液胞／リソソーム膜を介した アミノ酸輸送の分子機構 - J-Stage

真核微生物の細胞内に発達する液胞はアミノ酸を能動的に取 り込み蓄積するとともに，動物リソソーム同様，その内腔へ と輸送されたタンパク質を分解しアミノ酸を生じる．これら アミノ酸は栄養飢餓条件で速やかにサイトゾルへと排出され 新規タンパク質合成へと再利用される．液胞／リソソーム膜 のアミノ酸トランスポーターは細胞内アミノ酸濃度の好適化 に機能すると考えられ，その改変により有用微生物の育種，

農作物の栄養価および収量の向上や病原性真菌の駆除／感染 予防などへの応用が期待される．本稿ではこれまで同定され た液胞／リソソームアミノ酸トランスポーターについて解説 するとともに，その生理機能および調節機構について最近の 知見を紹介する．

はじめに

細胞内に存在するアミノ酸には代謝回転が活発な 動 的 なプールとほとんど代謝されない 静的 なプール が存在するといわれてきた．細胞内の一重膜オルガネラ である液胞がこの 静的 なアミノ酸プールを形成する コンパートメントであると報告されて以来40年が経過

した⁽¹⁾．出芽酵母 の液胞内に は細胞全体の70〜90％の塩基性アミノ酸（リジン，ヒ スチジン，アルギニン）が蓄積する一方，酸性アミノ酸

（アスパラギン酸，グルタミン酸）は細胞全体の10％以 下しか存在しないことが単離液胞の解析を通じて明らか にされた（図1_）．その後，液胞膜小胞の単離法が確立 され（図2_），これを用いた解析によって，アルギニン が液胞型プロトンATPase（V-ATPase）によって形成 されたプロトン濃度勾配に依存して能動的に取り込ま れ，小胞内外で40倍の濃度差を形成することが示され た⁽²⁾．さらにアルギニン以外の9種のアミノ酸（リジ ン，ヒスチジン，フェニルアラニン，トリプトファン，

チロシン，グルタミン，アスパラギン，イソロイシン，

ロイシン）のATP依存的な取り込み活性が検出され⁽³⁾， ヒスチジンとアルギニンの交換輸送活性も報告されてい る⁽⁴⁾．液胞膜小胞のATP依存的なアルギニン取り込み の m値（0.6 mM）は細胞膜を介したアルギニン取り込 みの約100倍と親和性が低いことから，液胞内へのアミ ノ酸取り込みは細胞内に取り入れたアミノ酸を隔離・保 存し，サイトゾル中アミノ酸濃度を適正に維持するため に機能すると考えられている．液胞膜小胞の単離解析法

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【解説】

The Molecular Machinery of Amino Acid Transport across the  Vacuolar/Lysosomal Membrane

Takayuki SEKITO, Yoshimi KAKINUMA, 愛媛大学農学部

液胞／リソソーム膜を介した アミノ酸輸送の分子機構

関藤孝之，柿沼喜己

に続き，酵母細胞を銅処理することによって液胞内アミ ノ酸のみを調製する手法も確立された⁽⁵⁾．この手法はさ まざまな栄養条件で培養した細胞の液胞内アミノ酸含量 を比較的簡便に測定することを可能とし，培地中アミノ 酸含量の変化に伴って液胞内アミノ酸含量が大きく変化 することが示された⁽⁶⁾．特に，窒素飢餓条件では液胞内 のアルギニンが速やかに減少したことから，アミノ酸排 出機構の存在も示唆され，液胞内アミノ酸プールの 動 的 な側面が見えてきた⁽⁶⁾．こうした変化に関わる分子 機構や生理的意義を明らかにするためには，アミノ酸輸 送を担うトランスポーターの同定解析が必要である．

2000年代に入って出芽酵母Avtトランスポーター⁽⁷⁾と 動物リソソームアミノ酸トランスポーター LYAAT-1

（PAT1）⁽⁸⁾が同定され，これを皮切りに現在まで表1_お よび図3に示すトランスポーターが報告されている．後 述するが，液胞／リソソームアミノ酸トランスポーター の生理機能が少しずつ明らかになっており，こうした新 たな知見獲得が今後新規トランスポーター同定につなが ると期待される．

出芽酵母の液胞アミノ酸輸送系 1. AVTファミリー

シナプス小胞に

γ

-aminobutyric acid（GABA）とグリ シンを取り込むトランスポーター VGAT（ラット）， VIAAT（ヒト・マウス）およびUNC-47（線虫）はい ずれもAmino acid/auxin permease（AAAP）スーパー ファミリー中のSLC32ファミリーに属する^(9, 10)．出芽酵 母ゲノムにコードされる7種のAAAPタンパク質は10

〜11回膜貫通型と予想され，AVTファミリーと名づけ られた．RussnakらはこのうちAvt1がグルタミン，イ ソロイシン，チロシンを液胞内へ取り込み，Avt3と Avt4がこれらアミノ酸を逆に液胞外へ排出すること，

また，Avt6は酸性アミノ酸の液胞外への排出に機能す ることを明らかにした⁽⁷⁾．これらは単離液胞膜小胞の ATP依存的なアミノ酸取り込みへの各遺伝子破壊の影 響に基づいたものであったが，我々は銅処理法によって 抽出した液胞内アミノ酸試料の解析により， お よび 遺伝子の破壊や過剰発現によって中性アミ 図1■液胞膜を介したアミノ酸輸送

図2^■液胞膜小胞の単離

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ノ酸全般の液胞内含量が大きく変化することを見い出し た（図4_）．さらに液胞膜小胞に前負荷したこれらアミ ノ酸のATP依存的な排出活性を検出し，この活性が および の発現に依存することを明らかに した⁽¹¹⁾（図5_）．これらの結果はAvt3とAvt4が広い基

質特異性を有し，中性アミノ酸全般を液胞外へと排出す ることを示唆する．また液胞内の塩基性アミノ酸含量が 栄養豊富条件で を過剰発現すると大幅に減少し

（図4），欠損すると窒素飢餓条件での減少が部分的に抑 制されることを見い出した（図6_{）．塩基性アミノ酸は} 図3■酵母液胞アミノ酸トランスポーター 表1^■酵母液胞アミノ酸トランスポーターとそのホモログ

Superfamily Family 出芽酵母（ ） 分裂酵母（ ）

Transporter¹ Substrate Direction² Transporter¹ Substrate Direction² AAAP AVT Avt1 中性アミノ酸・ヒスチ

ジン in SpAvt3 中性・塩基性アミノ酸 out

Avt2 unknown ̶

Avt3 中性アミノ酸 out

Avt4 中性・塩基性アミノ酸 out SpAvt5 チロシン・グルタミン 酸・塩基性アミノ酸 in

Avt5 unknown ̶

Avt6 酸性アミノ酸 out Avt7 中性アミノ酸 out MFS VBA Vba1 リジン・ヒスチジン・

Quinidine・Azole in Fnx1 リジン・アスパラギ

ン・イソロイシン in Vba2 塩基性アミノ酸・

Quinidine・Azole in

Vba3 リジン・ヒスチジン in Fnx2 リジン・アスパラギ

ン・イソロイシン in Vba4 Quinidine・Azole in

（Vba5） アルギニン・NQO³ （細胞膜）

（Azr1） Azole （細胞膜） SpVba2 塩基性アミノ酸 in

（Sge1） Crystal violet （細胞膜）

Atg22 チロシン・ロイシン out SpAtg22 塩基性アミノ酸 in TOG PQ-loop 

protein Ypq1 リジン・アルギニン in （Stm1） （栄養情報伝達） （細胞膜）

Ypq2 アルギニン in

Ypq3 unknown ̶

Ers1 unknown ̶

APC Uga4 GABA in ̶ ̶ ̶

1カッコ内は液胞膜以外に局在するタンパク質を示す

2 in: 液胞内への取り込み，out: 液胞外への排出，̶：不明

3 4-Nitroquinoline  -oxide

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液胞膜小胞へのATP依存的取り込み活性が非常に高い ため，排出活性を検出できない．そこでアミノ酸を前負 荷せず液胞膜小胞のATP依存的な取り込みを測定した と こ ろ，塩 基 性 ア ミ ノ 酸 のATP依 存 的 取 り 込 み が 過剰発現によって減少した（図7_{）．これらは，}

Avt4が塩基性アミノ酸の排出にも機能することを示唆 する⁽¹¹⁾．

Avt3, Avt4, Avt6に よ る ア ミ ノ 酸 排 出 活 性 はV-

ATPase阻害剤であるコンカナマイシンAやH^＋／K^＋イ オノフォアであるニゲリシンによって阻害されることか ら，液胞からのアミノ酸排出も取り込み同様プロトン駆 動力を利用すると考えられる^(7, 11)．さらに最近，機能未 知であったAvt7も中性アミノ酸の排出に関与すること が報告された⁽¹²⁾．こうしたアミノ酸排出機構の解明は，

液胞内へのアミノ酸取り込みについても新たな知見をも たらしている．当初，液胞内に能動的に取り込まれない とされたアラニンやバリン，トレオニンといった多くの 中性アミノ酸は， ∆ ∆株由来の液胞膜小胞に ATP依存的に取り込まれた⁽¹³⁾．すなわち，液胞膜小胞 のアミノ酸輸送は排出と取り込みによりバランスがとら れており，排出活性を欠損させると取り込み活性が検出 さ れ る．我 々 は こ れ ら ア ミ ノ 酸 の 取 り 込 み 活 性 が を破壊すると消失することを見い出した．Avt1 依存的なイソロイシン取り込みの mはアルギニンと同 様10⁻³ M程度と低親和性である．さらに，このイソロ イシン取り込みに対する競合阻害実験より，Avt1が中 図4■ ／ の破壊および過剰発 現による液胞内アミノ酸含量の変化 栄養豊富条件で培養した細胞より銅処理によ り抽出した液胞内アミノ酸をアミノ酸自動分 析計により解析した．塩基性アミノ酸含量は 右側の別グラフに示す．pGPD:  過剰発現ベ クター .

図5^■液胞膜小胞からのアミノ酸排出 A. 液胞膜小胞からのアミノ酸排出活性測定．

14C標識した各アミノ酸を前負荷した液胞膜 小胞に2 mM ATPを添加し，経時的に小胞 内のアミノ酸含量を測定した．B. Avt3およ びAvt4による中性アミノ酸の排出．図示し た各ベクターを導入した ∆ ∆株から液 胞膜小胞を単離し，アミノ酸排出活性を測定 した．前負荷したアミノ酸量を100％とし相 対値をプロットした．実線はATP存在下，

点線はATP非存在下での測定結果を示す．

C.  液胞膜小胞のプロトン／アミノ酸共輸送 モデル．

図6■窒素飢餓条件での液胞内塩基性アミノ酸含量の減少 白棒：栄養豊富条件．黒棒：窒素飢餓条件（6時間）．

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性アミノ酸全般だけでなく塩基性アミノ酸であるヒスチ ジンも液胞膜小胞へと取り込むことが明らかとなっ た⁽¹³⁾．こうしたAvt1によるアミノ酸の取り込みは小胞 内酸性化に伴う蛍光色素キナクリンの消光効果を利用し てプロトンとの対向輸送であることが示されている⁽¹³⁾．

∆ ∆株の を破壊すると中性アミノ酸全般 の液胞内含量が減少することから， においても Avt1が幅広い基質特異性をもち，これらアミノ酸の液 胞内への取り込みに機能すると考えられる⁽¹³⁾．

2. VBAファミリー

VBAフ ァ ミ リ ー はMajor facilitator superfamily

（MFS）のサブファミリーであり，出芽酵母では11〜12 回膜貫通型タンパク質である7種のメンバーから構成さ れる．我々はこの中のVba1を欠損すると細胞の塩基性 アミノ酸取り込みが減少することを見い出した．Vba1 のGFP融合タンパク質は液胞膜へと局在し，欠損株か ら単離した液胞膜小胞では塩基性アミノ酸のATP依存 的取り込みが大幅に減少した．Vba2とVba3の欠損株 も同様に塩基性アミノ酸の取り込みが減少したことか ら，これらが液胞アミノ酸輸送に関与することが示唆さ れた⁽¹⁴⁾（表1，図3）．しかし， ∆ ∆ ∆株にお いても塩基性アミノ酸の取り込み活性が依然検出される ことから，他のトランスポーターの関与が示唆されてお り，Avt1や後述のYpqタンパク質との機能重複につい て今後検討が必要である．

VBAファミリーに近縁のトランスポーターはいずれ

も薬剤耐性への関与が報告されており，VBAファミ リーにおいてもAzr1とSge1は細胞膜に局在し薬剤の排 出に機能することが示唆されている^(15, 16)（表1）．Vba5 はVba3と非常に高い相同性を有するが，細胞膜に局在 し，薬剤およびアルギニンの細胞内への取り込みに関与 すると考えられる⁽¹⁷⁾（表1）．また，Vba4は液胞膜に局 在するがアミノ酸輸送には関与せず，これも薬剤耐性に 関与する⁽¹⁸⁾．Vba1およびVba2も欠損株の薬剤感受性 試験より塩基性アミノ酸に限らず幅広い基質を輸送する ことが示唆されている⁽¹⁸⁾．

3. Atg22

真核細胞は飢餓条件に移すとオートファジーを誘導 し，二重膜小胞であるオートファゴソームをサイトゾル 中に形成する．やがてその外膜が液胞膜と融合し内膜に 包まれたオートファジックボディ（AB）が液胞内腔に 放出され，内容物が分解されてアミノ酸を産生する．

MFSに属するAtg22は液胞膜に局在し，欠損するとAB が分解されず液胞内に蓄積する．その原因としてAtg22 が液胞外へのアミノ酸排出に機能し，欠損するとAB分 解にはたらく液胞内在性プロテアーゼ合成へのアミノ酸 供給が低下するためと説明されている⁽¹⁹⁾．しかし，先 述のAvt3, Avt4, Avt6といった排出系トランスポー ターの多重欠損株ではABの蓄積は見られず（未発表）， Atg22欠損に伴う飢餓条件での液胞内アミノ酸含量や，

液胞膜小胞のアミノ酸輸送活性の変化も検討されていな い．アミノ酸リサイクルとオートファジックボディ分解 図7^■液胞膜小胞のATP依存的なアルギニ ン取り込み

A.  液胞膜小胞へのアルギニンおよびカルシ ウムのATP依存的取り込み活性測定．液胞 膜小胞にATPと¹⁴C標識アルギニンもしくは カルシウム（⁴⁵Ca）を添加し，小胞内含量を 経時的に測定した．ATP未添加でも同様に 測定し，ATP存在下での測定値から差し引 いた値をATP依存的な取り込みとした．B. 

過剰発現による液胞膜小胞のアルギニ ン取り込みの減少．図示した各ベクターを導 入した ∆ ∆株から液胞膜小胞を単離 し，ATP依存的なアルギニンとカルシウム の取り込みを測定した．C.  液胞膜小胞のア ルギニン輸送モデル．小胞内に取り込まれた アルギニンがAvt4によって排出されるため，

小胞へのアルギニン取り込みが減少する．

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の因果関係についてはさらなる検証が必要とされる．

4. PQループタンパク質

Transporter-opsin-G  protein  coupled  receptor

（TOG）スーパーファミリーに属する線虫LAAT-1およ びヒトPQLC2はリソソームからの塩基性アミノ酸排出 に機能する^(20, 21)．これらは7回膜貫通型と予想され，保 存されたプロリン-グルタミン連続2残基配列をもつこ とからPQループタンパク質と呼ばれている（図8_A）． 出芽酵母PQループタンパク質であるYpq1とYpq2は液 胞膜に局在し⁽²¹⁾，我々はYpq1が液胞膜小胞へのATP 依存的なリジンの取り込みに関与することを報告し た⁽²²⁾（図8B）．また，アルギニンのATP依存的な取り

込みも 破壊によって部分的に低下し（図8B）， との二重破壊によってさらに大幅に低下したこと から，Ypq1とYpq2はともにアルギニンの取り込みに 機能することが示唆されている．アルギニンの液胞膜小 胞への取り込みにはプロトンとの対向輸送の他にヒスチ ジンとの交換輸送も報告されているが⁽⁴⁾，我々はこの活 性の実体がYpq2であることを示す結果を得ている（日 本農芸化学会2015年度大会にて発表）．しかし， ∆

∆株の液胞には依然として塩基性アミノ酸が高度に 蓄積するため，前述のようにVbaタンパク質との機能 重複を検討する必要がある．また，塩基性アミノ酸の蓄 積には負電荷をもつポリリン酸との相互作用が関与する と考えられている⁽²³⁾．現在，ポリリン酸合成酵素やリ

図8^■PQループタンパク質のアライメントと 破壊による液胞膜小胞のアミノ酸取り込み活性の変化

A. PQループタンパク質のCLUSTALWプログラムによるアライメント．予測された膜貫通領域（TM1〜7）とプロリン‒グルタミン保存 配列（緑枠）を示した．B. 野生株（WT）と ∆株から単離した液胞膜小胞の各アミノ酸のATP依存的取り込み活性．

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ン酸を液胞外へと排出するトランスポーターも同定さ れ，その分子基盤を明らかにする環境が整ってきたとい える．

出芽酵母ゲノムにコードされるPQループタンパク質 にはさらにYpq3とErs1がある．Ypq3の機能は未知で あるが，Ers1は動物リソソームからシスチンを排出す るシスチノシンのホモログとして解析されている．

Ers1欠損株のハイグロマイシン感受性がシスチノシン 発現によって抑制されることが報告されているが，シス チン輸送活性については依然未検証である⁽²⁴⁾．

5. Uga4

前述のように液胞アミノ酸輸送に機能するVba1は欠 損すると細胞のアミノ酸取り込みも減少する．Amino- acid-polyamine-organocation（APC）ファミリーに属す るUga4も欠損すると細胞のGABAの取り込みが減少す るが，液胞膜に局在することから，液胞膜を介した GABA輸送への関与が示唆されている⁽²⁵⁾．APCに属す るトランスポーターの多くは欠損や過剰発現によって細 胞のアミノ酸取り込み活性が変化するが，細胞内局在が 未検証のものが含まれる．これらの細胞内局在検討によ り新規液胞アミノ酸トランスポーター同定につながる可 能性がある．

分裂酵母の液胞アミノ酸輸送系

分裂酵母 ゲノムにコード

されるVBA, AVT, YPQのホモログはそれぞれ三つ

（Fnx1, Fnx2, SpVba2），二つ（SpAvt3, SpAvt5），一つ

（Stm1）と出芽酵母よりも少ない（表1，図3）．した がって遺伝子間の機能重複が少なく，液胞アミノ酸輸送 の生理的意義を明らかにするうえで有利と予想される．

分裂酵母で発現したVBAとAVT各ホモログのGFP融 合タンパク質はいずれも液胞膜に局在するが，液胞の単 離法が確立されておらず，単離液胞膜小胞を用いたアミ ノ酸輸送活性の測定ができない．そこで我々は，分裂酵 母細胞のアミノ酸取り込みを指標にできないかと考え た．プロトン濃度勾配を駆動力として液胞内に取り込ま れるアミノ酸は分裂酵母細胞への取り込みがV-ATPase 特異的阻害剤であるコンカナマイシンAによって阻害 される．一方，液胞内へ能動的に取り込まれないグル コースアナログである2-Deoxy-D-glucoseの細胞内への 取り込みは阻害されない．このことは液胞内への能動的 な取り込み活性の変化が細胞内への取り込みに反映され ることを示す．これを利用して，Fnx1とFnx2がリジ

ン，イソロイシン，アスパラギン，SpVba2が塩基性ア ミノ酸全般，SpAvt5が塩基性アミノ酸，チロシン，グ ルタミン酸をそれぞれ液胞内に取り込むことが示唆され

た^(26〜28)（表1，図3）．

近年では出芽酵母でホモログを発現させ，単離液胞膜 小胞を用いてそのアミノ酸輸送活性が検討されている．

SpVba2を出芽酵母で発現させると単離液胞膜小胞の ATP依存的な塩基性アミノ酸の取り込みが増加した⁽²⁹⁾． この結果は細胞内へのアミノ酸取り込み活性を指標に得 られた結果と一致する．また，SpAvt3についても出芽 酵母で発現させると液胞膜に局在し，単離液胞膜小胞の 中性／塩基性アミノ酸の排出が増加した⁽³⁰⁾．さらに SpAvt3を欠損した分裂酵母細胞では液胞内の中性／塩 基 性 ア ミ ノ 酸 の 含 量 が 大 幅 に 増 加 し た こ と か ら，

SpAvt3は分裂酵母の排出系液胞アミノ酸トランスポー ターとして機能すると考えられる⁽³⁰⁾．

分裂酵母PQループタンパク質であるStm1は細胞膜 に局在し，Gタンパク質（Gpa2）と結合する栄養感知 受容体として機能することが示唆されている⁽³¹⁾．出芽 酵母Ypqタンパク質とは局在性も機能も異なるが，ト ランスポーターの中には栄養状態を感知する受容体とし て機能するものが報告されており，出芽酵母Ypqタン パク質もそのような機能をもつのかは今後の検討課題で ある．

分裂酵母ゲノムには出芽酵母Atg22と42％の相同性 をもつSpAtg22がコードされている．出芽酵母Atg22 はアミノ酸排出への関与が示唆されているが，SpAtg22 は細胞へのアミノ酸取り込みに基づく評価より塩基性ア ミノ酸を液胞内に取り込むことが示唆されている⁽³²⁾． 前述のとおり，液胞膜小胞などを用いた直接的なアミノ 酸輸送活性の検討が必要とされる．

植物病原菌 の液胞アミノ酸

輸送系

フザリウム菌の1種 は植物の根から感 染し，萎凋性病害を引き起こす病原菌である．最近我々 は のAvt3ホモログ（FoAvt3）が

細胞の液胞膜に局在することを見い出した．さ らに出芽酵母で発現させると液胞内の中性アミノ酸含量 が減少し，単離液胞膜小胞からの中性アミノ酸排出活性 も増加した⁽³³⁾．近年，フザリウム菌の病原性における オートファジーの重要性も相次いで報告され^(34, 35)， 我々の研究を起点に液胞アミノ酸リサイクルが果たす役 割も今後明らかとなる可能性がある．真核微生物の Avt3／Avt4ホモログのN末端側には後述するように

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200アミノ酸残基以上の親水性領域が存在し（図9_），活 性調節への関与が示唆されている．このような長い親水 性領域は動植物のAvtホモログには存在しないため，

病原性真菌に特異的な阻害効果をもつ薬剤の開発につな がる可能性がある．

植物・動物の液胞／リソソームアミノ酸輸送 植物では窒素源が過剰供給されるとアミノ酸が液胞内 に貯蔵され⁽³⁶⁾，周囲の栄養環境が整うとタンパク質合 成に使われる．窒素化合物の転流は種子形成に重要であ ることから，液胞アミノ酸輸送の改変は農作物の収量や 品質向上といった応用展開につながると考えられる．植 物の液胞には大量のアミノ酸が蓄積するが，その体積が 非常に大きいため，アミノ酸濃度はサイトゾルや葉緑体 よりも低く，能動的な排出機構の存在が示唆されてい る．実際，葉細胞から単離した液胞にはいくつかの中性 および塩基性アミノ酸排出系の存在が示唆されてい

る^(37, 38)．シロイヌナズナ単離液胞のプロテオミクス解

析よりAPCに属するCAT（cationic amino acid trans- porter）ファミリーのうちいくつかは液胞に存在するこ と が 示 唆 さ れ⁽³⁹⁾，最 近 ト マ ト のCAT9ホ モ ロ グ が GABAとグルタミン酸／アスパラギン酸の交換輸送体 であることが報告された⁽⁴⁰⁾．プロテオミクス解析では Avt1とAvt6ホモログの液胞への局在も示されている．

シロイヌナズナゲノムには19種のAvtホモログがコー ドされており，最近我々はシロイヌナズナAvt3ホモロ グの一つ（AtAvt3a）がシロイヌナズナ細胞の液胞膜に 局在することを見い出した．出芽酵母 ∆ ∆株に

発現したAtAvt3aは液胞膜に局在し，液胞内中性アミ ノ酸含量を低下させた．さらに単離液胞膜小胞のアミノ 酸輸送活性測定より，AtAvt3aは出芽酵母Avt3と同 様，中性アミノ酸の輸送能を有することが示唆されてい る（投稿中）．

動物細胞では前述のようにAAAPに属するSLC32 ファミリーのVGAT／VIAAT／UNC-47がシナプス小 胞へのGABAおよびグリシン輸送を担う^(9, 10)．AAAP にはSLC32の他にSLC36とSLC38ファミリーも含まれ ており，SLC36にはリソソームからの中性アミノ酸排出 に機能するLYAAT-1が属する⁽⁸⁾．SLC32およびSLC36 ファミリーのトランスポーターはプロトン濃度勾配を駆 動力とするが，SLC38ファミリーのトランスポーターは いずれもナトリウム依存性である．SLC38A9はリソ ソーム膜に局在し，再構成したリポソームは内部のナト リウムおよび酸性pHに依存してさまざまなアミノ酸を 内外へと輸送することが示されている ^(41, 42)．

PQループタンパク質ではシスチノシンがプロトンと の共輸送によってシスチンをリソソームから排出するこ とが報告されている⁽⁴³⁾．シスチノシン遺伝子はシスチ ン症の原因遺伝子であり，変異によるリソソーム中での シスチン蓄積が細胞障害を生じる．また，別のPQルー プタンパク質であるPQLC2（LAAT-1）はリソソーム から塩基性アミノ酸を排出する⁽²⁰⁾．シスチノシンの治 療に投与されるシステアミンはリソソーム内でシスチン とジスルフィド結合によって，リジンと類似の構造をも つMxDと呼ばれる化合物となる．PQLC2はMxDをリ ソソーム外へと排出することが示唆されており，その活 性を増強することにより効果的な治療が可能となるかも 知れない．

動物リソソームのアミノ酸代謝における重要性は近年 のオートファジー研究の飛躍的進展とともに大いに注目 されている．動植物では未解析のAvt／Ypqホモログが 数多く残っており，今後これらの解析も進むと考えられ る．

液胞／リソソームアミノ酸輸送の制御

細胞膜局在性のアミノ酸トランスポーターは細胞内外 の栄養環境に応答して転写および翻訳後段階での調節を 受ける．液胞／リソソーム膜局在性のアミノ酸トランス ポーターも細胞内アミノ酸レベルを好適化するために緻 密な制御を受けても不思議ではない． や といった排出系トランスポーター遺伝子の転写はマイク ロアレイ解析より窒素飢餓条件で増加することが示され 図9^■Avt3／Avt4ホモログのN末端親水性領域

出芽酵母（ ）Avt4と分裂酵母（ ），植物病原

性真菌（ ），ヒト病原性真菌

（ ， ），ヒト，シロイヌナズ

ナの各Avt4ホモログの膜貫通ドメインをTMHMMプログラムに より予測した．アミノ酸残基数（a.a.）は予測されたN末端親水性 領域の長さを示す．

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ている⁽⁴⁴⁾．また はリジン存在下で転写が誘導さ れることから， や と同様に塩基性アミノ酸 輸送への関与が示唆されている⁽²¹⁾．

翻訳後段階での調節では最近，リジン欠乏培地での Ypq1の分解誘導が報告された⁽⁴⁵⁾．Ypq1はリジン欠乏 に応答してユビキチンリガーゼRsp5によってユビキチ ン化され，一旦，液胞から離れ，Multivesicular body へと移行し，やがて液胞内腔へと輸送されて分解され る．液胞膜に局在するタンパク質レベルを適正に維持す る機構は長らく不明であったが，このような機構が他の 液胞アミノ酸トランスポーターにも作用するのか興味深 い．

トランスポーターの中にはその親水性領域が活性調節 に機能するものが知られている．出芽酵母Avt3／Avt4 およびそのホモログのN末端には200アミノ酸残基以上 の長い親水性領域が存在する（図9）．我々は出芽酵母 Avt4のN末端親水性領域を欠損すると液胞からのアミ ノ酸排出が亢進することを見い出しており，この領域の 活性調節機能について現在研究を進めている（日本農芸 化学会2014年度大会にて発表）．

液胞アミノ酸トランスポーターのユビキチン化の誘導 や活性化にはたらく分子機構は現段階では全く不明であ るが，Avt1とAvt4はキナーゼ複合体であるTOR com- plex 1（TORC1）の阻害剤ラパマイシンの添加によっ て脱リン酸化されることが報告されている⁽⁴⁶⁾．TORC1 は細胞内外の栄養情報を伝達し，下流遺伝子の転写およ びリボソーム生合成や翻訳活性，オートファジー活性な どを調節する．我々もTORC1が不活性化する窒素飢餓 条件においてAvt4の脱リン酸化を検出しており，トラ ンスポーターのリン酸化状態の変化が調節の引き金とし て機能する可能性が考えられる．

液胞／リソソームアミノ酸輸送の生理的意義 出芽酵母のオートファジー欠損株は窒素飢餓条件にお いてタンパク質合成が低下し速やかに生存率が低下する ことから，液胞内アミノ酸のリサイクルは細胞の飢餓適 応に非常に重要と考えられている⁽⁴⁷⁾．胞子形成はこう した飢餓適応の一つであるが，分裂酵母の胞子形成効率 はSpAvt3の欠損によって部分的に低下し⁽⁴⁸⁾，出芽酵母 においても ,  ,  の多重破壊による部 分的な低下が示された⁽¹²⁾．窒素飢餓条件での液胞内ア ミノ酸含量は 多重破壊株においても部分的に減少 することから（未発表），依然未同定の排出系トランス ポーターが存在すると考えられる．液胞アミノ酸リサイ

クルの生理機能を正確に理解するうえではこうした「欠 けたピース」を地道に埋めていく作業が必要である．

最近，動物細胞においてSLC38A9がRag GTPaseと の結合を介して哺乳類TORC1活性の調節に直接的に関 与することが報告され，液胞／リソソームアミノ酸プー ルは単なる栄養源としてだけではなく，栄養情報伝達の 起点として機能する可能性が示唆された^(41, 42)．これと 関連してTORC1は寿命決定に関与するが，出芽酵母に おいて を破壊すると寿命が短縮され，過剰発現 すると逆に延びることから，液胞内へのアミノ酸取り込 みが寿命決定に関与することが示唆されている⁽⁴⁹⁾．液 胞／リソソームアミノ酸輸送に関わる分子装置の同定解 析が進めば，これらの作用機序についてさらに具体的な モデルが構築できるだろう．

おわりに

細胞内アミノ酸量はアミノ酸の細胞内への取り込み，

アミノ酸やタンパク質の合成および分解活性によって変 化し，各々が栄養条件によって厳密に制御されている．

本稿で解説した液胞／リソソーム膜を介したアミノ酸輸 送はこうした細胞内アミノ酸レベルの重要な調節機構の 一つとして認識されつつある．これまで同定されたトラ ンスポーターは重複した基質特異性をもつものが多く，

トランスポーターの同定が進めば，こうした機能重複が さらに顕著化するであろう．個々のトランスポーターの 特異的な生理機能を理解するには，速度論的解析による 輸送活性や基質との親和性などの生化学的な特徴づけが 必要である．しかし，この点については依然手つかずの 状態である．とりわけ排出系トランスポーターの酵素学 的な解析は液胞膜小胞を用いた解析では困難であり，精 製トランスポーターを再構成したリポソームでの解析が 必要とされる．創薬などへの応用展開には酵素学的な知 見とトランスポーターの構造情報を組み合わせた構造機 能相関の議論が重要であるが，AAAPファミリーやPQ ループファミリーの構造情報はいまだ得られておらず，

残された重要課題の一つである．液胞／リソソームアミ ノ酸トランスポーターの研究は近年のオートファジー研 究の著しい進展とともに，TORC1活性調節や寿命決定 の分野においてもその重要性が認識され始め，今後多く の研究者の参入が予想される．さらに多角的な知見が集 積することによって基礎研究にとどまらず，農学的／医 学的な応用への展開が期待される．

謝辞：本稿で紹介した筆者らの研究は文部省科学研究費補助金（課題番 号15H04486, 15K07396, 10F00410, 21570200, 18056015, 13119201），エリ

日本農芸化学会

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ザベス・アーノルド富士財団学術研究助成，野田産研研究助成，タカノ 農芸化学研究助成の支援を受けて行われた．また，竹川 薫教授（九州 大学農学部），秋山浩一准教授，河田美幸准教授（ともに愛媛大学学術支 援センター），島津昌光助教（室蘭工業大学），藤木友紀助教（埼玉大学 理学部）との共同研究によるものであり，深く御礼申し上げたい．

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プロフィール

関藤 孝之（Takayuki SEKITO）

＜略歴＞1991年広島大学理学部生物学科 卒業／1996年同大学大学院理学研究科生 物科学博士課程修了．博士（理学）／同年 日本学術振興会特別研究員（PD）／1997年 米国テキサス大学サウスウエスタンメディ カルセンター博士研究員／2001年基礎生 物学研究所研究員／2002年日本学術振興 会特別研究員（PD）／2005年基礎生物学研 究 所 研 究 員／2007年 愛 媛 大 学 農 学 部 助 教／2014年同准教授，現在に至る＜研究 テーマと抱負＞液胞膜を介したアミノ酸輸 送に関わる分子装置の同定解析とその生理 的意義および分子機構の解明＜趣味＞ドラ イブ，80ʼs洋楽，蒸気機関車DVD鑑賞

柿沼 喜己（Yoshimi KAKINUMA）

＜略歴＞1975年埼玉大学理工学部生化学 科卒業／1980年東京大学大学院薬学系研 究科博士課程修了．薬学博士／1980年千 葉大学生物活性研究所助手／1986年同大 薬学部助手／1996年同助教授／2001年室 蘭工業大学工学部教授／2003年愛媛大学 農学部教授，現在に至る＜研究テーマと抱 負＞細胞内膜系を中心にしたイオン共役型 エネルギー変換機構の分子的理解とその利 用

Copyright © 2016 公益社団法人日本農芸化学会 DOI: 10.1271/kagakutoseibutsu.54.324

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