プロダクトイノベーション

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化学と生物 Vol. 52, No. 10, 2014

不斉合成用生体触媒ライブラリー Chiralscreen®

株式会社ダイセル研究開発本部コーポレート研究センター

林素子，上田桃子，山本浩明

光学活性化合物は，かつてはアミノ酸や糖などの天然物に由来する不斉点（キラルプール）を利用して目的物質を合成するか，優先晶析法で物理的に分割，あるいはジアステレオマー法で化学的に分割するしかなかった．

これらの方法は現在でも有力な方法である．しかし，これらの方法では，求める構造の化合物を必ずしも入手できるとは限らない．

近年はさまざまな不斉合成法の進歩，あるいはキラルカラムクロマトグラフィー法の進歩により，求める構造の化合物を入手できるようになってきた．人工合成した光学活性化合物が最も広く使われていると考えられる製薬業界では，新規に認可された医薬品のうち，光学活性化合物の占める割合は67%に達している．このうち，

光学活性体として使用されている化合物の割合は全体の 57%を占め，ジアステレオマー，またはラセミ体として用いられている化合物はわずか10%にとどまる^（1）

．こ

のことは，対掌体間で生理活性や毒性などに差があることから^（2）

，各対掌体は別の化合物であるとの認識が定着

し，光学活性体の作り分けが重要視されていることを示している．さらに，光学活性化合物の使用は香料にも広がっている^（2）

．たとえば，メントールには3つの不斉点

があるが，そのうち（1 , 2 , 5 ）体である -メントール（図

1

）だけが清涼感のある香りを有していることはよく知られていることである．同様に， -ノートカトンも3つの不斉点を有する化合物であるが，そのうちの一つの異性体のみがグレープフルーツの香りを有する^（3）

．

このように，医薬品や農薬のみならず，広い分野で光学活性化合物が実際に使用され，あるいは使用を求められていることは疑いがない．

一方で，光学活性化合物の合成法として，生体触媒を使用する方法も一部ではよく使われてきた．生体触媒とは，微生物や生物の組織そのもの，あるいはそこから抽出し，（粗）精製した酵素のことであり，加水分解酵素で

あるリパーゼやパン酵母（）

を用いた不斉合成は，有機合成化学の分野でも比較的なじみのある生体触媒である．しかし，リパーゼは立体選択的な加水分解あるいはエステル化を行う酵素であり，

通常はラセミ体を反応に供し，どちらかの対掌体だけを反応させることで光学活性体を得るため，半量は使用できない．また，パン酵母は複数の酵素を含んでおり，基質に対して複数の酵素が競争的に反応する．そのため，

立体選択性の異なる複数の酵素が反応する場合は立体選択性が低くなり^（4）

，官能基選択性・位置選択性の異なる

複数の酵素が反応する場合には反応選択性が低くなる^（5）

ということが起こりうる．また，酵素の速度定数などの性質の違いにより，反応条件によっても得られる生成物の光学純度や反応収率が変化する可能性があるため，安定した光学純度，収率を得るには難がある．

一方，精製した酵素を用いる反応ではパン酵母で述べたような問題は起こりにくい．しかし，酵素を精製するためには手間と設備が必要であり，精製酵素は「生もの」であって保存性も一般的には低いことから，さまざまな分野で使用するのは困難である．そこで，当社では

「Cloned Enzyme Library」と称する，高い立体選択性および反応選択性を有する特定の酵素のみを大量発現させた組換え大腸菌のライブラリーを構築し，これを工業的に光学活性化合物の製造に使用してきた^（6）

．これら

OH O

l-Menthol d-Nootkatone

図1^■ -メントールと -ノートカトン

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は，目的とする酵素のみを大量に発現しているため，精製をしなくても擬似的に（粗）精製酵素として用いることができ，反応を安定して行うことができる．しかし，この場合も組換え大腸菌を培養し，使用するためのインフラが必要であり，2004年からは遺伝子組換え生物等の使用等の規制による生物の多様性の確保に関する法律

（以後，カルタヘナ法と称する）に基づいた管理が必要となったため，光学活性化合物を製造する企業のうち，

組換え大腸菌を用いた検討を行える企業は限定的である．

組換え大腸菌からChiralscreen^®へ

当社は，酵素が有している高い立体選択性・位置選択性・官能基選択性を伴った物質変換能力を広く活用してもらいたいと考え，有機合成化学に携わる人たちに，酵素を有機合成に使用することに対する印象を聞いてみたところ，次のような答えが得られた．

1．酵素は不安定なので使いにくい．

2．酵素は水中で使用するので，基質が溶解しない．

3．特別な設備や試薬が必要．

4．酵素というものがそもそもよくわからない．

これらの懸念を払拭すれば酵素（生体触媒）の使用が広まるのではないかと考え，解決策を見いだしていくことにした．

酵素の安定性は，もちろん反応中に失活していくということも含まれているであろうが，「生もの」なので保存ができないということの方が大きいと思われた．酵素の保存安定性を高めるために，溶液状態ではなく，凍結乾燥した粉末の形態とすることにした．

2つ目の懸念については，リパーゼなどの一部酵素を除くほとんどの酵素は水中で用いるものであり，有機合成に通常使われる基質は水溶性が低い．しかし，実際には，反応を進行させるためには溶解度はそれほど重要ではない．たとえば，当社では，水に対する溶解度が 2 mM以下と極めて水溶性の低い3′,5′-bis（triﬂuoromethyl）

acetophenoneに対して基質濃度10%で酵素反応を実施し，ほぼ定量的に，かつ99%e.e.以上の立体選択性で反応が進行することを確認している（図

2

_）

_{．このような}

データを機会があるごとに示していくことにした．

培養が不要であれば培養に必要な装置類は不要である．また，生きている遺伝子組換え菌を完全に除去してしまえばカルタヘナ法の適用を受けないため，法の求める設備などの対応も不要である．それゆえ，酵素の生産には（遺伝子組換え）菌を使用するにしても，除菌した

上で製品化することにした．菌を除去してしまうと，反応に必要な補因子（補酵素など）を反応系内に添加しなければならなくなる．そのため，小スケールの製品には反応に必要な補因子は緩衝液などとともに添付した．手軽に使ってもらえる形態にして，多くの人にまず酵素を手に取ってもらい，その選択性の高さなど，人それぞれの価値を見いだしてもらうことにより，4つ目の懸念点も払拭いただけると考えた．

こうして，「準備いただくのは，基質と水と分析装置だけ」で酵素反応ができるChiralscreen^®が誕生した．

補酵素再生系の改良

当社は光学活性アルコールの製造を行ってきたことから，Chiralscreen^®に含まれる酵素はアルコール脱水素酵素，カルボニル還元酵素が多い．これらの酵素は，還元反応の水素源として補酵素（NADHもしくは NADPH）を基質と当量必要とする．菌体反応の場合は菌体中の補酵素とその再生系をそのまま反応に利用できるが，Chiralscreen^®は菌体を除去しているので，補酵素の添加は必須となる．補酵素は酵母からの抽出によって製造されるために非常に高価であり，基質と当量を添加することはコスト的に見合うものではない．すなわち，実用化に向けては補酵素の再生方法が鍵になるといっても過言ではない．

補酵素の使用量を低減するために，アルコール脱水素酵素^（7）

，グルコース脱水素酵素

^（8）

，ギ酸脱水素酵素

^（9）

，

亜リン酸脱水素酵素^（10）などによる酸化反応と共役した補酵素の再生方法が検討されてきた（図

3

_）

_{．しかし，}

アルコール脱水素酵素は主反応である還元に適した環境中で酸化反応を行わせるために2-プロパノールを大過剰に添加する必要があり，2-プロパノールと生成するアセトンで酵素が変性したり，逆反応が進行したりするという問題がある．グルコース脱水素酵素は，C6化合物であるグルコースを基質とし，副生するグルコン酸に由来

O F₃C

CF3

OH F₃C

CF3

OH F3C

CF₃ Chiralscreen^{T M} E039

Chiralscreen^{T M} E092

>99%e.e.(R)

>99%e.e.(S)

図2■疎水性基質のChiralscreen^®による還元

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する環境負荷が高い．一方，ギ酸脱水素酵素（以後，

FDHと略す）は補酵素の再生に分子量の小さいギ酸を使用するため，ほかの方法と比較して廃棄物量が少なく，生成するのは二酸化炭素で系中にほとんど残存せず，目的物質の単離・精製を邪魔しないというメリット

があることから，当社では由来

のFDH（以後，McFDHと略す）の実用化に取り組んできた．一般的に野生型のFDHは活性が弱く，かつ不安定であり，実用化には向かないとされてきたが，複数のCys残基の置換を行うことで酵素の安定性が向上し，工業的に使用できる変異酵素McFDH-26を得ることができ，さまざまな化合物の反応に応用してきた^（11）

．

Chiralscreen^®でも，NADH依存性の酵素のほとんどは McFDH-26を共発現する系を採用している．

しかし，FDHはNAD^＋のみに親和性が高いため，

NADPHの再生ができないという問題があった．これまで当社ではNADPHの再生にはグルコース脱水素酵素を利用してきたが，環境負荷の低いFDHによるNADPH の再生は必要な技術と考え，これに取り組むこととした．

唯一NAD^＋とともにNADP^＋を利用できる野生型FDH として報告されている由来のFDH は，223位のGlnが補酵素選択性に影響しているとの報告がある^（12）

．この酵素とMcFDH-26のアミノ酸配列を

比較したところ，由来FDHのGln223に相当する残基はAsp222であったため，この位置に変異を導入することで補酵素選択性を改変できるのではないかと考えた．実際に222位に変異を導入し，酵素活性を測定したところ，Asp222Gln（McFDH-37）においてNADP^＋を利用できることが確認された（表

1

_）

_．Asp222Ala

（McFDH-29）においては，NAD^＋とNADP^＋の両方をほぼ同様に利用できることも示された．

グルコース脱水素酵素はNAD^＋とNADP^＋の両方を利

用できるが，たとえば由来のグ

ルコース脱水素酵素は，補酵素結合部位としてAsn211 とArg213が報告されている^（13）

．これらのうちAsn211は

McFDH-37のGln222に相当する．そこで，McFDH-37 の活性の上昇を目指し，由来グルコース脱水素酵素のArg213に相当するMcFDH-37のHis 224 にランダム変異を導入した変異体ライブラリーを作成し，評価を行った．その結果，活性が約1.7倍に上昇したHis224Asn変異体（McFDH-40）が得られた（表

2

_）

_．

モノづくりへの適用

こうして作成したNADP^＋依存性McFDH-40が実際の反応に適用できるかを検証するため，NADPH依存性トロピノン還元酵素による3-キヌクリジノンの還元反応を実施した．基質である3-キヌクリジノン塩酸塩の濃度は 5% （309 mM）とし，トロピノン還元酵素およびMcFDH- 40のChiralscreen^®を各0.5%，NADP^＋を2 mM，補酵素再生用基質であるギ酸ナトリウムを1 M添加して反応させたところ，反応は定量的に進行し，生成した3-キヌクリジノールの光学純度は99%e.e. （）であった（図

4

_）

_．

すなわち，McFDH-40においては，活性が弱く，不安定であるというFDHの欠点を克服したMcFDH-26の頑健性はそのままに，補酵素選択性をNADP^＋に変更することに成功したことが示された．

R1

R2

O

Alcohol dehydrogenase / Carbonyl reductase

R1

R2 OH

NAD(P)H NAD(P)

⁺

OH O

Alcohol dehydrogenase

Glucose dehydrogenase Glucose Gluconate

Formate dehydrogenase HCOOH CO

₂

Phosphite dehydrogenase Phosphite Phosphate

図3^■酵素による補酵素再生方法

表1^■補酵素選択性の改変 No. 222-Amino

acid residue

FDH activity （mU/mg）

NADP^＋/NAD^＋ NAD^＋ NADP^＋

McFDH-26 Asp

（native） 464 24.7 0.0533 McFDH-29 Ala 14.5 16.0 1.09 McFDH-37 Gln 61.4 315 5.13 McFDH-38 Asn 763 101 0.132 McFDH-39 Gly 566 162 0.286 表2^■活性の向上

ORF No.

Amino acid

residue FDH activity

（mU/mg） NADP^＋/NAD^＋ 222 224 NAD^＋ NADP^＋

McFDH-26 Asp His 464 24.7 0.0533 McFDH-37 Gln His 61.4 315 5.13 McFDH-40 Gln Asn 120 529 4.43

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McFDH-40をChiralscreen^®に加えることで，補酵素の再生に必要な資源投入量を削減でき，より環境負荷の低い不斉合成反応が構築可能である．反応溶媒として水を使用し，重金属などがなくても高い選択性が得られる酵素反応の良さを知っていただくべく，さらに改良を重ねていきたいと考えている．

文献

1) 村上尚道：月刊ファインケミカル，37, 94 (2008).

2) A. Mannschreck & R. Kiesswetter: , 84, 2012 (2008).

3) W. D. MacLeod: , 6, 4779 (1965).

4) K. Nakamura, Y. Kawai, N. Nakajima & A. Ohno:

, 56, 4778 (1991).

5) M. Utaka, S. Konishi & A. Takeda: , 27, 4737 (1986).

6) 山本浩明，小林良則：月刊ファインケミカル，36, 92 (2007).

7) 多田雅人，山村栄虎，加藤朋子，藤本昇，坂本恵司：

特開2004‒313033 (2004).

8) C-H. Wong, D. G. Drueckhammer & H. M. Sweers:

, 107, 4028 (1985).

9) Z. Shaked & G. M. Whitesides: , 102, 7104 (1980).

10) R. Hirota, S. Yamane, T. Fujibuchi, K. Motomura, T. Ishi- da, T. Ikeda & A. Kuroda: , 113, 445 (2012).

11) H. Yamamoto, K. Mitsuhashi, N. Kimoto, Y. Kobayashi &

N. Esaki: , 67, 33 (2005).

12) R. Hatrongjit & K. Packdibamrung:

, 46, 557 (2010).

13) A. Theodossis, C. C. Milburn, N. I. Heyer, H. J. Lamble, D. W. Hough, M. J. Dansonb & G. L. Taylor: , F61, 112 (2005).

プロフィル

林素子（Motoko HAYASHI）

＜略歴＞2002年京都大学大学院理学研究科化学専攻博士課程修了／同年ダイセル化学工業株式会社（現株式会社ダイセル）

入社＜研究テーマと抱負＞酵素の製造方法開発，酵素・微生物を用いた医薬中間体，

光学活性化合物，機能性素材の研究開発

＜趣味＞テニス，読書，ADH鍛錬上田桃子（Momoko UEDA）

＜略歴＞1999年京都大学大学院農学研究科応用生命科学専攻修士課程修了／同年ダイセル化学工業株式会社入社＜研究テーマと抱負＞物質混合系における物性発現メカニズムの解析＜趣味＞旅行，散歩

山本浩明（Hiroaki YAMAMOTO）

＜略歴＞1983年京都大学工学部工業化学科卒業／同年ダイセル化学工業株式会社入社／1984年京都大学化学研究所研究員（2 年間）／1986年エム・ディ・リサーチ株式会社研究員（5年間出向）／1997年ダイセル化学工業株式会社主任研究員／2002年同社主席研究員／2003年博士（農学）／2014 年コーポレート研究センター副センター長

＜研究テーマと抱負＞酵素・微生物を用いた医薬中間体，光学活性化合物，機能性素材の研究開発・マネジメントに従事＜趣味＞写真，サッカー観戦（特にアントラーズ），最近は孫守（？）

N

O Tropinone reductase

NADPH NADP

⁺

N OH

McFDH-40 HCOOH

CO

₂

HCl HCl

図4^■McFDH-40によるNADPH再生を利用した（）-3-キヌクリジノールの合成

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