian (Clesceri et al., 1990), MPN berfungsi dengan baik untuk sampel berkepadatan rendah. Namun, untuk meningkatkan ketepatan sampel, perlu ditambahkan indikator tambahan (phenol red) dan media yang dipilih (misalnya, lauryl tryptose broth untuk koliform).
Hasil praktikum tidak konsisten/ menyimpang karena inkubasi 24 jam tidak cukup untuk mikroba, meskipun Sharma et al., (2023) menyarankan 48–72 jam. Selain itu, sebelum uji, air keran harus dibersihkan dari klorin dengan menggunakan natrium tiosulfat. Hasilnya adalah bahwa kombinasi faktor teknis dan biologis menyebabkan ketiadaan gelembung gas. Oleh karena itu, disarankan untuk menggunakan media selektif, memperpanjang inkubasi, dan menggabungkan metode MPN dengan uji konfirmasi (subkultur) atau metode alternatif seperti membran filtrasi untuk sampel berkonsentrasi sangat rendah (Vembadi et al., 2019).
Jadi, dalam uji MPN, tidak munculnya gelembung gas dapat disebabkan oleh sejumlah faktor. Ini termasuk kepadatan mikroba yang rendah (terutama pada air keran), media yang tidak ideal, atau kesalahan
Gambar 4. Hasil akhir sampel air keran setelah di inkubasi selama 24 jam
teknis (inkubasi yang singkat atau tabung Durham yang tidak berfungsi) (pradhika, 2019). Menurut penelitian literatur, metode MPN memiliki sensitivitas yang terbatas dan bergantung pada kondisi pertumbuhan mikroba. Untuk meningkatkan akurasi, disarankan untuk menggunakan media yang lebih selektif (seperti larutan tryptose Lauryl untuk koliform), memperpanjang inkubasi hingga 48 jam, dan menambahkan indikator pertumbuhan sebagai alternatif.
E. KESIMPULAN
Kesimpulannya praktikum ini berhsil menunjukan dua metode utama untuk menghitung jumlah mikroba, hemasitometer dan Most Probable Number (MPN). Meskipun hemasitometer memberikan hasil yang tidak konsisten karena kesulitan untuk mengamati mikroba, hal ini menunjukkan bahwa teknik preparasi dan pengenceran yang tepat sangat penting. Sebaliknya, metode MPN memberikan hasil yang tidak memuaskan, mungkin karena konsentrasi mikroba yang rendah dan ketidakcocokan media. Oleh karena itu, disarankan untuk menerapkan prosedur yang lebih baik, seperti menambah indikator pertumbuhan dan memperpanjang waktu inkubasi, untuk meningkatkan akurasi penghitungan mikroba.
DAFTAR PUSTAKA Adolph, R. (2016). bakteriologi.
Andryukov, B. G., Karpenko, A. A., & Lyapun, I. N. (2020). Learning from nature:
Bacterial spores as a target for current technologies in medicine. Sovremennye
Tehnologii v Medicine, 12(3), 105–122.
https://doi.org/10.17691/stm2020.12.3.13
Ardiansyah, D. (2015). Laporan Tetap Perhitungan Mikroba.
Chen, Z., Lu, Y., Cui, J., Feng, Y., Dong, H., Huang, X., Zhu, C., Xiong, X., Chen, H., Wang, Q., & Liu, G. (2024). Monitoring of Bacillus spore-forming dynamics through flow cytometry. Frontiers in Microbiology, 15(October), 1–9. https://doi.org/10.3389/fmicb.2024.1450913
Clesceri, L. S., Greenberg, A. E., & Trussell, R. R. (1990). Standard methods for the examination of water and wastewater: Washington DC, American Public Health Association. In Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, American Public Health Association.
Febrilianti, A. (2023). PERHITUNGAN MIKROORGANISME DENGAN
HAEMOCYTOMETER. Scribd.
https://www.scribd.com/document/711876970/Perhitungan- Mikroorganisme-dengan-Haemocytometer
Górny, R. L. (2020). Microbial aerosols: Sources, properties, health effects, exposure assessment—A review. KONA Powder and Particle Journal, 37(37), 64–84. https://doi.org/10.14356/kona.2020005
Hryniszyn, A., Skonieczna, M., & Wiszniowski, J. (2013). Methods for Detection of Viruses in Water and Wastewater. Advances in Microbiology, 03(05), 442–
449. https://doi.org/10.4236/aim.2013.35060
john. G, H., noel. R, K., PETER H.A, S., james. T, S., & stanley. T, W. (1994).
Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology.
https://books.google.co.id/books?hl=id&lr=&id=jtMLzaa5ONcC&oi=fnd&
pg=PA1&dq=Holt,+J.+G.+et+al.+(1994).+%22Bergey%27s+Manual+of+D eterminative+Bacteriology.%22+Williams+%26+Wilkins.&ots=Hs9Tc5iRo i&sig=Zac0MQ2S3HelqyPkNqJQa3AAz-
E&redir_esc=y#v=onepage&q&f=fa
Lechevallier, M. W., Welch, N. J., & Smith, D. B. (1996). Full-scale studies of factors related to coliform regrowth in drinking water. Applied and Environmental Microbiology, 62(7), 2201–2211.
https://doi.org/10.1128/aem.62.7.2201-2211.1996
Listi, R., Kasasiah, A., & Saula, L. S. (2022). Identifikasi Cemaran Bakteri Coliform dan Escherichia coli Pada Jamu Gendong Dengan Metode Most Probable Number (MPN) di Karawang Timur. Indobiosains, 4(2), 54.
https://doi.org/10.31851/indobiosains.v4i2.8326
Majid, A., Ajizah, A., & Amintarti, S. (2020). Panduan Mikrobiologi Umum.
Mikrobilogi Umum, 1–41.
Malyshev, D., Lee, C. C., & Andersson, M. (2024). Evaluating Bacterial Spore Preparation Methods for Scanning Electron Microscopy. Microscopy and Microanalysis, 30(3), 564–573. https://doi.org/10.1093/mam/ozae037
Muliyah, P., Aminatun, D., Nasution, S. S., Hastomo, T., & Setiana Sri Wahyuni Sitepu, T. (2020). MODUL PRAKTIKUM MIROBIOLOGI UMUM. Journal GEEJ, 7(2).
Oliver, J. D. (2010). Recent findings on the viable but nonculturable state in pathogenic bacteria. FEMS Microbiology Reviews, 34(4), 415–425.
https://doi.org/10.1111/j.1574-6976.2009.00200.x
pradhika, indra. (2019). kesalahan umum metode MPN.
Laboratoriumstandar.Com.
https://laboratoriumstandard.com/2019/04/19/kesalahan-umum-metode-mpn Raharja, Z. T. (2015). Identifikasi Eschericchia coli pada air minum isi ulang dari
depot air minum di kelurahan pisangan dan cirendeu tahun 2015. Fakultas Kedokteran Dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Sarif Hidayatullah, Jakarta.
Sharma, M., Agarwal, S., Agarwal Malik, R., Kumar, G., Pal, D. B., Mandal, M., Sarkar, A., Bantun, F., Haque, S., Singh, P., Srivastava, N., & Gupta, V. K.
(2023). Recent advances in microbial engineering approaches for wastewater treatment: a review. Bioengineered, 14(1), 2184518.
https://doi.org/10.1080/21655979.2023.2184518
Vembadi, A., Menachery, A., & Qasaimeh, M. A. (2019). Cell Cytometry: Review and Perspective on Biotechnological Advances. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology, 7(JUN). https://doi.org/10.3389/fbioe.2019.00147
