PROPOSAL PENELITIAN PENGEMBANGAN IPTEK (PPI)
AKTIVITAS ANTIAGREGASI PLATELET FRAKSI ETANOL, ETIL ASETAT DAN N-HEKSAN DARI EKSTRAK DAUN MURBEI
(Morus alba L.) SECARA IN VITRO
TIM PENGUSUL
Ketua : Ani Pahriyani, M.Sc., Apt. (NIDN : 0302048504) Anggota : Elly Wardani, M.Farm., Apt. (NIDN : 0322098405)
PROGRAM STUDI FARMASI FAKULTAS FARMASI DAN SAINS
LEMBAGA PENELITIAN DAN PENGEMBANGAN UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH PROF DR HAMKA
TAHUN 2018
ii
iii DAFTAR ISI
Halaman
LEMBAR PENGESAHAN... ii
DAFTAR ISI... IDENTITAS USULAN PENELITIAN... iii iv RINGKASAN... v
BAB I PENDAHULUAN... 1
BAB II KAJIAN PUSTAKA... 4
BAB III METODE PENELITIAN... 11
A. Alat dan Bahan... 11
B. Prosedur Penelitian... 11
C. Analisa Data... 13
D. Bagan Alir... 14
BAB IV BIAYA DAN JADWAL PENELITIAN... 15
A. Biaya Penelitian... 15
B. Jadwal Penelitian... 15
DAFTAR PUSTAKA... 16
LAMPIRAN... 19
iv
IDENTITAS USULAN PENELITIAN
1. Judul penelitian : Aktivitas Antiagregasi Platelet Fraksi Etanol, Etil Asetat dan n-Heksan dari Ekstrak Daun Murbei (Morus alba L.) Secara In Vitro
2. Tim Peneliti
No Nama Jabatan Bidang
Keahlian
Institusi Asal
Alokasi Waktu
(Jam/Minggu) 1. Ani Pahriyani,
M.Sc., Apt.
Ketua Pengusul
Farmakologi dan Farmasi Klinik
UHAMKA 10
2. Elly Wardani, M.Farm., Apt.
Anggota Farmakologi dan Farmasi Klinik
UHAMKA 10
3. Objek penelitian (Jenis material yang akan diteliti)
: Parameter agregasi platelet dari darah manusia secara in vitro
4. Masa Pelaksanaan : Mulai Tahun 2018, Berakhir tahun 2019 5. Usulan Biaya : Rp. 19.941.000
6. Lokasi Penelitian : Laboratorium UHAMKA 7. Instansi lain yang terlibat : Tidak ada
8. Temuan (Produk) yang ditargetkan
: Obat tradisional 9. Kontribusi mendasar
pada suatu bidang ilmu
: Farmakologi 10. Rencana Luaran yang
Menjadi Sasaran
: Prosiding Internasional 11. Rencana Luaran HKI,
buku, purwarupa
: -
v RINGKASAN
Penyakit degeneratif masih menduduki peringkat pertama penyakit di Indonesia dan bahkan di dunia. Beberapa penyakit degeneratif yang menjadi penyebab kematian tertinggi adalah gangguan kardiovaskular dan gangguan metabolisme. Pada tahun 2012 diperkirakan 17,5 juta orang meninggal karena penyakit kardiovaskular. Angka tersebut merupakan 31% dari jumlah kematian di dunia. Kematian yang disebabkan penyakit kardiovaskular tersebut, diperkirakan 7,4 juta kasus penyebabnya adalah penyakit jantung koroner dan 6,7 juta lainnya oleh stroke (WHO 2015).
Salah satu agen terapi yang digunakan dalam tatalaksana terapi penyakit kardiovaskular diantaranya menggunakan antiplatelet. Tujuan penggunaan antiplatelet adalah untuk mencegah pembentukan trombus dengan menghambat agregasi platelet sehingga mengurangi risiko terjadinya aterotrombosis. Salah satu obat antiplatelet yang paling banyak digunakan adalah aspirin. Aspirin dinilai efektif dalam mengurangi kejadian penyakit kardiovaskular seperti stroke iskemik (Sacco et al. 2006). Namun, sekitar 15%- 5% pasien dilaporkan mengalami resistensi terhadap aspirin (Alberts 2010).
Penelitian aktivitas ekstrak etanol 70% daun murbei dalam menghambat agregasi platelet pada darah manusia sehat secara in vitro menggunakan spektrofotometer(pahriyani 2017), menunjukkan bahwa ekstrak etanol daun murbei dengan konsentrasi 10 mg/mL mempunyai aktivitas antiagregasi platelet sebesar 7,299% sebanding dengan kelompok pembanding asetosal. Hasil penapisan fitokimia ekstrak daun murbei mengandung alkaloid, plavonoid, saponin, terpenoid dan triterpen. Sebagai pengembangan produk bahan alam, perlu dilakukan penelitian lanjutan mengenai aktivitas senyawa-senyawa yang terkandung di dalam daun murbei. Penelitian lanjutan dapat dilakukan dengan memisahkan senyawa- senyawa dari ekstrak etanol daun murbei berdasarkan tingkat kepolarannya.
Selanjutnya hasil fraksi dujikan kembali sebagai antiagregasi platelet.
Fraksinasi menggunakan tiga pelarut yakni etanol, etil asetat dan n-heksan.
Pengujian antiagregasi platelet yaitu dengan cara mencampurkan PRP (Platelet Rich Plasma) yang berasal dari darah manusia sehat dengan ekstrak etanol 70%
daun murbei yang kemudian diukur serapan plasmanya, lalu ditambahkan ADP (Adenosine diphosphate) dan kemudian diinkubasi pada suhu 37oC selama 20 menit menggunakan shaker, lalu ukur serapan plasmanya dengan menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 600 nm.
1 BAB I PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
Penyakit kardiovaskular merupakan penyakit yang menyerang jantung dan sistem pembuluh darah, menjadi penyebab utama kematian di dunia. Kematian yang disebabkan penyakit kardiovaskular tersebut, diperkirakan 7,4 juta kasus penyebabnya adalah penyakit jantung koroner dan 6,7 juta lainnya oleh stroke (WHO 2015). Penyakit jantung dan pembuluh darah bisa disebabkan oleh faktor genetik, perilaku atau gaya hidup, kadar lipid darah, faktor pembekuan (koagulasi), fibrinolisis darah, protein, inflamasi, dan infeksi serta imunologik. Salah satu penyebab penyakit kardiovaskular adalah agregasi platelet yang abnormal (Lindholm 2007).
Agregasi platelet adalah kemampuan platelet melekat satu sama lain di lokasi cidera vaskular untuk membentuk sumbatan dengan mensekresi adenosine diphosphat (ADP) dan tromboksan A2 (TXA2) (Babalola 2013). Agregasi platelet memiliki pengaruh penting terhadap proses terbentuknya pembekuan darah.
Namun, jika terbentuk agregasi platelet secara terus menerus, maka akan menyebabkan pembentukkan trombus dan emboli yang dapat menghambat aliran darah. Terbentuknya trombus dan emboli ini terjadi akibat bekuan darah terlepas dari perlekatannya pada dinding pembuluh darah dan mengalir secara bebas ke jantung. Jika bekuan tersebut berukuran besar mampu menyumbat pembuluh darah dan menyebabkan beberapa penyakit kardiovaskular, yakni stroke, infark miokardium dan penyakit jantung (Guyton 2008).
Agen terapi yang digunakan dalam tatalaksana terapi penyakit kardiovaskular diantaranya menggunakan antiplatelet. Tujuan penggunaan antiplatelet adalah untuk mencegah pembentukan trombus dengan menghambat agregasi platelet sehingga mengurangi risiko terjadinya aterotrombosis. Salah satu obat antiplatelet yang paling banyak digunakan adalah aspirin.
Aspirin dinilai efektif dalam mengurangi kejadian penyakit kardiovaskular seperti stroke iskemik (Sacco et al. 2006). Namun, sekitar 15%-5% pasien dilaporkan mengalami resistensi terhadap aspirin (Alberts 2010). Selain itu, aspirin 1
2
yang tergolong dalam Non-Steroidal Anti-Inflammatory Drug (NSAID) tersebut memiliki efek samping yaitu menyebabkan iritasi lambung. Kerugian dalam pemakaian aspirin tersebut menjadi dasar pencarian alternatif obat baru yang dapat menekan agregasi platelet (Georgiadis et al. 2011). Salah satu alternatif yang dinilai aman untuk terapi antiagregasi platelet yaitu dengan menggunakan bahan alam.
B. Perumusan Masalah
Perumusan masalah dalam penelitian ini adalah apakah fraksi dari ekstrak etanol 70% daun murbei (Morus alba L.) mempunyai aktivitas antiagregasi platelet pada darah manusia sehat secara in vitro?
C. Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh pemberian fraksi etanol, etil asetat dan n-heksan dari ekstrak daun murbei (Morus alba L.) dalam menghambat agregasi platelet secara in vitro.
D. Manfaat Penelitian
Memberikan informasi dan pengetahuan kepada masyarakat mengenai manfaat fraksi etanol, etil asetat dan n-heksan dari ekstrak daun murbei (Morus alba L.) sebagai antiplaletet sehingga dapat digunakan sebagai obat alternatif dan untuk mengembangkan penggunaan bahan-bahan alam sebagai bahan obat serta menambah data penelitian obat tradisional dari daun murbei (Morus alba L.).
E. Urgensi Penelitian
Pada tahun 2012 diperkirakan 17,5 juta orang meninggal karena penyakit kardiovaskular. Angka tersebut merupakan 31% dari jumlah kematian di dunia (WHO 2015). Antiagregasi platelet digunakan sebagai salah satu terapi untuk mengobati penyakit kardiovaskular seperti stroke, infark miokard dan penyakit jantung (Sacco et al. 2006).
Salah satu tanaman yang berpotensi sebagai antiagregasi platelet yaitu daun murbei (Morus alba L.). Secara tradisional, tanaman ini dimanfaatkan untuk membersihkan darah, pengobatan bisul, antiinflamasi, diuretik, antidiabetes dan
3
antihipertensi (Ramandeep 2013). Daun murbei diketahui mengandung senyawa alkaloid, flavonoid (kuersetin-3-triglukoside, rutin, morasetin, isokuersetin), fenolik, triterpenoid (lupeol) (Chan et al. 2016).
Pada penelitian sebelumnya menunjukkan bahwa ekstrak etanol daun murbei dengan konsentrasi 10 mg/mL mempunyai aktivitas antiagregasi platelet sebesar 7,299% sebanding dengan kelompok pembanding asetosal (Pahriyani, 2018).
Berdasarkan hasil penelitian tersebut maka perlu dilakukan penelitian lebih lanjut ke tahap fraksinasi yang bertujuan untuk memisahkan senyawa-senyawa berdasarkan tingkat kepolarannya, sehingga didapatkan senyawa yang lebih spesifik dan juga untuk mendapatkan konsentrasi yang tepat sebagai antiagregasi platelet.
Daun murbei diharapkan dapat dijadikan sebagai suatu sediaan herbal antiplatelet. Sediaan herbal adalah sediaan obat tradisional yang dibuat dengan cara sederhana seperti infus, dekok dan sebagainya yang berasal dari simplisia.
Penelitian terhadap bahan alam, khususnya tanaman sebagai alternatif pengobatan dan obat tradisional juga dapat dilakukan untuk meningkatkan taraf kesehatan di Indonesia. Pengembangan obat tradisional di Indonesia meliputi jamu, obat herbal terstandar dan fitofarmaka.
Obat-obatan tradisional itu telah diuji khasiatnya berdasarkan pengalaman nenek moyang secara turun-temurun. Ilmu pengetahuan modern pada umumnya dan ilmu kedokteran khususnya meminta pembuktian secara ilmiah mengenai adanya khasiat obat bahan alam tersebut dan juga ingin mengetahui zat apa yang bertindak sebagai zat aktif. Kemudian dikehendaki suatu takaran yang sama dari zat aktif tersebut yang biasa disebut standarisasi
Tujuan dilakukan penelitian ini untuk mengetahui pengaruh pemberian fraksi etanol, etil asetat dan n-heksan dari ekstrak daun murbei (Morus alba L.) dalam menghambat agregasi platelet secara in vitro yang dilihat dari nilai serapan PRP dengan penginduksi ADP. Semakin besar penurunan serapan plasma, maka semakin banyak agregat platelet yang terbentuk.
4 BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
A. Landasan Teori
1. Uraian Tanaman Murbei (Morus alba L.)
Murbei adalah tanaman yang berasal dari Cina yang tersebar luas hampir di seluruh tempat baik di daerah dengan iklim tropis maupun sub tropis (Ramandeep 2013) dan tumbuh baik pada ketinggian lebih dari 100 m dpl (BPOM RI 2010).
Tanaman murbei ini berupa pohon yang tingginya kurang lebih 9 m. Bagian batang berkayu, bulat, batang muda berwarna ungu, batang tua berwarna coklat. Salah satu bagian tanaman yang dapat digunakan dalam pengobatan yaitu bagian daunnya.
Bagian daun tunggal, bulat telur, panjang kurang lebih 20 cm, lebar kurang lebih 11 cm, ujung meruncing, tepi bergerigi, pangkal tumpul, pertulangan menyirip, tangkai panjang kurang lebih 51/2 cm, berwarna ungu. Bagian bunga majemuk, bentuk tandan, kelopak segi tiga, benang sari dan putik kecil, berwarna putih, mahkota bentuk tajuk, kecil, berwana ungu. Bagian buah buni, bulat, masih muda berwarna hijau, sudah tua berwarna hitam. Bagian biji keci, berwarna hitam. Bagian akar tunggang, berwarna putih kekuningan (Depkes RI 2000).
Gambar 1. Daun Murbei (BPOM RI 2008) a. Kandungan Kimia Daun Murbei
Daun murbei diketahui mengandung senyawa alkaloid, flavonoid (kuersetin-3- triglukoside, rutin, morasetin, isokuersetin), fenolik, triterpenoid (lupeol) (Chan 2016). Tiga flavonol glikosida rutin, kuersetin-3-triglukosidase, isokuersetin, diidentifikasi sebagai senyawa antioksidan utama dalam ekstrak etanol daun Morus alba L (Katsube 2006). Salah satu senyawa terbesar dari Morus alba adalah flavonoid. Senyawa flavonoid yang terkandung di dalam daun murbei yaitu
5
golongan rutin dan kuersetin yang berperan sebagai unsur bioaktif (Chan et al.
2016).
b. Manfaat Tanaman
Murbei dikenal sebagai tumbuhan sutra karena merupakan makanan pokok ulat sutra. Selain bermanfaat sebagai pakan ulat sutra, murbei juga memiliki banyak manfaat diantaranya sebagai peluruh air seni, antipiretik, antimalaria, antihipertensi (Depkes RI 2000) dan antidiabetes (BPOM RI 2010). Dalam pengobatan tradisional di Cina, tanaman ini dimanfaatkan untuk membersihkan darah, pengobatan bisul, antiinflamasi, diuretik, anti demam, anti hipertensi, dan antidiabetik (Ramandeep 2013).
2. Simplisia, Ekstrak dan Ekstraksi
Simplisia atau herbal adalah bahan alam yang telah dikeringkan yang digunakan untuk pengobatan dan belum mengalami pengolahan. Kecuali dinyatakan lain suhu pengeringan simplisia tidak lebih dari 60˚C. Ekstrak adalah sediaan kering, kental atau cair dibuat dengan menyari simplisia nabati atau hewani menurut cara yang cocok, di luar pengaruh cahaya matahari langsung. Tujuan pembuatan ekstrak tumbuhan obat adalah untuk menstandarisasi kandungannya sehingga menjamin keseragaman mutu, keamanan dan khasiat produk akhir. Standarisasi adalah serangkaian parameter, prosedur dan cara pengukuran yang hasilnya merupakan unsur-unsur terkait seperti paradigma mutu yang memenuhi standar dan jaminan stabilitas produk (BPOM 2005). Ekstraksi adalah proses penarikan zat yang dapat larut dari simplisia dengan pelarut yang sesuai (BPOM RI 2013). Secara umum cara penyarian dapat dibedakan menjadi 4 cara, yaitu infundasi, maserasi, perkolasi, dan penyarian berkesinambung (sokletasi) (Depkes RI 2000).
3. Fraksinasi
Fraksinasi dilakukan untuk memisahkan senyawa-senyawa berdasarkan tingkat kepolarannya tergantung pelarutnya. Pada prinsipnya senyawa polar diekstraksi dengan pelarut polar sedangkan senyawa non polar diekstrasi dengan pelarut non polar.
Proses ektraksi yang dilakukan ditentukan dari kestabilan senyawa yang akan diisolasi (Depkes RI 2008).
6 4. Platelet
Platelet disebut juga trombosit merupakan fragmen megakariosit berbentuk lempeng bulat atau oval yang kecil, garis tengahnya sekitar 2 mikron. Platelet dibentuk di sumsum tulang dari megakariosit, yaitu sel yang sangat besar dalam susunan hematopoietik dalam sumsum, megakariosit pecah menjadi trombosit kecil, baik disumsum tulang atau segera setelah memasuki darah, khususnya ketika memasuki kapiler. Konsentrasi normal platelet dalam darah adalah antara 200.000 dan 400.000 per millimeter kubik. Platelet merupakan struktur yang sangat aktif dengan waktu paruh dalam darah 8-12 hari, setelah itu proses kehidupannya telah berakhir. Platelet kemudian diambil dari sirkulasi terutama oleh makrofag jaringan (Guyton 2008).
Fungsi platelet atau trombosit diatur oleh tiga substansi. Kelompok pertama adanya senyawa yang berada di luar trombosit yang berinteraksi dengan reseptor pada membran trombosit seperti: katekolamin, kolagen, trombin, dan prostasiklin.
Kelompok kedua adalah senyawa yang terdapat didalam trombosit yang berinteraksi dengan reseptor membran seperti ADP, prostaglandin D2, prostaglandin E2, dan serotonin. Kelompok ketiga adalah senyawa yang berada di dalam trombosit dan bekerja didalam trombosit seperti prostaglandin endoperoksida dan tromboksan A2, nukleotida siklik cAMP dan cGMP, dan ion kalsium. Dari senyawa- senyawa tersebut, beberapa target dari obat antiplatelet telah diidentifikasi: inhibisi sintesis prostaglandin (aspirin), inhibisi aggregasi platelet yang diinduksi ADP (clopidogrel, prasugel, ticlopidine), dan penghambat reseptor glikoprotein IIb/IIIa (abciximab, tirofiban dan eptifibatide). Dipiridamol dan cilostaxol merupakan obat antiplatelet lain (Katzung 2015).
a. Agregasi Platelet
Agregasi platelet merupakan tingkat kemampuan darah untuk menggumpal ketika aktivitas platelet bereaksi dan melakukan perbaikan terhadap pembuluh darah yang rusak. Pada waktu platelet bersinggungan dengan permukaan pembuluh darah yang rusak, maka sifat dari platelet ini akan segera berubah secara drastis.
Platelet mulai berbentuk irregular dengan tonjolan-tonjolan yang mencuat dari permukaannya.Sifat platelet menjadi lengket dan melekat pada jaringan kolagen (Guyton 2008).
7
Proses agregasi awal terjadi akibat kontak permukaan dengan pembebasan ADP yang berasal dari membran plasma. Kemudian dengan seiring banyaknya platelet terlibat, maka lebih banyak ADP yang dibebaskan sehingga terjadi gelombang agregasi yang disertai dengan rekrutmen lebih banyak platelet. Agregasi berkaitan dengan perubahan bentuk platelet dari discoid menjadi bulat (Siahaan 2013).
Pada setiap lokasi dinding pembuluh darah yang luka, menimbulkan suatu siklus aktivasi platelet yang jumlahnya terus meningkat. Maka dari itu perlu dilakukan suatu pemeriksaan agregasi platelet yang bertujuan untuk memeriksa abnormalitas dari fungsi platelet (Guyton 2008).
b. Mekanisme Agregasi Platelet dalam Proses Pembekuan Darah
Secara in vitro, agregasi dapat dipicu dengan beberapa reagen, salah satunya adenosine diphosphate (ADP). Pengikatan ADP yang dibebaskan dari platelet aktif ke membran platelet akan mengaktifkan enzim fosfolipase, yang menghidrolisis fosfolipid di membran platelet untuk menghasilkan asam arakidonat. Asam arakidonat adalah prekursor mediator kimiawi yang sangat kuat baik pada agregasi maupun inhibisi agregasi yang terlibat dalam jalur prostaglandin. Melalui proses ini, asam arakidonat diubah di sitoplasma platelet oleh enzim siklooksigenase menjadi endoperoksida siklik. Stimulator kuat untuk agregasi platelet, senyawa tromboksan A2, dihasilkan oleh kerja enzim tromboksan sintetase pada berbagai endoperoksidase sklik ini. Tromboksan A2 adalah senyawa yang sangat aktif, tetapi tidak stabil. Tromboksan A2 juga merupakan vasokontriktor kuat yang akan mencegah pengeluaran darah lebih lanjut dari pembuluh yang rusah (Tselepis et al.
2011).
Mekanisme adhesi platelet juga dapat dijelaskan pada proses perubahan model plateletnya. Platelet didorong ke subendotelium menjadi aktif, kemudian faktor yang berperan mampu mengekspresikan fungsi platelet sehingga mampu bergerak (tethers). Kemudian sebagian besar dari platelet mentranslokasi atau melepas diri.
Proses adhesi tahapan ini mampu bekerja dengan baik pada arteri dan vena. Proses ini menjadi mekanisme dominan pada agregasi secara in vivo (Kulkarni 2000).
5. Platelet Rich Plasma (PRP) dan Platelet Poor Plasma (PPP)
Platelet Rich Plasma (PRP) adalah fraksi plasma darah dengan konsentrasi platelet 3-5 kali diatas nilai normal (konsentrasi platelet pada whole blood)
8
mengandung 1 juta platelet per mikroliter dengan volume 5 mL plasma (Johan 2011), sedangkan Platelet Poor Plasma (PPP) merupakan fraksi plasma darah dengan konsentrasi platelet sangat sedikit (< 10 x 103/μL). Normal platelet darah berkisar antara 150.000/μL dan 350.000/μL san rata-rata sekitar 200.000/μL.
Konsentrasi platelet dalam PRP 2-8 kali lebih tinggi dibandingkan nilai normal (Marx 2001).
Secara luas, plasma kaya platelet diketahui mengandung 7 macam growth factor yaitu : PDGF-AA. PDGF-BB, PDGF-AB, TGF-β1, TGF-β2, VEGF, EGF.
Kadar growth factor in vivo tetap terjaga setelah dilakukan pembuatan PRP.
Konsentrasi platelet dalam PRP dapat meningkatkan delapan kali dari kadar platelet di dalam darah sehingga kadar growth factor di dalam PRP juga meningkat delapan kali kecuali IGF-1 (Marx 2001).
6. Aspirin
Aspirin adalah agen antiplatelet yang paling banyak digunakan karena aspirin efektif mengurangi kejadian penyakit kardiovaskular seperti stroke iskemik (Sacco et al. 2006). Aspirin bekerja dengan mengambat sintesis tromboxan A2 di dalam trombosit dan prostasiklin PGI2 di pembuluh darah dengan menghambat secara irreversibel enzim siklooksigenasi.Penghambatan enzim siklooksigenase terjadi karena aspirin mengasetilasi enzim tersebut. Aspirin dosis kecil hanya dapat menekan pembentukan tromboxan A2, sebagai akibatnya terjadi penurunan agregasi trombosit. Dosis efektif aspirin sebagai antiplatelet adalah 80-320 mg per hari, dosis lebih tinggi selain menyebabkan toksisitas (pendarahan saluran cerna) dan timbul rasa tidak enak di perut dan mual (Gunawan 2007).
7. Spektrofotometri UV-Vis
Spektrofotometri merupakan suatu metode yang digunakan untuk menentukan komposisi suatu sampel baik secara kuantitatif dan kualitatif dalam analisis kimia yang didasarkan pada interaksi antara materi dengan cahaya. Spektrofotometri UV- Vis adalah teknik analisis spektroskopik yang memakai sumber REM (radiasi elektromagnetik) ultraviolet dekat (190 nm – 380 nm) dan sinar tampak (380 nm – 780 nm) dengan memakai instrumen spektrofotometer. Prinsip kerja dari spektofotometri UV-Vis yaitu interaksi yang terjadi antara energiyang berupa sinar monokromatis dari sumber sinar dengan materi yang berupa molekul.
9
Spektrofotometer UV-Vis mempunyai bentuk yang lebar dan hanya sedikit informsi tentang struktur yang bisa didapatkan dari spektrum ini. Spektrum ini sangat berguna untuk pengukuran secara kuantitatif. Konsentrasi dari analit di dalam larutan bisa ditentukan dengan mengukur absorban pada panjang gelombang tertentu dengan menggunakan hukum Lambert-Beer (Khopkar 1990).
8. Uji Aktivitas Antiagregasi Platelet
Uji agregasi platelet in vitro dilakukan dengan metode turbidimetrik seperti yang dikemukakan oleh Born’s. Prinsip ini adalah perubahan trasmisi cahaya sebelum penambahan platelet agonist (agregator), transmisi cahaya melalui PRP rendah karena trombosit masih tersuspensi homogen dalam PRP. Setelah penambahan agregator maka trombosit akan mengalami agregasi kemudian agregat trombosit tersebut mengendap, sehingga plasma menjadi jernih akibatnya plasma akan meningkat. Pengukuran dilakukan dengan membandingkan serapan plasma darah sebelum dan sesudah diinduksi ADP menggunakan spektrofotometer UV- Vis. Semakin besar penurunan serapan plasma, maka semakin banyak agregat platelet yang terbentuk (Wirawan 2007).
B. Studi Pendahuluan
Daun murbei diketahui mengandung senyawa alkaloid, flavonoid (kuersetin- 3-triglukoside, rutin, morasetin, isokuersetin), fenolik, triterpenoid (lupeol) (Chan et al. 2016). Tiga glikosida flavonol yang terkandung pada daun murbei yakni, kuersetin-3-triglukosidase, rutin, dan isokuersetin yang diidentifikasi sebagai senyawa antioksidan utama dalam ekstrak etanol daun Morus alba L. dengan nilai IC50 77,8565 μg/mL (Katsube 2006; Hilwiyah 2015). Flavonoid merupakan salah satu jenis antioksidan yang dapat menghambat pelekatan, agregasi dan sekresi platelet dengan cara menghambat metabolisme asam arakidonat oleh cyclooxygenase (Middleton et al. 2000).
Beberapa penelitian menyatakan bahwa daun murbei mempunyai khasiat sebagai antioksidan (Hilwiyah 2015) dan antihiperlipidemia (Kartikasari 2015).
Penelitian lain menyatakan bahwa ekstrak etanol 70% daun murbei dengan dosis 200 mg/kgBB memiliki efek antiagregasi platelet pada mencit jantan galur Swiss Wesbter (Rahayuningrum, 2016). Penelitian yang dilakukan Pahriyani (2018)
10
menunjukkan bahwa ekstrak etanol daun murbei dengan konsentrasi 10 mg/mL mempunyai aktivitas antiagregasi platelet sebesar 7,299% sebanding dengan kelompok pembanding asetosal.
Kandungan flavonoid yang terdapat pada ekstrak etanol 80% daun belimbing wuluh diduga dapat menghambat pembentukan agregasi platelet pada darah manusia yang diinduksi dengan adenosine diphosphate (ADP) (Inayah 2015).
Senyawa yang diduga mempunyai aktivitas antiagregasi platelet tersebut adalah senyawa flavonoid jenis kuersetin. Kuersetin secara signifikan mampu menghambat agregasi platelet pada trombosit manusia dengan penambahan agregator (Mosawy 2015). Senyawa kuersetin yang mempunyai aktivitas antiagregasi platelet tersebut terkandung dalam daun murbei.
C. Road Map Penelitian
Gambar 2. Road map penelitian antiagregasi platelet
PENELITIAN DAN PENGEMBANGAN
2018-2019 2019-2020 Uji aktivitas antiagregasi
platelet Fraksi etanol, etil asetat dan n-heksan dari ekstrak daun murbei secara invitro.
Pengujian keamanan toksisitas ekstrak daun murbei
Terdahulu
2017-2018 Ekstrak etanol daun
murbei memiliki aktivitas antiagregasi platelet pada darah manusia sehat.
Ekstrak daun murbei memiliki aktivitas antiagregasi platelet pada mencit
Penelitian terdahulu (2016)
WAKTU
11 BAB III
METODE PENELITIAN
A. Alat dan BahanPenelitian 1. Alat Penelitian
Alat yang digunakan pada penelitian adalah wadah maserasi, blender, ayakan mesh no.40, kain flannel, kertas saring, vacuum rotary evaporator, waterbath, oven, chamber, vial, lempeng KLT (silika gel GF 254), UV Box sarung tangan, tabung sentrifuge, sentrifuge, mikropipet, vortex, spektrofotometer UV-Vis, tabung reaksi, corong pisah, neraca analitik, labu ukur, ultrasonic homogenizer, kuvet, shacker, inkubator, serta alat lain yang biasa digunakan pada saat di laboratorium.
2. Bahan Penelitian
Bahan uji berupa ekstrak etanol 70% daun murbei, aspirin serta bahan kimia meliputi etil asetat, heksan, aquadest, pereaksi Mayer, pereaksi Dragendorf, pereaksi Bouchardat, asam asetat anhidrat, asam sulfat, Na CMC, natrium klorida 0,9%, natrium sitrat, Reagen adenosine diphosphate (ADP) (Sigma-Aldrich).
Sampel yang digunakan untuk uji antiagregasi platelet adalah PRP (Platelet Rich Plasma) yang berasal dari darah manusia sehat berjumlah 5 orang yang diambil melalui vena sebanyak 20 mL dari masing-masing orang.
B. Prosedur Penelitian
1. Ekstrak yang diperoleh dari penelitian sebelumnya dilakukan pemeriksaan karakteristik mutu ekstrak
2. Penapisan Fitokimia 3. Fraksinasi
Ekstrak kental sebanyak difraksinasi dengan n-heksan dan etanol : air dalam corong pisah, dikocok selama 15 menit. Setelah itu didiamkan hingga terbentuk 2 lapisan yaitu lapisan atas n-heksan dan lapisan bawah etanol : air. Lapisan etanol : air difraksinasi kembali dengan pelarut etil asetat, dilakukan pengocokan kembali selama 15 menit. Setelah itu didiamkan hingga terbentuk dua lapisan yaitu lapisan atas etil asetat dan lapisan bawah etanol : air. Masing- masing perlakuan dilakukan pengulangan sampai lapisan atas jernih lalu semua
12
fraksi n-heksan, etil asetat dan etanol diuapkan dengan vacuum rotary evaporator
6. Pemeriksaan mutu fraksi 7. Perhitungan rendemen fraksi
Untuk menghitung dosis fraksi, maka sebelumnya dihitung perhitungan rendemen fraksi
% Rendemen fraksi = berat fraksi kering x 100%
berat ekstrak kental 8. Perhitungan dosis fraksi daun Murbei
Pada penelitian ini menggunakan dosis fraksi yang sama dari ketiga fraksi berdasarkan dosis yang mendekati perhitungan dosis fraksi berdasarkan rendemen yang diperoleh
Dosis fraksi = % Rendemen fraksi x dosis ekstrak % Rendemen ekstrak
9. Pembuatan Bahan Pembanding dan Bahan Uji a. Pembuatan Konsentrasi Asetosal
Konsentrasi asetosal 1 mg/mL dibuat dengan menimbang 100 mg serbuk asetosal yang dilarutkan dengan aquadest pada labu ukur 100 mL dengan bantuan alat ultrasonic.
b. Pembuatan Konsentrasi Adenosin diphospat (ADP) 5 μM
Larutan ADP yang dibuat adalah ADP dengan konsentrasi 5 μM. ADP 5 μM dibuat dengan mengencerkan 25 μL ADP 5 mM ke dalam 25 mL salin. ADP 5 mM dibuat dengan melarutkan 50 mg ADP ke dalam 23,408 mL salin. Untuk perhitungan konsentrasi ADP 5 μM dapat dilihat pada lampiran 7.
c. Pembuatan Konsentrasi fraksi untuk Uji Antiagregasi Platelet
Setelah diketahui dosis fraksi dilarutkan dengan aquades dan dihomogenkan dengan bantuan alat ultrasonik.
10. Uji Antiagregasi Platelet
Uji agregasi platelet in vitro dilakukan dengan metode turbidimetrik seperti yang dikemukakan oleh Born’s. Prinsip ini adalah perubahan trasmisi cahaya sebelum penambahan platelet agonis (agregator), transmisi cahaya melalui PRP rendah karena platelet masih tersuspensi homogen dalam PRP. Setelah penambahan
13
agregator maka platelet akan mengalami agregasi kemudian agregat platelet tersebut mengendap, sehingga plasma menjadi jernih. Pengukuran dilakukan dengan membandingkan serapan PRP sebelum dan sesudah diinduksi ADP menggunakan spektrofotometer UV-Vis. Semakin besar penurunan serapan PRP, maka semakin banyak agregat platelet yang terbentuk (Wirawan 2007).
Larutan uji yaitu fraksi etanol, etil asetat dan heksan dari ekstrak etanol 70%
daun murbei yang telah disiapkan serta kontrol positif asetosal 1 mg/mL dan kontrol negatif aquades dipipet sebanyak 186 μL ditambahkan kedalam PRP sebanyak 1,5 mL dan NaCl 0,9% 6 mL, lalu di vorteks, lalu diukur serapannya.
Setelah itu, tambahkan zat pengagregator (ADP) 186 μL, lalu di vorteks, kemudian inkubasi pada suhu 37oC selama 20 menit, lalu ukur serapannya (Inayah 2015).
KKN = Kelompok Kontrol Negatif (PRP + NaCl 0,9% + Aquadest + ADP 5 μM)
KU1 = Kelompok Uji 1 (PRP + NaCl 0,9% + Fraksi etanol + ADP 5 μM) KU2 = Kelompok Uji 2 (PRP + NaCl 0,9% + Fraksi etil asetat + ADP 5 μM) KU3 = Kelompok Uji 3 (PRP + NaCl 0,9% + Fraksi heksan + ADP 5 μM) KKP = Kelompok Kontrol Positif (PRP + NaCl 0,9% + Asetosal 1 mg/mL + ADP 5 μM)
Kekeruhan PRP sebelum dan sesudah diberi ADP diukur dengan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 280 nm (Inayah 2015;
Mattley 2000). Kekeruhan PRP antara kelompok uji dengan kelompok kontrol dihitung persen agregasi plateletnya. Berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Inayah (2015) agregasi platelet ditentukan dengan rumus:
% Agregasi Platelet = 1 −B
A x 100%
A = nilai serapan (absorbansi) sebelum penambahan ADP B = nilai serapan (absorbansi) setelah penambahan ADP C. Analisis Data
Data yang diperoleh berupa persentase agregasi platelet. Data yang diperoleh sebelumnya dilakukan uji kenormalan dan uji homogenitas, kemudian dianalisa secara statistik menggunakan uji Anova satu arah dengan taraf kepercayaan 95%
14
atau α=0,05 untuk mengetahui apakah ada perbedaan antara kelompok perlakuan.
Kemudian dilihat ada tidaknya perbedaan yang bermakna, jika terdapat perbedaan yang bermakna dilanjutkan dengan uji tukey (Priyatno 2009).
D. Bagan Alir
Pengumpulan bahan
Etical clirence
Mutu fraksi
Persiapan Sampel
Pengujian antiagregasi
platelet
Fraksi etanol, etil asestat, heksan
Pembuatan perizinan EC ke komite etik
Penapisan fitokimia fraksi Organoleptis, kadar air fraksi
Penyiapan sampel PRP dan bahan uji
Pengambilan darah manusia Pengujian invitro
Pengukuran serapan pada spektrofotometer UV-VIS
15 BAB IV
BIAYA DAN JADWAL PENELITIAN
A. Biaya Penelitian
Penelitian ini akan membutuhkan dana sebesar Rp 19.941.000 dengan rincian sebagai berikut.
Tabel 1. Ringkasan Anggaran Biaya Penelitian No Jenis Pengeluaran Biaya yang diusulkan
1 Honor Peneliti Rp 5.376.000 2 Alat Bahan dan Luaran Rp 10.765.000 3 Perjalanan Rp 3.800.000 JUMLAH Rp 19.941.000 B. Jadwal Penelitian
Penelitian ini akan dilaksanakan di Laboratorium Fitokimia, Mikrobiologi, Patologi Klinik dan laboratorium Farmakologi Fakultas Farmasi dan Sains, Universitas Muhammadiyah Prof. DR. HAMKA. Waktu penelitian ini mulai dilakukan pada bulan Juli 2018 – Februari 2019.
Tabel 2. Rencana Penelitian
Kegiatan Juli Agustus September Oktober November Desember Januari Februari Pengumpulan dan
penyediaan bahan penelitian Ekstraksi dan fraksinasi Persiapan sampel Uji pendahuluan Pengujian antiagregasi platelet
Analisa data hasil penelitian Penulisan Laporan Penelitan
16
DAFTAR PUSTAKA
Alberts MJ. 2010. Platelet Function Testing for Aspirin Resistance is Reasonable to Do: Yes. Dalam: Journal of Stroke and Cerebrovascular Diseases, Amerika. Hlm. 2400-2401.
BPOM RI. 2008. Acuan Sediaan Herbal Volume Keempat Edisi Pertama.Jakarta:
Badan Pengawas Obat dan Makanan Republik Indonesia. Hlm. 30-32.
BPOM RI. 2013. Pedoman Teknologi Formulasi Sediaan Berbasis Ekstrak.
Jakarta: Deputi Bidang Pengawasan Obat Tradisional, Kosmetik dan Produk Komplemen. Hlm. 10.
Chan EWC, Lye PY, Wong SK. 2016. Phytochemistry, pharmacology, and clinical trials of Morus alba Review. Dalam : . Chinese Journal of Natural Medicines, Malaysia. Hlm. 17-20.
Departemen Kesehatan RI. 2000. Parameter Standar Umum Ekstrak Tumbuhan Obat. Jakarta: Direktorat Jendral Pengwasan Obat dan Makanan. Hlm. 10, 13 dan 31.
DepartemenKesehatan RI. 2000. Inventaris Tanaman Obat Indonesia (I). Jilid I.
Jakarta: Departemen Kesehatan. Hlm. 161-162.
Departemen Kesehatan RI. 2008. Farmakope Herbal Indonesia. Edisi I.
Departemen Kesehatan Republik Indonesia. Hlm. 171
Georgiadis AL, Cordina SM, Vazquez G, Tariq N, Suri MFK, Lakshminarayan K, Adam HP, Qureshhi AI. 2013. Aspirin Treatment Failure and The Risk of Recurrent Stroke and Death Among Patients with Ischemic Stroke. Dalam : Journal of Stroke and Cerebrovascular Diseases, Amerika. Hlm. 103-105.
Gunawan SG, Editor. 2007. Farmakologi dan Terapi. Edisi 5. Jakarta: Departemen Farmakologi dan Terapeutik FKUI. Hlm. 53-55
Guyton AC. 2008. Buku Ajar Fisiologi Kedokteran. Jakarta: EGC. Hlm 480-482.
Hilwiyah A, Betty L, Nugrahaningsih. 2015. Skraining Fitokimia dan Uji Antioksidan serta Kadar total Fenol-Flavonoid Ekstrak Etanol Daun Murbei (Morus alba L.). Dalam : Jurnal Biolgi FMIPA Universitas Negeri Malang, Malang. Hlm. 4-8.
Inayah PW. 2015. Uji Aktivitas Antiplatelet, Antikoagulan dan Trombolisis Ekstrak Etanol Daun Belimbing Wuluh (Averrhoa blimbii L.) In Vitro.
Skripsi. Fakultas Farmasi Universitas Jember, Jember. Hlm. 28.
Kartikasari R. 2015. Pengaruh Ekstrak Etanol Daun Murbei (Morus alba L.) Terhadap Kadar Kolesterol Total pada Tikus Putih Hiperlipidemia. Skripsi.
Fakultas Farmasi Universitas Muhammadiyah Malang, Malang. Hlm. 11.
17
Katsube T, Naoto I, Yasuhiro K, Yoshimitsu Y, Kuninori S, Yosuke Y. 2006.
Antioxidant flavonol glycosides in mulberry (Morus alba L.) leaves isolated based on LDL antioxidant activity. Dalam : Journal Food Chemistry, Jepang.
Hlm. 29-30.
Katzung BG, Anthony JT. 2015. Basic & Clinical Pharmacology Thirteenth Edition. San Fransisco: McGraw-Hill. Hlm. 612-614.
Kurlkarni, Suhasini, et al. 2000. A Revised Model of Platelet Aggregation. Dalam:
Journal of Clinical Investigation, Australia. Hlm. 783-791.
Lindholm LH, Mendis S. 2007. Prevention of cardiovascular disease in developing countries. Dalam: Journal of Stroke and Cerebrovascular Diseases, Amerika. Hlm. 720–722.
Marx RE. 2001. Platelet-Rich Plasma (PRP): What is PRP and What is Not PRP?.
Dalam: Journal Implant Dentistry, USA. Hlm. 225-226.
Middleton E, Kandaswarni C, Theoharides TC. 2000. The Effect of Plant Flavonoids on Mammalian Cells: Implications for Inflammation, Heart Disease and Cancer. Dalam: Journal The American Society for Pharmacology and Experimental Therapeutics, Amerika. Hlm. 698.
Moriyama H, Hosoe, Wakana D. 2009. Assay-guided Informatory Screening Method for Antiplatelet Effect of Adenosine Isolated from Malbranceafilamentosa IFM 41300: Inhibitory Behaviors of Adenosine in Different Solvent. Dalam: Journal of Health Science,Tokyo. Hlm. 103-108.
Mosawy S. 2015. Effect of the Flavonol Quercetin on Human Platelet Function: A Review. Dalam : Journal Food and Public Health, Australia. Hlm. 4-5.
Pahriyani, Ani. 2018. Uji Aktivitas Antiagregasi Platelet Ekstrak Etanol 70% Daun Murbei (Morus Alba L.) Pada Darah Manusia Sehat Secara In Vitro. Laporan Akhir Penelitian. UHAMKA.
Priyatno D. SPSS untuk AnalisaKorelasi, Regresi, dan Multivariate. Yogyakarta:
Penerbit Gava Media. Hlm 73-76.
Rahayuningrum IH. 2016. Efektifitas Ekstrak Etanol daun Murbei (Morus alba L.) Terhadap Perpanjangan Waktu Pendarahan Pada Mencit Jantan Galur Swiss Webster. Skripsi. Fakultas Farmasi STIKES Ngudi Waluyo Ungaran, Bali.
Hlm. 8-9.
Sacco RL, Greg A, Karen F, Philip G. 2006. Guidelines for Prevention of Stroke in Patients With Ischemic Stroke or Transient Ischemic Attack. Dalam : Journal American Heart Association, Amerika. Hlm. 424.
Siahaan, Fuentes, et al. 2013. Chlorogenic Acid Inhibits Human Platelet Activation and Thrombus Formation. Journal of Medicine National Institute. Singapore.
Hlm. 145.
18
Tselepis, A. D, et al. 2011.Review Article: Mechanismof Platelet Activation and Modication of Respons to Antiplatelet Agent. Dalam: Journal of Medicine National Institute. Singapore. Hlm. 225-226
Ramandeep S, Anindya B, Alok S. 2013. Traditional uses, phytochemistry and pharmacology of Morus alba Linn. Dalam : Journal of Medicinal Plants Research, India. Hlm. 461-469.
Vogel HW, Bernward AS, Jurgen S, Gunter M, Wolfgang FV. 2008. Drug Discovery and Evaluation Pharmacological, NewYork: Spinger. Hlm. 401- 402.
Wirawan R. 2007. Nilai Rujukan PemeriksaanAgregasi Platelet dengan Adenosin Difosfat pada Orang Indonesia Dewasa Normal di Jakarta. Dalam : Jurnal Kedokteran Indonesia, Jakarta. Hlm. 213.
World Health Organization. 2015. The Top 10 Causes of Death, http://www.who.int, 10 Maret 2017.
19 Lampiran 1. Justifikasi Anggaran Penelitian
1. Honor
Peneliti Honor/Jam Waktu
Total Jam/Minggu Minggu
Ketua Rp 15.000 8 24 Rp 2.880.000
Anggota Rp 13.000 8 24 Rp 2.496.000
Total Rp 5.376.000
2. Alat dan Bahan Rincian bahan
kebutuhan Jumlah satuan harga satuan Total harga
Bahan
Ekstrak daun
murbei 30 mg Rp 15.000 Rp 450.000 Etil asetat 5 liter Rp 75.000 Rp 375.000 Heksan 5 liter Rp 50.000 Rp 250.000 NaCl 0.9% 2 liter Rp 70.000 Rp 140.000 Aspirin 100 mg Rp 5.000 Rp 500.000 Natrium sitrat 1 pc Rp 300.000 Rp 300.000 Etanol 70% 5 liter Rp 60.000 Rp 300.000 ADP 5 gram Rp 300.000 Rp 1.500.000 Na CMC 1 kg Rp 70.000 Rp 70.000 aquadest 5 liter Rp 30.000 Rp 150.000
Total Bahan Rp 4.035.000
Alat
lempeng KLT 2 pack Rp 200.000 Rp 400.000 Spuit 3 cc 100 Pack Rp 5.000 Rp 500.000 vacute (EDTA) 50 Buah Rp 10.000 Rp 500.000 Wadah
penyimpanan fraksi
10 Petri
Rp 25.000 Rp 250.000 Tabung mikrotube 1 Pack Rp 50.000 Rp 50.000 Tip biru, kuning,
putih 3 Pack
Rp 30.000 Rp 90.000 Handscoon 1 Box Rp 40.000 Rp 40.000 Disposible masker 1 Box Rp 20.000 Rp 20.000
Total Alat Rp 1.850.000
Biaya Lainnya
PRP 3 Kantong Rp 450.000 Rp 1.350.000 kertas 80g 2 rim Rp 40.000 Rp 80.000 penggandaan &
jilid laporan Rp 270.000
20
Tinta Printer Rp 180.000
penelusuran
pustaka Rp 150.000
dokumentasi Rp 100.000
pembuatan etical
clirence 1 Rp 250.000 Rp 250.000 publikasi jurnal 1 Rp 2.000.000 Rp 2.000.000
HAKI 1 Rp 500.000 Rp 500.000
Total Biaya
Lainnya Rp 4.880.000
Total
Keseluruhan Rp 10.765.000
3. Perjalanan
Material Justifikasi
pemakaian Kuantitas Harga satuan Total Biaya seminar keikutsertaan
seminar 1
Rp 1.500.000 Rp 1.500.000 Transport seminar Pulang pergi 1 orang Rp 1.500.000 Rp 1.500.000 Transport harian 4 hari 1 orang Rp 200.000 Rp 800.000
Total Rp 3.800.000
21
Lampiran 2. Ketersediaan sarana dan prasarana penelitian
Sarana dan prasarana penelitian yang diperlukan dalam penelitian ini adalah sebagai berikut :
Tabel 3. Ketersediaan sarana dan prasarana penelitian
No. Nama Barang Lokasi
1. Corong pisah, Rotary evaporator vacuum, oven
Laboratorium Fitokimia
2. Timbangan analitik Laboratorium Mikrobiologi
3. Spektrofotometer uv vis Laboratorium kimia
4. Mikropipet Laboratorium Patologi Klinik
22
Lampiran 3. Susunan organisasi tim peneliti dan pembagian tugas Tabel 4. Susunan organisasi tim peneliti dan pembagian tugas
No Nama/NIDN Instansi
Asal Bidang Ilmu
Alokasi Waktu (jam/mgg)
Uraian Tugas 1 Ani Pahriyani,
M.Sc., Apt.
0302048504)
UHAMKA Farmakologi &
Farmasi Klinik
10 Desain penelitian secara menyeluruh serta
Pengujian
Antiagregasi platelet 2 Elly Wardani,
M.Farm., Apt.
(0322098405)
UHAMKA Farmakologi &
Farmasi klinik
10 Ekstraksi dan Fraksinasi serta Pengujian
Antiagregasi platelet
23 Lampiran 4. Daftar Riwayat Hidup Peneliti
1. Biodata Ketua Peneliti
24
25 2. Biodata Anggota Peneliti
26
27
