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化学と生物 Vol. 55, No. 6, 2017
NAADP を基本分子としたバーチャルスクリーニングによる分子プローブの開発とその後
コンピューターによる研究の効率化
カルシウムイオン（Ca2＋）は神経伝達，筋収縮，受 精，ホルモン分泌などさまざまな生体機能の調整におい て重要な役割を果たしている．小胞体内においてCa2＋
放出を誘導するD-ミオイノシトール1,4,5-三リン酸（IP3）， サイクリックアデノシン二リン酸リボース（cADPR）
などのほかに，ニコチン酸ジヌクレオチドリン酸（nico- tinic acid adenine dinucleotide phosphate; NAADP，図 1上）がリソソームにおいてCa2＋放出を誘導することが 近年発見された(1)．このNAADPは，膵臓・脳・心臓と いった組織で働いていることがわかっていた(2)が，その メカニズムや生物学的機能については不明な点が多かっ た．
これまで，Ca2＋貯蔵庫を同定するためにbafilomycin A1（H＋-ATPase阻害剤），thapsigargin（小胞体におけ るCa2＋ポ ン プ 阻 害 剤），glycylphenylalanine 2-naph- thylamide（リソソームの浸透圧溶解を誘導）といった 間接的に働く分子プローブが広く利用されてきた．
NAADPもその受容体の活性化・不活性化に利用されて きたが，NAADPには膜透過性がないためピペットかリ ポソームを通して細胞内に導入しなければならないこ
と，またこの技術は取り扱える細胞が数個に限られてし まうことであった．またNAADP分子の構造変異体も 合成されているが，これら類縁体に関して構造‒活性の 相関は見いだせるものの，NAADPよりもはるかに活性 が低下するという問題があった．
以上のことから，NAADPに関する研究をより迅速に 発展させるため，NAADPにより調整されるCa2＋放出 に対して，直接的かつ選択的に関与する分子プローブの 開発が望まれていた．これらを解決する手段として，わ れわれは「バーチャルスクリーニング」に注目した．
バーチャルスクリーニングとは，受容体や酵素などのタ ンパク質を創薬などのターゲットとして，その立体構造
（X線結晶構造および生理活性に関与していると考えら れる三次元構造）に基づき， （コンピューター を用いて）で化合物を探索する方法である．バーチャル スクリーニングは創薬の分野では一般的に利用されてい るが，基礎生物学解明のための分子プローブ開発には，
当時（2008年頃）はそれほど利用されていなかった．
そこでわれわれは，NAADPを基本分子としたバーチャ ルスクリーニングによる分子プローブの開発とその有用 性について検討した(3)．
NAADPの活性コンフォメーションは不明であったた め，ソフトウェアOmegaを用いて考えうるNAADPコ ンフォメーションを探索して40個の推定構造を得た．
これら40個の推定構造に類似した化合物を，数百万個 ある化合物のデータベースZINCの中から検索した結 果，100個以上の化合物がヒットした．次に，NAADP とヒット化合物の三次元構造についてROCSを用いて比 較，NAADPとヒット化合物の電荷分布についてEON を用いて比較し，その相同性をランクづけした．電荷分 布に基づくランクは構造および正・負電荷のオーバー ラップも反映したTanimotoスコアを用いた結果（スコ アは−0.31〜0.85），3次元構造のみで探索した化合物の 上位10個をNrd（NAADP ROCS discovered），電荷に 基づいて探索した化合物上位15個（5個は新規化合物）
をNed（NAADP EON discovered）と名づけ，Tanimoto スコアに基づいて番号をつけた．化合物が市販されてい ない場合には，次点の化合物を用いた．これらの化合物 図1■NAADPとNed-19
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はすべて，NAADPと二次元構造は異なるが，三次元構 造ではTanimotoスコアが示すように類似していた．
選抜した化合物は，ウニ卵破砕液を用いてアンタゴニ スト活性試験を行った．ウニ卵は，哺乳類との類似性が あり，構造安定性が高く，また3種すべてのCa2＋放出 セカンドメッセンジャー（IP3, cADPR, NAADP）に対 する反応がよく調べられている．選抜した化合物群は NAADPのEC50値に対する量的阻害を調べることでア ンタゴニスト活性を調べた．その結果，25種のうち21 種でアンタゴニスト活性が確認され，そのうちの4種に 強いアンタゴニスト活性を確認できた．生理活性が確認 された化合物のうち，NAADPの働きを顕著に阻害した 化合物Ned-19（図1下，構造的Tanimotoスコア：0.67，
電荷的：0.65）に注目した．
Ned-19は100
μ
Mで効果的にNAADPによるCa2＋放出 を阻害したが，IP3やcADPRによるCa2＋放出は阻害し ないという特異性を示した．しかしながら，市販の Ned-19はジアステレオマーの混合物であることがF- NMR, H-NMR，逆相HPLCの結果から判明した．コン ピューターによる三次元構造の比較では，L-トリプト ファン由来のトランス体が最も良いオーバーラップを示 していた．これらジアステレオマーの生理活性を調べる ため，L-トリプトファンを出発化合物として，鍵反応に Pictet‒Spengler反 応 を 用 い る こ と に よ っ て - Ned-19, -Ned-19をそれぞれ合成した．生物試験の結 果，Ca2＋放出阻害（IC50 / ＝6 nM/800 nM）およ び［32P］ 標 識NAADP結 合 阻 害 試 験（IC50 / ＝ 0.4 nM/15μ
M）の両方において，トランス体がシス体よ りも強い活性を示した．このアンタゴニスト活性濃度と 結合阻害濃度の違いはNAADP受容体への結合が不可 逆的であることに起因しているためと考えられる．log は化合物の疎水性あるいは脂溶性を表す物性値で あり，脂溶性の高い化合物（分配係数 の高い薬物）で あるほど膜透過性がよい．Ned-19はlog が3.68である ため細胞膜透過性があり，無傷細胞でも効果があるので はと考え，Ned-19（100
μ
M）を含む人工海水中でイン キュベートした無傷ウニ卵にNAADPを添加したとこ ろ，予想どおりCa2＋の放出は誘導されなかった．また，哺乳動物細胞中でもアンダゴニスト活性が確認できるか を調べるため，マウス膵臓
β
細胞を用いてパッチ法によ り確認したところ，NAADPによるCa2＋放出は阻害さ れた．以上のことから，Ned-19はウニ卵および哺乳動物細胞において細胞透過性アンタゴニストとして働くこ とが確認された．トリプトファンの誘導体であるNed- 19は蛍光をもつ．そこで，無傷細胞中のNed-19が結合 したNAADP受容体を紫外アルゴンイオンレーザー
（Ex 351, Em 365 nm）を使用した共焦点顕微鏡を用い て可視化を試みたところ，NAADP受容体に結合してい ることが確認できた．さらにNed-19をリード化合物と してさまざまな誘導体を合成，それら誘導体を用いて アッセイした結果，NAADP受容体上には2つ以上の結 合部位があることを証明した(4)．
有機化学者にとって，期待する反応が進行したとき，
化合物が結晶化したとき，綺麗に精製できたとき，天然 物合成ではその全合成が達成できたときなど，さまざま な喜びがある．そして，見いだした化合物をほかの研究 者やグループが用いて実験を行い，新たな発見や知見が 論文などで報告された場合もある．Sakuraiらは，ウイ ルスが細胞に感染する侵入経路について研究を行い，そ の侵入を防ぐ薬剤として「ベラパミル」などのカルシウ ム拮抗薬が有効であることを見いだし， -Ned-19も 同様にエボラウイルスなどのフィロウイルス感染を防止 することを報告している(5)．また，Kintzerらは，シロ イヌナズナ（ ）由来のTPC1と - Ned-19の結晶を作製し，そのX線結晶構造解析（分解 能2.87 Å）を行った結果， -Ned-19が小孔ドメイン をVSD2へ固定することによってアロステリックに作用 していると報告している(6)．
以上のように，われわれが見いだしたNed-19がさま ざまなグループによって研究利用されていることはたい へん喜ばしい．なお，われわれはプロセス化学的研究も 行っており，前駆体である -Ned-19メチルエステル をグラム単位で合成することに成功している．さまざま な生物種に対してNed-19の効果を調べてみたいが，有 機合成化学を主とする現研究室では生物試験を行う技術 を有していないため，さらに多くの研究者にNed-19お よびNed-19誘導体をご利用いただければ幸いである．
1) A. H. Guse & H. C. Lee: , 1, re10 (2008).
2) H. C. Lee: , 280, 33693 (2005).
3) E. Naylor, A. Arredouani, S. R. Vasudevan, A. M. Lewis, R. Parkesh, A. Mizote, D. Rosen, J. M. Thomas, M. Izumi,
A. Ganesan : , 5, 220 (2009).
4) D. Rosen, A. M. Lewis, A. Mizote, J. M. Thomas, P. K.
Aley, S. R. Vasudevan, R. Parkesh, A. Galione, M. Izumi, A. Ganesan : , 284, 34930 (2009).
5) Y. Sakurai, A. A. Kolokoltsov, C.-C. Chen, M. W. Tidwell,
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W. E. Bauta, N. Klugbauer, C. Grimm, C. Wahl-Schott, M.
Biel & R. A. Davey: , 347, 995 (2015).
6) A. F. Kintzer & R. M. Stroud: , 531, 258 (2016).
（泉 実，岡山大学大学院環境生命科学研究科）
プロフィール
泉 実（Minoru IZUMI）
＜略歴＞1996年大阪府立大学農学部農芸 化学科卒業／1998年同大学大学院農学研 究科博士前期課程修了／2001年大阪大学 大学院理学研究科博士後期課程修了／2002 年産業技術総合研究所特別研究員／2003 年日本学術振興会特別研究員／2004年岡 山大学農学部助手／2005年同大学大学院 自 然 科 学 研 究 科 助 手／2007年 同 助 教／
2010年同准教授／2014年同大学大学院環 境生命科学研究科准教授，現在に至る＜研 究テーマと抱負＞糖鎖工学，有機化学など の講義における教育方法の工夫＜趣味＞息 子たちの玩具を自作すること＜所属研究室 ホームページ＞http://www.cc.okayama-u.
ac.jp/~mizumi/index.html
Copyright © 2017 公益社団法人日本農芸化学会 DOI: 10.1271/kagakutoseibutsu.55.375
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