グラム陰性細菌の多剤耐性 - J-Stage

80 化学と生物 Vol. 54, No. 2, 2016

グラム陰性細菌の多剤耐性

β ^-Lactam 系抗生物質の外膜透過 ・ 排出速度の測定結果を例に理解する

多様な薬剤に対して耐性をもつ多剤耐性菌の出現・存 在は21世紀の医療が抱える最も大きな問題の一つであ る．2013年に米国疾病予防管理センターにより報告さ れた多剤耐性を示す細菌種の多くは緑膿菌，アシネトバ クター，また大腸菌やクレブシエラなどのEnterobacte- riaceae科の細菌群に代表されるグラム陰性細菌が占め る．グラム陰性細菌の多剤耐性の特徴は，1）外膜の透 過障壁性により薬剤の流入を制限し，かつ 2）多剤排出 ポンプが外膜を通過した薬剤を細胞外へ排出するという 2つの作用により，多様な薬剤に対して細胞内流入を効 果的に阻害する防御機構をもっている点にある（図 1_A）．薬剤排出速度の定量的測定は長らく困難であった が，2009年に大腸菌のAcrAB-TolC多剤排出ポンプに よる

β

-lactam系抗生物質（以下

β

-Lactams）の排出測定 法が初めて確立された^(1, 2)．加えて2013年に

β

-Lactams の 大 腸 菌 外 膜 透 過 速 度 が 精 査 さ れ た こ と に よ り⁽³⁾，

β

-Lactamsの外膜の内外における挙動（透過・排出）の すべてが数値として明らかになり，大腸菌の

β

-Lactams 耐 性 の 定 量 的 理 解 が 大 き く 進 展 し た．本 稿 で は，

β

-Lactamsの透過・排出速度の測定法と測定結果に焦点 を当てながら，本実験から見えてきたグラム陰性細菌の 多剤耐性の特性について簡単に統括し紹介する．

外膜の透過障壁性と多剤排出ポンプ^(4, 5)

グラム陰性細菌の外膜は外葉がリポ多糖，内葉がリン 脂質で形成される非対称脂質二重層であり，一般的なリ ン脂質二重層に比べ疎水性物質の透過を著しく阻害す る．さらに親水性物質の透過を担う外膜チャネルは分子 サイズの大きい化合物（大腸菌の場合，おおよそ分子量

＞600）の流入を遮断するため，外膜は疎水性および

（比較的高分子量の）親水性物質の流入を効果的に制限 できる（図1A）．多剤排出ポンプは複数種あるが，大別 すると細胞質膜で単独で機能するものと，細胞質膜と外 膜にまたがる複合体を形成し薬剤を細胞外へ直接排出す るものの2つに分類される．後者の代表がresistance- nodulation-division（RND） superfamilyに 属 す る 排 出 ポンプであり，プロトン駆動力を利用し極めて多様な薬

剤を排出でき，多剤耐性への寄与が最も大きい．大腸菌 AcrAB-TolCはRNDポンプのプロトタイプとして研究 が最も進んでいる．AcrBは細胞質膜に3量体で構成さ れポンプの主体として機能し，基質（排出される薬剤）

をペリプラズムないし細胞質膜内部で認識してプロトン 駆動力を利用した排出動作により外膜チャネルTolCに 送り込む．AcrAはペリプラズムに局在し，複合体形成 とポンプ機能の両方に必須の働きをする（図1A）．

β

-Lactamsの外膜透過・排出速度の測定

AcrAB-TolCに関しては大腸菌の多剤耐性の主要因と なることが1990年代に明らかにされて以来活発な研究 が続けられ，1999年には精製AcrBをリポソームに再構 成した試験管内実験系が確立された⁽⁶⁾．しかし実際の生 細胞内ではAcrAB-TolCは細胞質膜と外膜をまたぐ複合 体ポンプとして機能する性質上，排出速度の厳密な定量 的測定は再構成系では難しく，排出キネティクスの諸定 数の決定は2009年に生細胞を用いた

β

-Lactams排出速 度測定法が確立されるまで待たれることとなった．排出 活性を数値化するためには，1）外膜透過・排出速度が 定 量 的 に 測 定 で き る こ と，2） ペ リ プ ラ ズ ム の

β

-Lactams濃度（ p）を測定できること，の2点が肝と な る．こ れ ら の 点 は，ペ リ プ ラ ズ ム に 局 在 す る

β

-Lactams分解酵素（

β

-Lactamase）による加水分解反 応を検出する方策を取ることで解決された．すなわち，

β

-Lactamsを外的投与したときの外膜透過速度を in， 排出速度を e，加水分解速度を hとすると，これらは 定常状態で in＝ _e＋ _hの関係を取る（図1B）（少なく とも15分程度の実験条件下では定常状態を保つことが 確認されている）．

β

-Lactamsの加水分解反応は比色分 析により検出できるため hが実測値として得られ，さ らに pがミカエリス‒メンテン式 p＝ h･ m/（ max−

h）（ maxと mは細胞破砕液中の

β

-lactamase活性から 求められる）から算出される．ポンプ機能を脱共役剤の 投与もしくは 遺伝子の破壊により欠失させると，

in＝ hとなり， inが得られる．外膜透過は非特異的な 受動拡散であるため，フィックの拡散方程式 in＝ ･ ･

日本農芸化学会

● 化学 と 生物 

今日の話題

81

化学と生物 Vol. 54, No. 2, 2016

（ o− p）（ oは細胞外濃度， は透過係数， は細胞表 面積で大腸菌の場合132 cm²/mg [cell dry weight]）に従 い， inと pの算出値から が求められる．最終段階とし て同様の実験を ^＋株で行うと， in＝ e＋ hとなるた め， inの理論値[＝ ･ ･（ o− p）]と hの実測値との差が

eとして求められる．測定結果を例示すると，penicillin G の外膜透過係数は ＝0.07×10⁻⁵ cm/s，排出キネティクス の定数（下記を参照）は max＝0.085 nmol/s/mg [cell dry  weight]， 0.5＝0.3 

μ

M，ヒル定数 ＝4.0である⁽³⁾.

測定結果から見えてくること

現在までに13種の

β

-Lactamsの排出キネティクスが 測定されている．Nitrocefinを除くすべての

β

-Lactams において， e値を pに対してプロットするとヒル方程 式 e＝ max･ p/（ 0.5＋ p ）（ はヒル定数）に従うS 字型飽和曲線が得られる．このタイプの曲線はAcrBの 排出動作に正の協同作用（positive cooperativity）があ ることを示している．2006年にAcrBと基質の共結晶構 造が解かれた際にAcrBの動作原理として3量体間の協 同作用がすでに推定されていたが^(7, 8)，これを実験事実

として裏づけている．基質の親和性を示す 0.5（ mに 相当）は親水的なセフェム系

β

-Lactamsで5〜300 

μ

M，

より疎水的なペニシリン系

β

-Lactamsで1 

μ

M前後であ る．また，外膜透過・排出の両方が数値化されたことに より，

β

-Lactams耐性を定量的な視点で理解することが 可能になった．

β

-Lactamsの標的はペリプラズムに局在 するペニシリン結合タンパク質なので，耐性は投与濃度

（ o）に対して pをどのくらい低く抑えられるかで決ま る． oと pの対応関係は in＝ _e＋ _hに実験で得られ た諸定数を代入すると理論値として算出でき（理論値は 実測した o    pプロットとよく一致する），これを利 用して透過障壁・排出活性・

β

-Lactamase活性の耐性へ の寄与が概観できる．図1Cは例としてpenicillin Gの o

と pの 対 応 関 係 を，透 過 障 壁 性，排 出 活 性 お よ び

β

-Lactamase活性がそれぞれ1/5倍および5倍になった 場合を仮定し算出したものである． pの値は透過障壁 性と排出活性に著しく依存しており，両者の寄与の大き さが図から明らかである．したがって細菌にとっては透 過障壁性と排出活性を上げることが耐性獲得に最も有効 な手段となっていることがわかる．これは現実の多剤耐 性菌の多くで外膜チャネルの欠失（これにより透過障壁 図1^■グラム陰性細菌に対する薬剤の挙動

（A）グラム陰性細菌の細胞表層と薬剤の挙 動を示した模式図（文献4をもとに作図し た）．排出ポンプは細胞質膜で単独で機能し，

細胞質からペリプラズムへの排出を行うもの と，細胞質膜と外膜にまたがる複合体を形成 して細胞外への直接排出を行うものの2つに 大別される．RNDポンプは細胞質膜のポン プ部分（AcrB）と，外膜チャネル（TolC）， およびmembrane fusionタンパク質（AcrA）

で構成される．(B) β-lactamsの挙動を示す模 式図．（C）透過障壁性，排出活性，および β-lactamase活性がそれぞれ1/5倍（左）およ び5倍（右）になった場合を仮定したpenicil- lin GのCp vs. Co曲線．WTとΔ はそれ ぞれ野生株と 欠損株を示す．野生株の MICは 約810 μMな の で，Cp値 が 約0.35 μM に達すると生育阻害が起こると考えることが できる．

日本農芸化学会

● 化学 と 生物 

今日の話題

82 化学と生物 Vol. 54, No. 2, 2016

性が上がる）と多剤排出ポンプの発現増加が同時に起 こっていることからも確認できる⁽⁴⁾．

以上が

β

-Lactamsの外膜透過・排出測定結果から得ら れる示唆である．細胞質内の因子を標的とするほかの薬 剤の排出キネティクスは測定されていないが，いずれの 薬剤もペリプラズムを通過する以上, 

β

-Lactamsと同様 に透過障壁性と排出活性が多剤耐性の主因となることは 疑いようがない．多剤耐性問題の解決には透過障壁性の 克服と排出活性の阻害が鍵となる．排出ポンプ阻害剤は 研究・開発が進んでおり，排出活性を効果的に阻害でき る数種の化合物が既に報告されている^(9, 10)．現時点で実 用化されたものはないが今後の進展が待たれる．一方，

ポリミキシン系抗生物質は外膜透過障壁性を破壊するこ とが知られているが腎毒性が強く有効な薬剤となり得て いない．透過障壁性の克服には新たな研究展開が望まれ る．

  1)  K.  Nagano  &  H.  Nikaido:  , 

106, 5854 (2009).

  2)  S. P. Lim & H. Nikaido:  , 

54, 1800 (2010).

  3)  S. Kojima & H. Nikaido:  , 110, 

E2629 (2013).

  4)  X. Z. Li, P. Plésiat & H. Nikaido:  , 28,  337 (2015).

  5)  K. M. Pos:  , 1794, 782 (2009).

  6)  H.  I.  Zgurskaya  &  H.  Nikaido: 

, 96, 7190 (1999).

  7)  S. Murakami, R. Nakashima, E. Yamashita, T. Matsumoto 

& A. Yamaguchi:  , 443, 173 (2006).

  8)  M. A. Seeger, A. Schiefner, T. Eicher, F. Verrey, K. Die- derichs & K. M. Pos:  , 313, 1295 (2006).

  9)  T. J. Opperman, S. M. Kwasny, H. S. Kim, S. T. Nguyen,  C.  Houseweart,  S.  D'Souza,  G.  C.  Walker,  N.  P.  Peet,  H. 

Nikaido & T. L. Bowlin:  , 

58, 722 (2014).

10)  R.  Nakashima,  K.  Sakurai,  S.  Yamasaki,  K.  Hayashi,  C. 

Nagata, K. Hoshino, Y. Onodera, K. Nishino & A. Yama- guchi:  , 500, 102 (2013).

（児島征司，東北大学大学院生命科学研究科， 

東北大学学際科学フロンティア研究所）

プロフィール

児島 征司（Seiji KOJIMA）

＜略 歴＞2007年 東 北 大 学 農 学 部 卒 業／

2012年同大学大学院農学研究科博士後期 課程修了／同年カリフォルニア大学バーク レー校博士研究員／2014年東北大学大学 院生命科学研究科助教／2015年同大学学 際科学フロンティア研究所助教＜研究テー マと抱負＞グラム陰性細菌と植物葉緑体の 外膜安定化因子の解析＜趣味＞サッカー観 戦

Copyright © 2016 公益社団法人日本農芸化学会 DOI: 10.1271/kagakutoseibutsu.54.80

日本農芸化学会

● 化学 と 生物 

今日の話題