はじめに
オートファジーは真核生物に広く保存された細胞内の 物質分解機構であり，細胞質のさまざまな成分やオルガ ネラを液胞（リソソーム）内部に運び込むことによって 分解する．この分子機構は，1990年代初めの出芽酵母 を対象にした大隅らの研究（1）
を嚆矢としてその詳細が明らかとなってきた．酵母で見 いだされた多くのオートファジー関連タンパク質（Au- tophagy-related proteins; Atgタンパク質と呼ばれる）
は哺乳類細胞においても保存されており，細胞内アミノ 酸プールの維持や，細胞内に蓄積した老廃物の除去に機 能することが見いだされている（2）．
オートファジーは形態学的にも，分子機構の点から見 ても多様である．これは分解するものの多様性に加え て，液胞への物質輸送の仕組みの多様性にも関連する．
ある生物種を対象に多様なオートファジー経路を解析す ることで，オートファジー機能の全容を明らかにするこ とが期待される．本稿では，異種タンパク質発現系とし て産業用途のみならず，オルガネラ研究のモデル生物と して広く用いられているメタノール資化性酵母（メチロ トロフ酵母）を対象として，ペルオキシソーム特異的 オートファジーを中心とした多様なオートファジー経路 の分子機構と，その生理機能について概説する．
メチロトロフ酵母のオルガネラダイナミクス メチロトロフ酵母の最大の特徴は，メタノールを代謝 するための特異的な代謝経路をもつことである．そのな かで経路上流の酵素群（メタノールオキシダーゼ，ジヒ ドロキシアセトンシンターゼ）はメタノールを炭素源と した培養時に大量に発現し，ペルオキシソームと呼ばれ るオルガネラに格納される（3）．また，メタノール代謝の 副産物である過酸化水素やそれに由来するヒドロペルオ キシドの除去システム（カタラーゼ，グルタチオンペル オキシダーゼ）もペルオキシソーム内に局在する．ペル オキシソーム形成不全株においては本酵母のメタノール 資化能が消失することから，本オルガネラによる代謝酵 素群の収納は生理的重要性をもつ．
一方でメタノール以外の多くの炭素源で生育する場 合，ペルオキシソーム内の代謝酵素は本酵母にとって不 要となる．メタノール生育時のメチロトロフ酵母ではペ ルオキシソームが菌体の80％の体積を占めるまで発達 しうるが，これが不要となると速やかに分解されること から，ほかの生物種では見られないほど顕著にペルオキ シソーム分解過程を追跡観察することができる．後述す るように形態学的，および遺伝学的な解析から，メチロ トロフ酵母におけるペルオキシソームの特異的分解は専 らオートファジーによることが明らかになり，ペルオキ シソーム特異的オートファジーはペキソファジーと称さ
セミナー室
広がるオートファジーの世界-7メチロトロフ酵母における多様なオートファジー経路とその生理機能
奥 公秀，田村直輝，阪井康能
京都大学大学院農学研究科
れている（図1）．
オートファジーによるペルオキシソーム分解の場とな る液胞は，単に分解すべきオルガネラを「待って」いる ばかりではなく，自ら変形し標的を包み込み，ダイナ ミックな動態を取る場合もある．メチロトロフ酵母の一 つ （ ） においては液胞の陥 入・隔膜化によりペルオキシソームを包み込むオート ファジー経路，ミクロペキソファジーの分子機構が詳細 に研究されており（図1），そこから得られた知見は単 にオートファジーのみならず，さまざまな環境条件に応 じた液胞変形の分子メカニズムの解明にも重要なものと なっている．
ペキソファジーの分子機構（1）ペルオキシソームの 認識と協調した新膜構造体形成システム
多くのオートファジー経路においては，隔離膜・オー トファゴゾームと呼ばれる二重膜構造体が形成されて分 解すべきものを取り囲むこと，またこれまでに同定され た多くのAtgタンパク質がその新膜構造体形成に機能 することが明らかとなっている．出芽酵母における網羅 的解析などから，この新膜構造体形成の最もベースにあ る因子（足場タンパク質）としてAtg11, Atg17が機能 することが明らかとなってきた（4, 5）．メチロトロフ酵母 においてもこの2つのオルソログタンパク質 が同定されており，このうち特にAtg11はペキソファ ジーに必須であることがわかっている（6）．
それでは，ペキソファジー誘導時に上記の新膜構造体 はどのようにしてペルオキシソームを特異的に取り囲む こ と が で き る の で あ ろ う か？ に お け る Atg30タンパク質の同定，解析がその分子機構を明らか にした（7）．Atg30は，ペルオキシソーム局在膜タンパク 質Pex3とPex14依存的にペルオキシソーム表面に局在 する．このタンパク質を欠損させた細胞株では，ほかの
オートファジー経路（ApeIと呼ばれるペプチダーゼの 液胞への輸送や，窒素源飢餓時の非特異的オートファ ジー）は正常な一方で，ペキソファジーが特異的に阻害 されていた．生化学的な解析から，Atg30タンパク質は 自身のリン酸化に依存して上記のオートファジー足場タ ンパク質Atg11と結合することが明らかとなった．ま たその後の解析から，Atg30タンパク質は新膜構造体の マーカータンパク質Atg8とも結合すること，その結合 にもAtg30のリン酸化が必要なことがわかった（8）．この ようにAtg30は，1）ペルオキシソームタンパク質と新 膜構造体形成のためのAtgタンパク質との双方に結合 し，2）リン酸化によって当該Atgタンパク質との結合 を調節できる，リセプタータンパク質としての機能を果 たすことが明らかとなった．
出芽酵母においてはAtg30タンパク質と同様の機能 を果たす因子としてAtg36が同定されている（9）．また出 芽酵母，メチロトロフ酵母のミトコンドリア特異的オー トファジー（マイトファジー）に関しても，ミトコンド リア外膜に局在しAtg8, Atg11と結合するアダプタータ ンパク質Atg32が同定されており（マイトファジーに関 しては本特集川俣らの項も参照），これらの生物種のペ キソファジーとマイトファジーに類似したリセプタータ ンパク質が機能していることがわかった．現在，これら リセプター分子の発現やリン酸化制御の詳細な分子機構 解明を通じて，オルガネラ特異的オートファジーの制御 システムをより精緻に理解するための試みがなされてい る．
ペキソファジーの分子機構（2）ミクロペキソファ ジーと液胞膜動態制御に機能するAtgタンパク質 哺乳類細胞でオートファジーが形態学的に認知された 当初（1960年代後半）から，リソソームが変形し細胞 質成分を取り込む，ミクロオートファジーと呼ばれる様
図1■メチロトロフ酵母
において見いだされたオートファジー経 路
図中に示された炭素源で培養された本酵母 において誘導されるオートファジー経路 を，それぞれで形成される膜構造体を中心 に示す．VSM: vacuolar sequestring mem- brane; MIPA: micropexophagy-specific ap- paratus.
式のオートファジーが存在することが知られていた（10）． しかしながらほかのオートファジー経路同様，ミクロ オートファジーについてもその分子機構は長い間不明で あった．私たちは上述の におけるミクロペキ ソファジーを，ミクロオートファジー研究のモデルケー スと考えてその分子機構解明に取り組んだ．
ミクロペキソファジーを誘導した細胞の液胞，ペルオ キシソームを蛍光標識して顕微鏡観察で追跡観察し た（11）．観察された液胞膜の形態変化を複数のステップ に分けて解析したところ，ミクロペキソファジーでは液 胞膜の陥入に加えて，液胞膜の一部が隔膜化しペルオキ シソームを包み込むコンパートメント（液胞隔離膜，
Vacuolar sequestering membrane; VSMと略）を形成 するステップがあること（図1），そして多くのAtgタ ンパク質欠損株ではVSMの形成は正常だが，その後の ペルオキシソームの液胞内への取り込みが阻害されてい ることが明らかとなった（12）．電子顕微鏡解析などの解 析から，これらAtgタンパク質の働きによりペルオキシ ソーム表面に接して新膜構造体（Micropexophagy-spe- cific apparatus; MIPA）が形成され，これが液胞膜と融 合することでペルオキシソームを液胞内腔に完全に取り 込むことがわかった（13）（図1, 図2）．
その後の解析で私たちは，MIPAのみならず液胞膜自 体の動態制御にも機能するAtgタンパク質の分子機能 を明らかにした（図2）．その一つが上述の新膜構造体 マ ー カ ー タ ン パ ク 質Atg8で あ る（14）． の Atg8は新膜構造体のみならず，液胞膜にも局在して，
メタノール培養時の液胞膜断片の融合に機能すること，
またその欠損が本酵母のメタノール培地での生育度を低
下させることを見いだした．オートファジーにおける Atg8の機能には本タンパク質の脂質修飾（フォスファ チジルエタノールアミンとの共有結合）が必要だが，液 胞膜融合については脂質修飾を必要としないこと，一方 でAtg8のもつヘミフュージョン活性（融合するリン脂 質二重層のうち接する一重層同士を融合させる活性）は 液胞膜融合にも必須であることがわかった．
液胞膜動態を制御するもう一つのAtgタンパク質が Atg18である．このタンパク質はオートファジーにおい て形成される新膜の前駆構造体と液胞膜との両方に局在 する（15）（図2）．Atg18は上記のMIPAおよびVSMのど ちらの形成にも必須のタンパク質であった．私たちは，
のAtg18がリン酸化されることでイノシトー ルリン脂質であるフォスファチジルイノシトール3,5̶2 リン酸に対する結合親和性が低下して液胞から遊離する ことを見いだした．VSM形成を伴うミクロペキソファ ジー誘導時にはAtg18の脱リン酸化型（液胞膜局在型）
が存在するが，一方でVSMを形成しない．すなわち液 胞膜が変形しないタイプのペキソファジー（マクロペキ ソファジーと称される）においてAtg18は完全にリン酸 化されて液胞膜から遊離していることがわかった．すな わち，Atg18のVSM形成に関する機能には，その脱リ ン酸化がキーとなっていた．
これらのAtg分子はオートファジー条件だけでなく，
より広範囲な環境応答，すなわち，Atg8は浸透圧変化 に対応した液胞膜形態制御や，母細胞から娘細胞への液 胞の継承に関与し，Atg18とそのリン酸化は，浸透圧変 化や酸化ストレスに応答した液胞膜形態制御を支える分 子とそのメカニズムであることがわかった．
ペキソファジーの生理機能
酵母におけるオートファジー欠損株ではほとんどその 生育に影響がない．さらにオートファジーの多様な経路 のなかで，ペキソファジーの生理機能はあまり明確には なっていなかった．その理由としては，Atgタンパク質 の多くがペキソファジーのみならずほかの選択的オート ファジーや非特異的オートファジーにも機能するため，
Atgタンパク質欠損で見いだされた表現型が本当にペキ ソファジー機能停止によるものであるか判別できなかっ たことが挙げられる．いわゆる実験室培養条件（実験用 培地での生育条件）では，ペルオキシソームの量管理が 生理機能に必要ではない可能性も考えられた．
は私たちの研究室で世界に先駆けて 初めて単離・同定されたメチロトロフ酵母である．本酵 図2■液胞膜および新膜構造体の両方の動態をつかさどるAtg
タンパク質
P: peroxisome; PAS: pre-autophagosomal structure; PI（3,5）P2:
phosphatidylinositol 3′,5′-bisphosphate.
母は植物サンプルからも単離されることから，私たちは 本酵母が植物葉圏でも生育するのではないかと考え，蛍 光タンパク質を発現させた本酵母を植物（
）に接種した（16）（図3A）．概日周期を模して光 を照射する人工気象器内で植物を培養すると，接種され た酵母がその葉上で増殖することを見いだした．また，
日周期に応じて本植物葉上のメタノール濃度が明期に減 少し，暗期に上昇することを見いだした．
このような植物葉上のメタノール濃度の振動に対応し て， はペルオキシソームの量を増減させてい た（図3B）．すなわち暗期にはペルオキシソームが発達 し，明期にはその分解が亢進していた．本酵母には上述 のペキソファジー特異的レセプター因子Atg30のホモ ログが存在したのでそれを欠損した株を作製したとこ ろ，明期におけるペルオキシソーム減少が抑えられると ともに，野生株で見られた植物葉上での生育が見られな くなった（図3C）．このことから，ペキソファジーが本 酵母の植物葉上での生育に必須であるという生理機能が 示された．これは，限られた栄養しか存在しない植物葉 上で本酵母がペルオキシソームに蓄積したタンパク質を 効率的に再利用することが生育に必要なためと考えられ る．
植物葉圏に生息する微生物にとってのペキソファジー の重要性は，植物感染性糸状菌
においても明らかになっている．本病原菌において ペキソファジーに機能するAtg26タンパク質を欠損さ せると，本菌の植物への感染効率が著しく低下する（17）． Atg26は当初 において，非選択的オートファ ジーには機能せずペキソファジーに必須な因子として私 たちが同定したものであり（18），メチロトロフ酵母と糸 状菌とで共通したペキソファジーのメカニズムが働いて いることを示唆している．また最近の研究から高等植物 においてもペキソファジーがペルオキシソームの質管理 を 通 じ て 生 理 機 能 を 果 た す 可 能 性 が 示 唆 さ れ て お
り（19, 20），特に植物に関連したペキソファジー機能が明
らかとなりつつある．
メチロトロフ酵母の誘導期（lag期）におけるオー トファジーの生理機能
本稿最初に述べたとおり，メチロトロフ酵母がほかの 炭素源培地からメタノール培地へ移されると，ペルオキ シソームタンパク質をはじめとする代謝酵素群の大規模 な再編成が行われる．そのため，窒素源としてアンモニ ウム塩を用いる最少培地で培養する場合，本酵母は炭素 源がメタノールに転換された後，増殖を数時間停止す
る．この段階でオートファジーが誘導されていることを 私たちは において明らかにした（21）（図1）． 多くのAtgタンパク質欠損株はこの増殖停止期（lag期）
が野生株よりも延長される．これは，メタノール代謝酵 素の大量合成のためにオートファジーによるタンパク質 のリサイクリング，アミノ酸の獲得が重要であることに 起因していた．
おわりに
出芽酵母におけるオートファジー研究は，言うまでも なく今日のオートファジー分子機構解明の基礎となって いるが，本稿のように，メチロトロフ酵母を対象とした 研究も，特にペキソファジーを中心としたオートファ ジー経路の分子機構や生理機能の解明に貢献してきた．
また，産業用微生物として用いられるメチロトロフ酵母 図3■メチロトロフ酵母 の植物葉上におけ る生存戦略としてのペキソファジー
A. シロイナズナ 葉上への，Venus発現 株の接種写真．枠内には接種された菌体の顕微鏡観察像（明 視野像と蛍光像）を示す．縮尺，10 μm. B．葉上 にお ける概日リズムに応じたペルオキシソーム量変動の概念図．P, peroxisome. C．ペキソファジー特異的機能タンパク質Atg30を欠
損させた 株（ Δ株）と野生株（WT株）との比較．
左側にVenusを発現させた各株を接種し11日目の葉上蛍光顕微鏡 観察像を，右側にVenusをコードするゲノム挿入遺伝子に対する 定量PCRの結果を示す．縮尺10 mm. データは文献16, Kawaguchi
: , 6, e25257（2011）より再構成されたものである．
を用いた異種タンパク質生産能の向上を図るうえでも，
本酵母におけるオートファジー経路の解明は，細胞内ア ミノ酸プールの量制御の最適化などに資する重要な知見 を与えていると考えている．オートファジーという，も のを「壊す」（分解する）システムが，実はものを作る
（環境に適応した新規タンパク質合成）や，生き物を生 かす（植物葉圏での微生物生育）ことにつながっている ことを，本酵母は如実に語っている．
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プロフィル
奥 公 秀（Masahide OKU）
＜略 歴＞1997年 京 都 大 学 理 学 部 卒 業／
2003年同大学大学院農学研究科応用生命 科学専攻博士後期課程修了／同年同大学大 学院農学研究科COE研究員／2005年日本 学術振興会特別研究員／2008年京都大学 大学院農学研究科特定研究員／同年同大学 大学院農学研究科助教＜研究テーマと抱 負＞細胞内のオルガネラ動態，酸化還元状 態の制御機構の解明＜趣味＞喫茶店めぐり 田村 直輝（Naoki TAMURA）
＜略歴＞2005年東北大学農学部生物生産 学科卒業／2012年京都大学大学院農学研 究科応用生命科学専攻博士後期課程修了／
同年大阪大学蛋白質研究所特任研究員／
2014年福島県立医科大学医学部医学科助 教＜研究テーマと抱負＞環境変化に伴う細 胞内のリモデリング，解剖・組織学＜趣 味＞野球（ベイスターズ），ドライブ，お 酒
阪井 康能（Yasuyoshi SAKAI）
＜略歴＞1982年京都大学農学部農芸化学 科卒業／1988年同大学大学院農学研究科 博士後期課程修了（農博）／同年日本学術 振興会特別研究員／同年京都大学農学部助 手／1994年同助教授／1997年同大学大学 院農学研究科応用生命科学専攻助教授／
2005年同教授＜研究テーマと抱負＞微生 物研究を中心として，細胞内の物質循環・
輸送系やレドックス制御機構，さらには生 物間相互作用，環境レベルでの分子循環系 を明らかにしていきたい＜趣味＞音楽鑑 賞，オーディオ，水辺の散歩，テニス Copyright © 2014 公益社団法人日本農芸化学会
