I. PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Mikroorganisme memiliki peran penting dalam kehidupan, baik yang menguntungkan maupun yang merugikan. Pada bidang mikrobiologi, penggunaan media kultur dan teknik sterilisasi sangat penting untuk memastikan keberhasilan dalam proses isolasi, identifikasi, dan karakterisasi mikroorganisme. Media kultur adalah bahan dasar untuk pertumbuhan mikroorganisme yang memberikan nutrisi yang diperlukan untuk mendukung pertumbuhan mikroba tertentu. Sementara itu, teknik sterilisasi diperlukan untuk menjaga kemurnian media dan menghindari kontaminasi.
Pengujian mikrobiologi seperti ALT (Angka Lempeng Total) dan AKK (Angka Kuman Koliform) adalah metode yang sering digunakan dalam pengujian keamanan dan kualitas air, makanan, serta lingkungan. ALT membantu mengukur jumlah total mikroorganisme yang ada pada suatu sampel, sedangkan AKK mengidentifikasi keberadaan bakteri koliform yang dapat menjadi indikator pencemaran.
Selain itu, pewarnaan gram adalah teknik pewarnaan dasar dalam mikrobiologi untuk membedakan jenis bakteri berdasarkan struktur dinding selnya, yaitu gram positif dan gram negatif. Pewarnaan ini sangat membantu dalam proses identifikasi bakteri, terutama dalam studi mengenai bakteri koliform, yang merupakan indikator utama pencemaran sanitasi.
1.2 Rumusan Masalah
1. Bagaimana cara pembuatan media kultur yang efektif untuk berbagai jenis mikroorganisme?
2. Mengapa sterilisasi penting dalam proses isolasi dan identifikasi mikroorganisme?
3. Bagaimana metode ALT dan AKK dapat digunakan untuk mengukur kualitas sampel, seperti air dan makanan?
4. Apa peran pewarnaan gram dalam proses identifikasi bakteri?
5. Mengapa koliform digunakan sebagai indikator pencemaran dalam pengujian mikrobiologi?
1.3 Tujuan dan Manfaat Tujuan
1. Mengetahui cara pembuatan dan penggunaan media kultur yang sesuai untuk pertumbuhan mikroorganisme.
2. Memahami pentingnya proses sterilisasi dalam pengujian mikrobiologi.
3. Mengidentifikasi metode pengujian ALT dan AKK sebagai indikator mikrobiologi dalam pengujian keamanan pangan dan air.
4. Mempelajari teknik pewarnaan gram untuk mengidentifikasi jenis bakteri.
5. Menjelaskan peran bakteri koliform sebagai indikator pencemaran dalam studi mikrobiologi lingkungan.
Manfaat
1. Memperoleh pengetahuan tentang metode dan teknik dasar dalam mikrobiologi, yang berguna untuk analisis dan pengujian laboratorium.
2. Meningkatkan pemahaman mengenai pentingnya sterilisasi untuk menjaga keakuratan hasil uji mikrobiologi.
3. Mendapatkan informasi mengenai standar keamanan pangan dan air melalui pengujian ALT dan AKK.
4. Memahami klasifikasi bakteri berdasarkan struktur dinding selnya, yang penting untuk pengembangan antibiotik dan pengobatan infeksi.
5. Memberikan dasar pengetahuan untuk mengidentifikasi sumber pencemaran lingkungan, terutama yang berkaitan dengan keberadaan bakteri koliform.
II. TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Alat Laboratorium Tabel 1. Alat Laboratorium
No Alat Fungsi
1. Mikroskop cahaya
Fungsi untuk melihat Sel mikroba yang tidak dapat dillhat mata telanjang,mikroskop cahaya dapat digunakan untuk mengidentifikasi / melihat objek mikroskopis Rohan Sangameswaram et all. 2018.
2. Incubator Fungsi untuk mengingkubasi mikroba, mengembangbiakan mikroorganisme kada suhu terkontrol. Incubator dibutuhkan untuk menginkubasi suatu bakteri agar dapat hidup Pada suatu medid atau Substrat Berlianto Cahyadi. et all.
2019
3. Hot plate/ Stirrer Fungsi untuk menghomogenkan suatu larutan Pengadukan. Hot Plate/stirrer merupakan alat untuk mencampur suatu zat dengan zat lainnya agal bersifat homogen. Kurirawali Nanalig. et al 2018.
4. Autoclave Fungsi untuk mensterlikan berbagai macam alat dan bahan menggunakan uap air panas bertekanan.
Autoclave merupakan alat pemanas tertutup yang digunakan untuk mengsterilisasikan suatu instrument bedah menggunakan bar dengan suhu 121°c dan tekanan 1,1 bar selama kurang 15 menit D.F Hartono, et al 2018.
5. Coloni counter Fungsi untuk menghitung jumlah koloni mikroba.
Perhitungan koloni bakteri adalah cara yang dilakukan untuk mengetahui Jumlah koloni bakteri
yg terdapat pada suatu media. Rosmania et 41. 2020.
6. Mikropipet Mikkropipet merupakan Piranti yang lebih cepat untuk memindahkan cairan dengan volume 0.1 ml.
dan 1.0 ml. waktu pengukuran antara Pipet Ukur glasfirm Pi Pump dan tip menunjukan hasil yang berbeda secara signifikan karena pada pengujian nilai sigma kurang 05. Budrarti retni et al. 2019.
7. Mortar dan alu Fungsi mortar dan alu adalah untuk menghancurkan atau menghaluskan bahan padat menjadi serbuk atau bentuk yang lebih kecil.
8. Pipet ukur Fungsi pipet ukur adalah untuk mengambil dan mengukur volume larutan dengan ketelitian tinggi.
Pipet ukur merupakan alat laboratorium yang berguna untuk memindahkan cairan dalam jumlah yang tepat.
9. Beaker glass Fungsi beaker glass sebagai penampung sample / bahan sementara, atau bisa digunakan sebagai penyimpan zat sementara
10. Gelas ukur Gelas ukur berfungsi untuk mengukur volume cairan dengan ketelitian yang cukup tinggi. Gelas ukur memiliki bentuk silinder dan dilengkapi dengan skala pengukuran. Setiap garis penanda pada gelas ukur menunjukkan jumlah cairan yang telah terukur.
11. Jarum ose Jarum ose atau jarum inokulum berfungsi untuk memindahkan atau mengambil koloni mikrobiologi ke media baru. Jarum ose terbuat dari logam seperti kawat nichrome atau platinum.
12. Timbangan triple beam
Timbangan triple beam atau neraca tiga balok berfungsi untuk mengukur massa atau berat suatu objek dengan tepat. Timbangan ini merupakan salah satu peralatan laboratorium yang digunakan untuk mengukur massa objek kecil, dengan berat tidak
lebih dari 610 gram.
13. Oven tangkring Fungsi oven tangkring adalah untuk memanggang berbagai jenis makanan, seperti roti, kue, ikan, dan ayam. Oven tangkring merupakan peralatan masak tradisional yang terintegrasi dengan kompor, sehingga juga disebut sebagai oven kompor.
14. Oven Memmert Oven Memmert merupakan perusahaan yang berasal dari Jerman. Alat laboratorium oven merupakan salah satu alat laboratorium yang penting, fungsinya untuk memamaskan atau mengeringkan alat-alat laboratorium atau objek-objek lainnya.
15. Corong Corong berfungsi sebagai alat bantu untuk menuangkan cairan dari suatu tempat ke tempat lainnya, seperti menuangkan bahan bakar ke dalam jeriken. Dengan demikian, cairan yang dituangkan tidak akan tumpah.
16. Objek glass Fungsi objek glass adalah untuk meletakkan objek atau benda yang akan diamati di bawah mikroskop.
Objek glass juga dikenal sebagai microscope slide glass atau kaca preparat.
17. Cover glass Fungsi cover glass atau kaca penutup adalah untuk menjaga spesimen padat tetap datar dan sampel cair menjadi lapisan datar. Hal ini diperlukan karena mikroskop resolusi tinggi memiliki wilayah fokus yang sangat sempit.
2.2 Media dan Sterilisasi
Media kultur adalah campuran nutrisi yang dirancang untuk mendukung pertumbuhan mikroorganisme dalam berbagai penelitian mikrobiologi dan bioteknologi. Media kultur memainkan peran penting dalam penelitian karena memberikan lingkungan yang sesuai untuk pertumbuhan, pengamatan, dan analisis mikroorganisme. Media ini dapat berupa media padat, cair, atau semi-padat,
tergantung pada jenis mikroorganisme yang ingin ditumbuhkan serta tujuan penelitian. Bahan utama dalam media kultur biasanya meliputi sumber karbon, nitrogen, vitamin, mineral, dan faktor-faktor pertumbuhan yang dibutuhkan oleh mikroorganisme. Karena media kultur menyediakan lingkungan yang kaya nutrisi, media harus benar-benar steril sebelum digunakan untuk menghindari kontaminasi dari mikroba yang tidak diinginkan. Dengan menjaga media tetap steril, peneliti dapat memastikan bahwa hasil pengamatan atau eksperimen merefleksikan kondisi sebenarnya tanpa dipengaruhi oleh faktor eksternal atau kontaminasi. Rahayu Utami. et all ( 2019 )
Sterilisasi adalah proses untuk menghilangkan semua bentuk kehidupan mikroorganisme, termasuk bakteri, virus, jamur, dan spora. Di laboratorium, sterilisasi merupakan langkah penting dalam menjaga kebersihan dan keamanan alat, bahan, dan lingkungan agar hasil penelitian bebas dari kontaminan. Salah satu metode sterilisasi paling umum adalah autoclave, yang menggunakan uap bertekanan tinggi dan suhu tinggi (121°C dengan tekanan 15 psi selama 15-20 menit) untuk membunuh mikroorganisme, termasuk spora yang resisten. Selain autoclave, metode sterilisasi lainnya mencakup filtrasi, radiasi, dan sterilisasi kimia.
Filtrasi sering digunakan untuk mensterilkan larutan yang tidak tahan panas, dengan cara menyaring mikroorganisme melalui filter berpori halus. Sementara itu, metode radiasi, seperti radiasi UV atau gamma, biasanya digunakan untuk mensterilkan bahan atau alat yang juga tidak tahan panas. Autoclave tetap menjadi pilihan utama di banyak laboratorium karena efektivitasnya dalam mensterilkan media dan alat dengan cepat dan menyeluruh. Suasti Wijaya. Et al ( 2020 )
2.3 Angka Lempeng Total ( ALT )
Angka Lempeng Total (ALT) adalah metode kuantitatif yang digunakan untuk menghitung jumlah total mikroorganisme, khususnya bakteri, dalam sampel tertentu seperti air, makanan, atau lingkungan. Metode ini umum digunakan dalam mikrobiologi sebagai indikator kualitas kebersihan dan sanitasi. Prinsip dasar ALT adalah mengukur koloni bakteri yang tumbuh pada medium padat setelah masa inkubasi tertentu, biasanya pada suhu 35-37°C selama 24-48 jam (Baudart et al., 2000). Koloni yang terbentuk di permukaan lempeng dihitung secara manual atau
menggunakan perangkat otomatis, dengan setiap koloni diasumsikan berasal dari satu sel bakteri yang hidup.
Penelitian mengenai ALT telah menunjukkan bahwa metode ini efektif dalam mendeteksi kontaminasi bakteri dalam berbagai jenis sampel, terutama di industri pangan dan air. Studi oleh Eom et al. (2018) menyebutkan bahwa ALT dapat mengindikasikan tingkat kebersihan dan keberadaan mikroba dalam produk pangan, serta sangat membantu dalam memastikan keamanan pangan bagi konsumen. Selain itu, ALT digunakan sebagai metode pengawasan kualitas air di sektor kesehatan lingkungan, karena jumlah bakteri dalam air dapat menggambarkan tingkat pencemaran dan potensi risiko kesehatan (Hassen et al., 2000). Meskipun ALT adalah metode yang relatif sederhana dan ekonomis, hasilnya dapat dipengaruhi oleh kondisi lingkungan, media kultur, serta teknik inokulasi yang digunakan, yang dapat menyebabkan variasi dalam hasil (Ray &
Bhunia, 2014).
2.4 Angka Kapang khamir ( AKK )
Angka Kapang dan Khamir (AKK) merupakan metode yang digunakan untuk menghitung jumlah total kapang (jamur) dan khamir (ragi) dalam suatu sampel, seperti produk pangan, air, atau bahan mentah. Pengukuran AKK penting sebagai indikator kualitas dan keamanan pangan, khususnya dalam produk yang rentan terhadap kontaminasi jamur, seperti produk susu, buah, dan bahan dengan kadar air tinggi (Pitt & Hocking, 2009). Prinsip kerja AKK adalah menghitung koloni kapang dan khamir yang tumbuh di media spesifik setelah masa inkubasi pada suhu rendah, sekitar 25°C, selama 3-5 hari. Pengukuran ini dapat dilakukan secara manual dengan menghitung koloni yang terbentuk di permukaan media atau menggunakan alat penghitung koloni otomatis (Beuchat, 2003).
Studi mengenai AKK menunjukkan bahwa angka kapang dan khamir yang tinggi dalam produk pangan dapat menandakan adanya risiko kontaminasi mikotoksin, yaitu racun yang dihasilkan oleh beberapa jenis kapang yang berbahaya bagi kesehatan manusia (Kumar et al., 2017). AKK juga digunakan sebagai parameter mutu dalam industri pangan dan farmasi untuk memastikan produk berada dalam batas aman yang telah ditetapkan (Hocking & Pitt, 2001). Namun,
hasil AKK dapat bervariasi tergantung pada jenis media, kondisi inkubasi, dan metode yang digunakan, sehingga diperlukan standar dan pengawasan yang ketat agar hasil akurat dan dapat diandalkan (Tournas et al., 2001).
2.5 Pewarnaan Gram
Pewarnaan Gram adalah teknik pewarnaan diferensial yang digunakan untuk mengidentifikasi dan mengklasifikasikan bakteri menjadi dua kelompok utama, yaitu Gram-positif dan Gram-negatif, berdasarkan perbedaan struktur dinding sel. Metode ini pertama kali dikembangkan oleh Hans Christian Gram pada tahun 1884 dan hingga kini masih menjadi teknik dasar dalam mikrobiologi klinis untuk membantu diagnosis infeksi bakteri (Kumar et al., 2020). Pewarnaan Gram bekerja dengan mengaplikasikan serangkaian zat warna, termasuk kristal violet dan safranin, serta bahan pengikat seperti iodine. Hasil pewarnaan menunjukkan bakteri Gram-positif berwarna ungu karena dinding sel tebalnya yang mengikat kristal violet, sementara bakteri Gram-negatif berwarna merah muda akibat dinding sel tipisnya yang tidak mampu mempertahankan zat warna utama setelah proses dekolarisasi (Gupta et al., 2019).
Pewarnaan Gram tetap relevan di laboratorium karena efektifitasnya dalam identifikasi awal bakteri, terutama dalam kasus infeksi akut di mana hasil cepat sangat dibutuhkan (Kukreti et al., 2021). Studi terbaru juga mengungkapkan bahwa teknik ini berguna dalam pemilihan antibiotik awal, karena perbedaan struktur dinding sel berhubungan dengan kerentanan bakteri terhadap jenis antibiotik tertentu (Arora et al., 2020). Penelitian oleh Khan et al. (2022) menyoroti bahwa meskipun pewarnaan Gram merupakan metode yang relatif sederhana, teknik ini memiliki keterbatasan seperti ketergantungan pada kualitas sampel dan pengalaman teknisi laboratorium dalam interpretasi hasil. Selain itu, dalam beberapa kasus, modifikasi metode pewarnaan Gram telah dilakukan untuk meningkatkan akurasi pada sampel yang kompleks, seperti jaringan tubuh atau cairan klinis (Singh et al., 2023).
2.6 Koliform
Koliform adalah kelompok bakteri yang digunakan sebagai indikator kualitas air dan keamanan pangan, terutama karena keberadaannya yang sering terkait dengan kontaminasi feses manusia atau hewan. Bakteri koliform terdiri dari dua kelompok utama, yaitu koliform total dan koliform feses, yang keduanya sering digunakan untuk menilai tingkat kebersihan dan sanitasi lingkungan atau produk makanan dan minuman (Jang et al., 2020). Koliform total mencakup berbagai jenis bakteri yang dapat ditemukan di lingkungan, sedangkan koliform feses, seperti Escherichia coli, lebih spesifik sebagai indikator adanya kontaminasi feses.
Penilaian jumlah koliform, baik total maupun feses, sering dilakukan menggunakan metode MPN (Most Probable Number) atau teknik filtrasi membran, yang memungkinkan identifikasi dan estimasi jumlah bakteri dalam sampel (Zhao et al., 2021).
Studi terbaru menunjukkan bahwa kehadiran koliform dalam air atau produk pangan dapat meningkatkan risiko penyebaran penyakit gastrointestinal, yang menjadi alasan utama penerapan standar bakteriologis pada kualitas air minum dan produk pangan (Smith et al., 2020). Penelitian oleh Kumar et al. (2022) menyebutkan bahwa koliform feses, khususnya E. coli, adalah indikator yang sangat sensitif untuk mendeteksi potensi patogen dalam sampel, yang memerlukan pengendalian ketat di sektor pengolahan makanan dan air. Selain itu, metode deteksi koliform terus berkembang dengan penerapan teknologi molekuler dan biosensor, yang menawarkan hasil yang lebih cepat dan lebih sensitif dalam mendeteksi bakteri patogen dibandingkan metode konvensional (Rahman et al., 2023).
III. METODOLOGI PRAKTIKUM
3.1 Tempat dan Waktu
Praktikum ini berlangsung di Laboratorium Mikrobiologi Hasil Perikanan yang di laksanakan pada hari senin, berikut tanggal praktikumnya :
Pada tanggal 30 September 2024 pada pukul 14.00 – 18.00 WIB pengenalan alat laboratorium.
Pada tanggal 07 Oktober 2024 pukul 14.00 – 17.00 WIB praktikum mengenai media dan sterilisasi.
Pada tanggal 14 Oktober 2024 pukul 14.00 – 18.00 WIB praktikum mengenai ALT dan AKK.
Pada tanggal 21 Oktober 2024 pukul 14.00 – 17.30 WIB praktikum mengenai pewarnaan gram.
Pada tanggal 28 Oktober 2024 pukul 14.00-17.30 WIB praktikum mengenai uji koliform.
3.2 Alat dan Bahan Tabel 2. Alat
No Alat Fungsi
1 Autoclave Alat untuk sterilisasi peralatan dan media kultur menggunakan uap bertekanan tinggi dan suhu tinggi untuk membunuh mikroorganisme, termasuk spora bakteri.
2 Hot plate Alat untuk memanaskan atau menjaga suhu cairan atau bahan kimia dalam gelas beaker atau wadah lainnya pada suhu yang terkontrol.
3 Erlenmeyer Gelas berbentuk kerucut dengan leher sempit yang digunakan untuk mencampur atau
mereaksikan cairan, serta mengurangi risiko tumpahan ketika digunakan untuk pemanasan.
4 Aluminium foil Untuk menutup bagian atas tabung reaksi,Erlenmeyer,pipet.
5 Kapas Untuk menutup bagian atas tabung reaksi dan Erlenmeyer.
6 Cawan petri Wadah datar terbuat dari kaca atau plastik yang digunakan untuk menumbuhkan kultur mikroorganisme di atas media agar, serta untuk melakukan uji kultur.
7 Tabung reaksi Wadah berbentuk tabung silinder yang digunakan untuk mengaduk, memanaskan, atau mereaksikan bahan kimia dalam volume kecil, serta untuk eksperimen kimia dan biologi.
8 Mikropipet Alat untuk mengukur dan memindahkan cairan dalam volume kecil (biasanya dalam mikroliter), digunakan untuk proses pipet cairan dengan presisi tinggi.
9 Jarum ose Alat tipis dan tajam yang digunakan untuk mengambil dan memindahkan kultur mikroorganisme pada media agar.
10 Bunsen Membakar gas yang digunakan untuk menghasilkan nyala api untuk memanaskan, mensterilkan peralatan, atau memanipulasi bahan kimia dalam eksperimen.
11 Coloni counter Alat yang digunakan untuk menghitung jumlah koloni mikroorganisme yang tumbuh pada media agar setelah inkubasi, sering digunakan dalam penentuan angka koloni bakteri.
12 Incubator Alat untuk menjaga suhu dan kelembaban pada level tertentu yang dibutuhkan untuk inkubasi kultur mikroorganisme, biasanya pada suhu
sekitar 37°C.
13 Cover glass Kaca tipis yang digunakan untuk menutupi preparat mikroskop untuk menjaga agar sampel tetap stabil dan melindungi lensa mikroskop dari kontaminasi.
14 Objek glass Kaca tipis datar tempat menempatkan sampel atau preparat untuk dilihat di bawah mikroskop.
15 Pipet tetes Alat untuk mengukur dan memindahkan volume kecil cairan dalam bentuk tetesan, sering digunakan dalam eksperimen yang membutuhkan pengukuran tepat dalam jumlah kecil.
16 Mikroskop Alat optik yang digunakan untuk memperbesar objek kecil, seperti mikroorganisme, jaringan, atau sel, sehingga bisa diamati secara rinci.
17 Tabung durham Tabung kecil yang ditempatkan terbalik di dalam tabung reaksi untuk mengukur produksi gas selama fermentasi atau reaksi kimia, seperti dalam uji fermentasi.
Tabel 3. Bahan
No Bahan Fungsi
1 Akuades Air distilasi yang digunakan sebagai pelarut atau pembilas dalam berbagai eksperimen laboratorium, serta digunakan untuk mencairkan atau melarutkan bahan kimia tanpa mengandung mineral atau kontaminan.
2 NaCL Garam yang sering digunakan dalam berbagai eksperimen biologi dan kimia, termasuk untuk membuat larutan salin (saline solution) yang digunakan untuk mengencerkan sampel, menjaga keseimbangan osmotik, dan dalam pembiakan
mikroorganisme.
3 Kristal violet Pewarna dasar yang digunakan dalam prosedur pewarnaan Gram untuk memberi warna ungu pada bakteri Gram-positif. Kristal violet juga digunakan dalam pewarnaan lain untuk visualisasi mikroorganisme di bawah mikroskop.
4 Lugol Larutan iodine yang digunakan dalam prosedur pewarnaan Gram sebagai penstabil pewarna kristal violet, membantu pembentukan kompleks dengan kristal violet yang menempel pada bakteri Gram-positif. Lugol juga digunakan dalam uji mikroskopik untuk mengidentifikasi pati.
4 Alcohol Digunakan dalam proses dekolarisasi pada pewarnaan Gram untuk menghilangkan kristal violet pada bakteri Gram-negatif, serta untuk mensterilkan alat dan permukaan di laboratorium.
Alkohol juga sering digunakan dalam prosedur dehidrasi dan pengawetan sampel.
5 Safranin Pewarna sekunder yang digunakan dalam prosedur pewarnaan Gram untuk memberi warna merah atau pink pada bakteri Gram-negatif setelah proses dekolarisasi, sehingga membedakan bakteri Gram-negatif dari Gram- positif yang tetap ungu setelah pewarnaan.
6 Ikan lele Sebagai bahan untuk uji koliform
7 Terasi Sebagai bahan untuk uji ALT dan AKK
3.3 Metode Praktikum
Pada praktikum yang melibatkan media dan sterilisasi, metode yang dilakukan biasanya mencakup pembuatan media kultur, seperti media agar atau
cair, yang digunakan untuk menumbuhkan mikroorganisme. Setelah media disiapkan, sterilisasi dilakukan menggunakan autoclave untuk memastikan media bebas dari mikroorganisme yang dapat mengganggu hasil percobaan. Media yang telah disterilkan kemudian diinokulasi dengan sampel dan diinkubasi pada suhu tertentu untuk pertumbuhan mikroorganisme. Dalam praktikum yang melibatkan Angka Lempeng Total (ALT) dan Angka Kapang Khamir (AKK), prosedur yang dilakukan meliputi pengenceran sampel dan penanaman di media agar, diikuti dengan penghitungan jumlah koloni yang tumbuh setelah inkubasi, sebagai indikator jumlah mikroorganisme dalam sampel tersebut. Pada pewarnaan Gram, teknik pewarnaan dilakukan dengan menggunakan serangkaian bahan kimia seperti kristal violet, Lugol, alkohol, dan safranin untuk membedakan bakteri Gram-positif yang berwarna ungu dan bakteri Gram-negatif yang berwarna merah muda setelah proses dekolorisasi dan pewarnaan sekunder. Dalam pengujian koliform, metode yang dilakukan biasanya meliputi pengambilan sampel air atau pangan, yang kemudian diuji menggunakan metode Most Probable Number (MPN) atau filtrasi membran untuk mendeteksi keberadaan koliform, sebagai indikator adanya kontaminasi feses atau mikroorganisme patogen di dalam sampel. Semua prosedur ini penting untuk memastikan keamanan mikrobiologis dan kualitas sampel yang dianalisis.
3.4 Prosedur Praktikum 3.4.1 Media dan Sterilisasi
1. Pembuatan Media:
Siapkan bahan-bahan yang diperlukan untuk pembuatan media, seperti agar-agar, nutrisi, garam, dan air deionisasi sesuai dengan jenis media yang akan dibuat (agar padat, agar cair, atau media lainnya).
Campurkan bahan-bahan tersebut dalam wadah erlenmeyer atau beaker dan aduk rata.
Panaskan campuran media hingga mendidih untuk melarutkan agar dan bahan lainnya, lalu pastikan campuran tersebut steril dengan cara mendidihkannya beberapa menit.
2. Sterilisasi Media:
Setelah media selesai dibuat, media yang masih dalam keadaan cair atau panas disterilkan dengan menggunakan autoclave.
Autoclave diatur pada suhu 121°C dengan tekanan 15 psi dan waktu sekitar 15-20 menit untuk membunuh semua mikroorganisme yang mungkin ada pada media tersebut.
Setelah proses sterilisasi selesai, biarkan media sedikit mendingin sebelum menuangkannya ke dalam cawan petri atau tabung reaksi untuk media padat atau cair.
3. Penuangan Media:
Media yang telah disterilkan dan didinginkan sedikit dituangkan ke dalam cawan petri atau wadah lain yang sesuai, kemudian diamkan hingga media mengeras (untuk media padat).
Untuk media cair, media dituangkan ke dalam tabung reaksi dan dapat langsung digunakan untuk eksperimen.
4. Penyimpanan Media:
Media yang telah dibentuk (padat atau cair) disimpan pada suhu yang sesuai untuk mencegah pertumbuhan mikroorganisme yang tidak diinginkan sebelum digunakan. Media yang telah mengeras di cawan petri sebaiknya disimpan dalam kondisi terbalik (terbalikkan agar bagian atas tidak terkontaminasi).
5. Penggunaan Media:
Setelah media disiapkan dan disterilkan, media tersebut dapat digunakan untuk inokulasi mikroorganisme dalam eksperimen mikrobiologi. Proses inokulasi biasanya dilakukan dengan menggunakan jarum ose atau mikro pipet untuk memindahkan mikroorganisme ke permukaan media agar atau cair.
6. Inkubasi:
Setelah inokulasi, media yang berisi sampel mikroorganisme kemudian diletakkan di dalam incubator pada suhu yang sesuai untuk pertumbuhan mikroorganisme (biasanya 37°C untuk mencegah kontaminasi).
3.4.2 Angka Lempeng Total ( ALT ) 1. Persiapan Sampel:
Siapkan sampel terasi.
Lakukan pengenceran bertingkat (serial dilution) untuk mendapatkan konsentrasi mikroorganisme yang tepat dalam sampel.
2. Penanaman Sampel:
Ambil sejumlah volume sampel yang telah diencerkan menggunakan pipet, lalu inokulasi pada permukaan media agar padat (misalnya, agar nutrisi) dengan metode tusukan atau spread plate.
Titik (pour plate): Inokulasi dilakukan dengan mencampurkan sampel dengan media cair yang telah dipanaskan (tetapi tidak terlalu panas) dan dituangkan ke dalam cawan petri.
Sebar (spread plate): Inokulasi dilakukan dengan menyebarkan sampel secara merata menggunakan batang pengaduk steril.
3. Inkubasi:
Tempatkan cawan petri yang telah diinokulasi pada inkubator dengan suhu yang sesuai (biasanya 37°C untuk bakteri) selama 24- 48 jam.
4. Penghitungan Koloni:
Setelah inkubasi, hitung jumlah koloni yang terbentuk pada media agar. Koloni yang tumbuh dihitung dan dicatat sebagai Angka Lempeng Total dalam satuan koloni per ml atau gram sampel.
5.Perhitungan ALT:
Hitung jumlah koloni pada cawan yang memiliki jumlah koloni yang dapat dihitung (biasanya antara 30-300 koloni).
3.4.3 Angka Kapang Khamir (AKK) 1. Persiapan Sampel:
Siapkan sampel yang akan diuji, seperti terasi yang mungkin mengandung kapang dan khamir.
Lakukan pengenceran bertingkat (serial dilution) sampel agar memperoleh konsentrasi mikroorganisme yang tepat.
2. Penanaman Sampel:
Ambil sejumlah volume sampel yang telah diencerkan menggunakan pipet, lalu inokulasi pada permukaan media agar yang sesuai untuk kapang dan khamir, seperti media agar sabouraud atau media khusus jamur.
Gunakan metode spread plate atau pour plate untuk menanamkan sampel pada media agar.
3. Inkubasi:
Inkubasi cawan petri yang telah diinokulasi pada suhu yang sesuai untuk kapang dan khamir, biasanya pada suhu 25-30°C selama 1hari.
Lakukan pemeriksaan secara berkala untuk melihat pertumbuhan koloni kapang dan khamir.
4. Penghitungan Koloni:
Setelah masa inkubasi selesai, hitung jumlah koloni kapang dan khamir yang tumbuh pada media agar. Koloni yang terbentuk dihitung dan dicatat sebagai Angka Kapang Khamir.
5.Perhitungan AKK:
Hitung jumlah koloni yang muncul pada cawan dengan jumlah koloni yang dapat dihitung (biasanya antara 30-300 koloni).
Hitung AKK dengan rumus yang sama seperti pada ALT 3.4.4 Pewarnaan Gram
1. Persiapan Preparat:
Siapkan kaca objek dan buat lapisan tipis dari sampel bakteri yang akan diuji pada kaca objek.
Jika menggunakan kultur bakteri yang sudah ada, ambil sedikit kultur bakteri menggunakan jarum ose yang steril dan oleskan secara merata di permukaan kaca objek.
Jika menggunakan sampel cair (misalnya air atau cairan tubuh), ambil beberapa tetes dan oleskan pada kaca objek.
2. Pengeringan:
Biarkan preparat mengering dengan sendirinya pada suhu ruangan atau dengan menggunakan alat pengering (blower) dalam kondisi rendah.
3. Pemeraman dengan Kristal Violet:
Setelah preparat kering, tambahkan krystal violet (pewarna utama) ke permukaan preparat dan biarkan selama 1 menit.
Kristal violet akan menembus dinding sel bakteri, mewarnai seluruh sel bakteri.
4. Pembilasan dengan Air:
Bilas preparat dengan air mengalir untuk menghilangkan kelebihan kristal violet dari permukaan kaca objek.
5.Pemeraman dengan Lugol (Larutan Iodin):
Tambahkan Lugol (larutan iodin) ke preparat dan biarkan selama 1 menit.
Iodin akan membentuk kompleks dengan kristal violet di dalam sel bakteri, membuatnya lebih stabil di dalam dinding sel bakteri Gram- positif.
6. Dekolorisasi dengan Alkohol atau Aseton:
Tambahkan alkohol atau campuran alkohol dan aseton (dekolorisator) ke preparat sedikit demi sedikit dan diamkan selama beberapa detik (sekitar 10-20 detik).
Dekolorisasi ini akan menghilangkan warna kristal violet dari bakteri Gram-negatif yang memiliki dinding sel lebih tipis dan memungkinkan pewarna sekunder untuk menempel, sementara bakteri Gram-positif tetap mempertahankan warna ungu karena dinding sel yang lebih tebal.
7.Pembilasan dengan Air:
Bilas preparat dengan air untuk menghentikan proses dekolorisasi dan menghilangkan kelebihan alkohol.
8. Pemeraman dengan Safranin:
Tambahkan Safranin (pewarna sekunder) ke preparat dan biarkan selama 1 menit.
Safranin akan memberikan warna merah muda pada bakteri Gram- negatif yang telah kehilangan warna kristal violet setelah dekolorisasi.
9. Pembilasan dan Pengeringan:
Bilas preparat dengan air untuk menghilangkan kelebihan Safranin.
Keringkan preparat dengan hati-hati menggunakan kertas tisu atau biarkan kering secara alami.
10. Pemeriksaan di bawah Mikroskop:
Amati preparat di bawah mikroskop dengan perbesaran tinggi (100x dengan minyak pembesar) untuk melihat hasil pewarnaan.
Bakteri Gram-positif akan tampak berwarna ungu, sedangkan bakteri Gram-negatif akan tampak berwarna merah muda.
3.4.5 Koliform
1. Pengambilan Sampel:
Ambil sampel air, makanan, atau minuman yang akan diuji. Pastikan pengambilan sampel dilakukan dengan cara yang aseptik untuk menghindari kontaminasi.
Untuk sampel air, gunakan botol steril yang telah disiapkan sebelumnya. Untuk sampel makanan, lakukan pengenceran terlebih dahulu.
2. Pengenceran Serial:
Jika diperlukan, lakukan pengenceran serial sampel untuk mendapatkan jumlah koloni yang dapat dihitung. Pengenceran ini dilakukan dengan menambahkan sejumlah sampel ke dalam larutan fisiologis (saline solution) atau akuades dalam tabung reaksi, dan melakukan pengenceran bertahap (misalnya 1:10 atau 1:100).
3. Metode Most Probable Number (MPN):
Sampel yang telah diencerkan diinokulasi ke dalam tabung-tabung berisi media yang sesuai, seperti Lauryl Tryptose Broth (LTB) untuk uji koliform total dan EC Broth untuk uji E. coli.
Setiap tabung diisi dengan 10 ml LTB atau EC Broth, dan inokulasi dilakukan dengan cara menambahkan beberapa tetes sampel ke dalam tabung.
4. Metode Filtrasi Membran (Alternatif):
Sampel air dapat juga diuji menggunakan metode filtrasi membran.
Caranya, sampel air disaring melalui filter membran berpori kecil (0,45 mikron) yang akan menahan mikroorganisme.
Setelah itu, filter dipindahkan ke dalam cawan petri berisi media agar (misalnya MacConkey agar atau Endo agar) yang selektif untuk koliform dan E. coli.
Inkubasi dilakukan dengan cara membiarkan cawan petri berada pada suhu inkubasi yang sesuai (biasanya 37°C untuk koliform total dan 44,5°C untuk E. coli).
5.Inkubasi:
Inkubasi tabung-tabung yang berisi media di inkubator pada suhu yang sesuai (37°C untuk koliform total, 44,5°C untuk E. coli) selama 24-48 jam.
Pada metode MPN, akan terjadi perubahan warna atau pembentukan gas dalam tabung berdasarkan adanya pertumbuhan koliform, yang menunjukkan adanya koliform total atau E. coli.
Pada metode filtrasi membran, setelah inkubasi, koloni yang tumbuh pada filter akan dihitung untuk menentukan jumlah koliform atau E.
coli berdasarkan warna atau bentuk koloni yang terbentuk.
6. Pengamatan Koloni:
Pada MPN, jika ada gas yang terbentuk dalam tabung, itu menunjukkan adanya koliform total. Untuk E. coli, jika ada perubahan warna (misalnya, warna merah pada EC Broth), itu menunjukkan adanya koloni E. coli.
Pada Metode Filtrasi Membran, koloni yang tumbuh pada media agar dihitung. Koloni dengan karakteristik khusus, seperti warna merah pada agar MacConkey atau Endo, dapat menunjukkan adanya koliform atau E. coli.
7.Perhitungan Hasil:
Untuk MPN, perhitungan dilakukan dengan membandingkan hasil pertumbuhan koloni pada tabung dengan tabel MPN standar untuk menentukan jumlah koliform atau E. coli per 100 ml sampel.
Pada Metode Filtrasi Membran, jumlah koloni dihitung dan dikalikan dengan faktor pengenceran untuk mendapatkan jumlah koloni per 100 ml sampel.
IV. HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil
4.1.1 Angka Lempeng Total ( ALT )
1. Kelompok 1 : Tidak ada bakteri yang tumbuh 2. Kelompok 2 : 10‾¹ = 1.256
10 ² = 824⁻ 10‾³ = 138 10 ⁴ = 9⁻ 10 ⁵ = 1⁻ 3. Kelompok 3 : 10‾¹ = 11 10 ² = 0⁻ 10‾³ = 3 10 ⁴ = 7⁻ 10 ⁵ = 8⁻ 4. Kelompok 4 : 10‾¹ = TBUD
10 ² = TBUD⁻
10‾³ = 1.824 10 ⁴ = 1.544⁻ 10 ⁵ = 668⁻ 5.Kelompok 5 : 10‾¹ = 13 10 ² = 33⁻ 10‾³ = 2 10 ⁴ = 2⁻ 10 ⁵ = 4⁻ 4.1.2 Angka Kapang khamir ( AKK )
1. Kelompok 1 : Bebas bakteri
2. Kelompok 2 : 10‾¹ = 432 10 ² = 240⁻ 10‾³ = 16
3. Kelompok 3 : 10‾¹ = 5 10 ² = 3⁻ 10‾³ = 2
4. Kelompok 4 : 10‾¹ = 1.472 10 ² = 1.040⁻ 10‾³ = 552
5. Kelompok 5 : 10‾¹ = 8 10 ² = 39⁻ 10‾³ = - 4.1.3 Pewarnaan Gram
Tabel 4. Klasifikasi dan Morfologi pada bakteri dan kapang khamir
Sampel Penjelasan Gambar
ALT 1 Domain: Bacteria Filum: Actinobacteria Kelas: Actinobacteria Ordo: Propionibacteriales Famili: Propionibacteriaceae Genus: Cutibacterium
Spesies: Cutibacterium acnes
Gambar 1. Cutibacterium acnes
ALT 2 Domain: Bacteria Filum: Firmicutes Kelas: Bacilli
Ordo: Lactobacillales Famili: Lactobacillaceae
Genus: Lactobacillus Gambar 2. Lactobacillus ALT 3 Domain: Bacteria
Filum: Firmicutes Kelas: Bacilli Ordo: Bacillales Famili: Bacillaceae Genus: Bacillus
Spesies: Bacillus anthracis Gambar 3. Bacillus anthracis AKK 1 Domain: Eukarya
Kerajaan: Fungi Filum: Ascomycota Kelas: Saccharomycetes Ordo: Saccharomycetales Famili: Saccharomycetaceae Genus: Saccharomyces Spesies: Saccharomyces
cerevisiae Gambar 4. Saccharomyces
cerevisiae AKK 2 Domain: Eukarya
Kerajaan: Fungi Filum: Ascomycota Kelas: Saccharomycetes Ordo: Saccharomycetales Famili: Saccharomycetaceae
Genus: Candida Gambar 5. Candida spp
4.1.4 Koliform
Tabel 5. Hasil uji koliform
Tabung LTB A LTB A S1 10‾¹
+
Memiliki gas dan berwarna keruh
LTB A S2 10‾¹
+
Berwarna keruh saja
LTB A S3 10‾¹
+
Memiliki gas dan berwarna keruh Tabung LTB B
LTB B S1 10 ²⁻
+
Memiliki warna keruh
LTB B S2 10 ²⁻
+
Memiliki warna keruh
LTB B S3 10 ²⁻
+
Memiliki warna keruh Tabung LTB C
LTB C S1 10‾³
+
Memiliki gas dan berwarna keruh
LTB C S2 10‾³
+ M
LTB C S3 10‾³
