はじめに
ニワトリ卵白リゾチーム（hen egg white lysozyme;
HEWL）は，1965年Phillipsらによってタンパク質とし ては3番目，酵素としては初めてX線結晶構造解析によ りその立体構造が明らかにされた（1）．この発見以降，
HEWLは阻害剤との複合体構造解析などの多くの研究 が行われ，現在ではその反応機構が非常によく理解され て い る 酵 素 の 一 つ で あ る．そ れ に も か か わ ら ず，
HEWLの触媒機構に関しては50年以上もの長きにわた りさまざまな提案がなされ，いまだ議論の対象になって いることは興味深い．一般的に，酵素は基質の化学変化 をもたらすものであるので，酵素と基質の複合体は不安 定であり，それを直接的手段により観測することは困難 である．しかし，酵素の立体構造や反応機構（反応中間 体）に基づいて設計された競争阻害剤は，酵素の基質結 合部位で安定な構造をとることから，今日に至るまで酵 素反応機構を解明する強力な研究ツールとなってい
る（2, 3）．近年筆者らは，2種類のHEWL遷移状態アナロ
グ阻害剤を分子設計し，これらを用いてHEWL反応機 構について再検証したので紹介する．
リゾチームの特性
糖質加水分解酵素ファミリー 22に分類されるリゾ
チーム（EC 3.2.1.17）は細菌細胞壁多糖を加水分解して 細菌を溶解する（4）．細菌の細部壁は，ペプチドグリカン と呼ばれる -アセチルムラミン酸（MurNAc）と -ア セチルグルコサミン（GlcNAc）が交互に重合する多糖 成分からなり，リゾチームはこの細胞壁ペプチドグリカ ンのMurNAcとGlcNAcの間の
β
（1→4）グリコシド結合 を 加 水 分 解 す る（5）．ま た リ ゾ チ ー ム は，直 鎖 状 のβ
（1→4）GlcNAc結合ホモポリマーであるキチンをも加 水分解する（6）．キチンは，菌界，動物界にわたり広く分 布している．リゾチームはその一次配列上の相同性か ら，ファージ型，グース型，ニワトリ型，細菌型，無脊 椎動物型，植物型の6つに大別される（4）．ニワトリ型の リゾチームはCタイプリゾチームとも呼ばれ，ペプチド グリカンとキチンの両方を加水分解するという基質特異 性を有している．
HEWLは129個のアミノ酸残基からなる1本鎖ポリペ プチドで分子内に4つのジスルフィド結合を有してお り，その名のとおりCタイプリゾチームに分類されてい る．分子量は14,300のタンパク質で，分子の大きさは 45×30×30 Åである．HEWLの重要な構造的特徴の一 つが，酵素タンパク質の片面を横切って存在する触媒部 位を含む基質結合クレフトである．
セミナー室
糖質関連酵素の最近の進歩-2リゾチーム遷移状態アナログの設計に基づく反応機構の検証
尾形 慎 *1，碓氷泰市 *
2，梅本尚之 *
3，大沼貴之 *
3，深溝 慶 *
3， 沼田倫征 *
4
*1福島工業高等専門学校物質工学科，*2静岡大学創造科学技術大学院，*3近畿大学農学部バイオサイエンス学科，*4産業技術総合研究所
HEWLの触媒機構とその歴史
HEWLのクレフト内に存在する基質結合部位には，
−4から＋2と称された6つの糖残基が結合するサブサイ トがあり，Phillipsらは競争阻害剤であるキトトリオー ス［（GlcNAc）3］とHEWLとのX線構造解析で，糖3個 分にあたるA環（非還元末端）からC環（還元末端）が
−4から−2サブサイトに結合することを示した（7）．こ の成果により基質の特異的な結合の様子や詳細な機構の 推定が行われるようになった．その後，この複合体構造 に基づき，6つのサブサイトに対して，キトヘキサオー ス［（GlcNAc）6］6糖がすべてのサブサイトを占める生 産性複合体構造のモデリングへと発展した（8）．その結 果，結合した6糖単位は，−1と＋1サブサイトに結合す るD環とE環の間でグリコシド結合が加水分解されるこ とがわかった（9, 10）．一方，天然基質である細胞壁ペプチ ドグリカンがHEWLに結合した場合，MurNAc残基は B, D, F環の位置に結合する．これは，MurNAc残基が，
C3炭素に乳酸基を介して結合しているペプチド側鎖の 立体障害により−4, −2, ＋1サブサイトに結合できない ためであり，その結果，−1と＋1サブサイトにはMur- NAc残 基 とGlcNAc残 基 が そ れ ぞ れ 結 合 し，
MurNAc→GlcNAc間の
β
（1→4）グリコシド結合が選択 的に加水分解される．HEWLの触媒反応は，グリコシド結合の加水分解つ まりアセタールのヘミアセタールへの変換である．この HEWLの 触 媒 に2つ の 酸 性 ア ミ ノ 酸 残 基 Glu35と Asp52 が触媒基として必須の役割を演じていること が，特異的な試薬を用いてアミノ酸残基を修飾する方法 や部位特異的変異法などによって証明されている（11）． Glu35とAsp52両残基はD環とE環の間のグリコシド結 合の両側に位置するように配置されている．また，
Glu35は裂け目の非極性領域にあるため，カルボキシ基
としては高いp a 6.7を示し，高いpH環境下でもプロ トン化されている．これとは対照的にAsp52は，極性 基に囲まれているのでp aは3.4程度の値を示す．この 2つのp a値の中間，pH 5付近でHEWLは最適に働く．
上述に基づく多くの知見から，HEWLに対して主に2 つの反応機構が基質のD環の構造変化を巡り提案され
ている（12〜14）．1つ目はPhillips機構と呼ばれ，基質が
HEWLのクレフトにはまり込む際にD環が半イス型に 歪み，その後グリコシド結合開裂によって生じたオキソ カルベニウムイオン中間体がそのまま，Asp52のイオン 化したカルボキシ基によって，静電的に安定化されると する反応機構である（12, 15）（図1A）．この場合，−1サブ サイトとD環とを適合させるには，歪み分だけエネル ギーを与えなければならない．この説を実証するため に，1972年Secemskiらは始めから中間体と同じような コ ン フ ォ メ ー シ ョ ン を と る キ ト テ ト ラ オ ー ス
［（GlcNAc）4］の還元末端を酸化した
δ
ラクトン体を競争 阻害剤として実験に用いた（16）（図2）．この阻害剤は，予想したとおりHEWLのA‒B‒C‒D環結合部位にD環 を半イス型にして結合することを当時のX線解析で実 証している．その一方で，基質の歪みはこの触媒能にあ まり関係しないのではないかとするいくつかの検証がな されている．たとえば，ChipmanとSharonは，いくつ かの基質アナログを用いてD環結合部位の結合親和性 を測定した．その結果，
δ
ラクトン体の−1サブサイト への結合はリゾチーム反応が歪みにより約40倍促進さ れるに過ぎず，この程度ではHEWLが無触媒のときの 108倍に及ぶ反応促進を補うには説明できないと彼らは 提唱した（17）．2つ目はKoshland機構と呼ばれ，D環は歪むことなく Asp52のカルボキシ基が脱離基に代わってC1と共有結 合しグリコシルエステル中間体となる．その後，水分子 の求核攻撃を受けて加水分解が完結する（図1B）．すな
図1■HEWLの触媒機構
HEWLで提唱されている触媒機構を図に示 した．上から，A. オキソカルベニウムイ オン中間体経由型（Phillips機構），B. グリ コシル酵素共有結合中間体経由型（Kosh- land機構）を示している．
わち，Phillips機構が静電的に中間体を安定化させるの に対し，Koshland機構は共有結合性のグリコシル酵素 中間体によって安定化されるのである（13）．しかしなが ら，長年この基質とHEWLとの共有結合が確認された という報告はなかった．その最大の理由は，共有結合中 間体ができる速さより壊れる速さのほうが大きく，その 寿命は極めて短いためである．2001年にWithersらは，
これらの問題を解決するためにグリコシル酵素中間体の 分解速度を極端に遅くする基質アナログを開発し，
HEWLの反応においてKoshland機構を強く支持する結 果を報告している（14）．すなわち，基質グルコースのC2 位 に 電 子 吸 引 性 の フ ッ 素 基 を 導 入 し た フ ッ 化 糖
（GlcNAc-
β
（1→4）-2-デオキシ-2-フルオロ-β
-D-グルコピラ ノシルフルオリド；NAG2FGlcF）を設計し，HEWLと の中間体形成およびその観察を行った（図2）．その結 果，予想したとおりフッ化糖基質はグリコシル酵素中間 体の分解速度を低下させ，エレクトロスプレーイオン化 質量分析において，HEWLに対して合成基質1個分に相 当する分子量の増加が確認された．しかしながら，この NAG2FGlcFをもってしてもX線結晶構造解析を可能に するほど長時間の半減期をもつグリコシル酵素中間体は 得られなかった．そのため，HEWLの活性中心Glu35残 基をGlnに変えた変異体（E35Q）を用いることで，よ うやくグリコシル酵素中間体のX線構造解析に成功し，−1サブサイトに結合した糖残基のC1原子とAsp52の カルボキシ酸素原子との間に期待した約1.4 Åの共有結 合が観察された．
以上の結果と，これまで蓄積された数々の実験的証拠 を踏まえ，WithersらはHEWLの反応機構はほとんど 矛盾なくKoshland機構によって説明できるとし，現在 では多くの保持型
β
-グリコシダーゼと同様にグリコシル 酵素中間体を経由して起こるという機構がHEWLの反 応機構として広く受け入れられつつある．一方で，長年 論争を繰り広げてきたこのHEWLの反応機構に対して，一時的に共有結合中間体を経由するということを見事に 実証したWithersらの実験結果にも少なからず議論の余
地があると思われる．それは，NAG2FGlcFという極め て優れた脱離基をもった特殊な基質類似体を使用してい る点であり，実際の基質で同様の共有結合中間体が形成 されるかは定かではない．さらに，構造解析されたグリ コシル酵素中間体は，HEWLの一般酸／塩基触媒とし て作用するGlu35をGlnに変えた変異体（E35Q）を用い たものであり，実際の反応を反映していない可能性もあ る．これまでに，Withersらの報告以外にもリゾチーム のグリコシル酵素中間体に関する研究例はあるが（18, 19）， 天然体のHEWLにおいてグリコシル酵素中間体の形成 を示した報告例はない．以降は，PhillipsとKoshlandの 両説が推定したHEWL反応機構に基づいて，近年筆者 らが合成した2種類の新規遷移状態アナログ（GN3Lお よびGN3M）とそれを用いて行ったHEWL反応の機構 検証について述べる．
新 規HEWL遷 移 状 態 ア ナ ロ グ（GN3Lお よ び GN3M）の合成
前述したPhillips機構に基づく遷移状態アナログであ る（GlcNAc）4の
δ
ラクトン体は，水溶液中で容易に開環 しアルドン酸体に構造変化するため，必ずしも適切なア ナログとは言えない（16）．そこで，新規アナログとして 半イス型様のコンフォメーションをとり，かつ構造の安 定な2-アセトアミド-2,3-ジデオキシジデヒドロ-グルコ ノ-δ
-ラクトン（L）構造を末端に有する（GlcNAc）4の ラクトン体（GN3L）の合成を試みた（図2）．近年，筆 者らはホウ酸存在下中性領域においてGlcNAcを加熱処 理することにより，モルガン‒エルソン法の色素原料と して知られるChromogen Iを含む主に3種類のヘキソフ ラノース誘導体を高収率で得ることに成功している（20）． そこで，本法をキチンオリゴ糖に適用することで，還元 末端残基C2とC3を選択的に脱水後，酸化反応により（GlcNAc）4から実に簡便に目的のGN3Lを合成した（21）． また，GN3Lの末端L残基は
α
,β
不飽和δ
ラクトン構造を 有しC1が 2混成軌道で安定な半イス型様コンフォメー ションをもつ．一方，Koshlandが提唱した遷移状態の新規アナログ として，1-デオキシノジリマイシン（モラノリン；M）
構 造 を 末 端 に 有 す る キ ト ト リ オ シ ル モ ラ ノ リ ン
（GN3M）を分子設計し，その合成を試みた（図2）．す なわち，グリコシダーゼの競争阻害剤として知られてい るモラノリンの構造に着目し（22〜24），キチンオリゴ糖末 端のGlcNAc残基をモラノリンに置き換えれば，HEWL に対する遷移状態アナログになるであろうと着想した．
この作業仮説に従い，供与体（GlcNAc）4と受容体モラ
図2■HEWLに対する遷移状態アナログおよび基質アナログ阻
害剤
ノリンを用いてリゾチームの糖転移反応によりGN3Mの 酵素合成を試みたところ，低収率ではあるがワンポット で高位置選択的に目的物質を得ることに成功した（25）． 上述したGN3Lとは対照的に，GN3Mの末端M残基はC1 が 3混成であり4 1と呼ばれるイス型コンフォメー ションをとっている．また，GN3Mを合成する際に副生 成物として重合度の異なるGN2MおよびGNMが得ら れ，これら化合物も同様にHEWL阻害剤の構造活性相 関を評価するうえでの対象化合物として利用することが できた．
GN3LとGN3MのHEWLに対する結合様式
合成した各種酵素阻害剤のHEWLに対する結合能評 価は，50％阻害活性試験，阻害反応速度論解析および等 温滴定カロリメトリー（ITC）を用いた結合親和性解析 により行った．はじめに，各種阻害剤のHEWLに対す る 阻 害 活 性 お よ び 阻 害 様 式 を，50％阻 害 活 性 試 験
（IC50）と阻害反応速度論解析により評価した．IC50は，
酵素と阻害剤の共存下における基質（
菌体細胞壁）の濁度減少を450 nmの吸光度で 測定し，初速度を求めた後，Dixonプロット法にて算出 し た．結 果，GN3LとGN2MがHEWL阻 害 剤 で あ る
（GlcNAc）3と比較してほぼ同等の阻害活性を示したのに 対し，GN3Mは（GlcNAc）3と比較して26倍強い阻害活 性（IC50＝0.57
μ
M）を示した．また，阻害反応速度論解 析は（GlcNAc）5-β
- NPを基質に用いて，その加水分解 速度を高速液体クロマトグラフィー法により評価した．その結果，50％阻害活性試験で高い活性を示した3種の 阻害剤（GN3L, GN2M, GN3M）のHEWLに対する阻害 様式はLineweaver‒Burkプロットにてすべて拮抗型を 示した．さらにDixonプロットより阻害定数（ i値）を 算出した結果，GN3L（3.51×10−5 M）とGN2M（2.01×
10−5 M）はほぼ同等の，そしてGN3M（1.84×10−6 M）
は最も強くGN2Mの約10倍の活性を示した．さらに，
ITCを用いた熱力学解析により，各種阻害剤とHEWL との結合親和力を求めた．測定はpH 7.0, 25 Cの条件で 行い，予想どおりGN3Mが一番高い結合親和力（ d＝ 760 nM）を示し，これまで報告されているHEWL阻害 剤としても最も強い親和力を示した（25）．これまでの研 究で，モラノリン自体が
α
-グルコシダーゼのような特定 のグリコシダーゼの−1サブサイトに強力に結合し反応 を阻害することが知られている（23, 24）．しかしながら，HEWLに対してはモラノリン単独では結合および阻害 活性は全く示さなかった．また，興味深いことにGN3M
とHEWLとの相互作用に伴うギブズ自由エネルギー変 化（∆ ）にはpH依存性が確認された．一般にモラノ リン残基のp aは6.3から6.7と報告されている（24, 26）． よって，今回の実験条件におけるモラノリン残基の環窒 素原子は正電荷を付与したプロトン化状態にある可能性 が十分に考えられ，これが結合親和性に大きく寄与して いると思われる．また，上述したように末端糖残基が半 イス型様コンフォメーションを取るGN3Lの結合親和力 はGN3Mよ り10倍 程 度 減 少 す る．こ れ ら の 事 実 は，
WarshelとLevittが，リゾチーム反応における基質D環 の遷移状態が安定化されるのは，静電的歪みによるもの であって立体的な歪みによるものではないという報 告（27）や，正電荷を糖ピラノースの環酸素やアノマー炭 素に相当する位置に配置した構造が保持型
β
-グリコシ ダーゼの反応中間体（遷移状態）を模倣した阻害剤になる（28, 29）という過去の知見とも一致する．以上の結果を
まとめると，GN3MのHEWLに対する強力な結合親和 力は，HEWLの−4から−2サブサイトへの（GlcNAc）3
の安定な結合と，−1サブサイトへの正に荷電した環窒 素原子を有し4 1イス型コンフォメーションをとるモラ ノリン残基の結合とが，協同的に作用することによって 強い結合親和性を導くものと推測できる．
GN3MとHEWLとのX線共結晶構造解析
GN3MのHEWLに対する結合をより明らかにするた め共結晶を作製後，Photon FactoryにてX線結晶構造 解析を行った．その結果，HEWLとGN3Mとの共結晶 の構造を1.2 Åの分解能で決定した．筆者らが予想した とおりHEWLの−4から−1サブサイトにはGN3Mに由 来する電子密度マップがはっきりと確認された（図 3A）．GN3Mの 構 造 中 に 含 ま れ る（GlcNAc）3部 分 は，
これまでに報告されているHEWLに対する（GlcNAc）3
の結合位置−4から−2サブサイトと完全に一致した
（図3B）．さらに，活性中心に位置するモラノリン残基 のコンフォメーションは4 1のイス型であり，その構造 はWithersら が 報 告 し た 不 活 性 型HEWL（E35Q） と NAG2FGlcFとの共有結合中間体構造と極めて高い類似 性を示した（図3C）．特にC4, C5, C6, 環窒素（環酸素）
の4つの原子に関してはX線結晶構造が完全に一致し た（25）．一般的に（GlcNAc）3や（GlcNAc）4は−1サブサ イトとのコンタクトを回避し，−4から−2サブサイト に結合することが知られている（30）．これは，−1サブサ イトに対する基質の結合には，複合体形成にとって不利 な正の結合自由エネルギーが生じるためである（18）．こ
のような観点からも，今回末端糖残基に選択したモラノ リン残基が−1サブサイトに対して強い親和性を有して いることがわかる．実際に，モラノリン残基の環窒素原 子には活性中心のAsp52を含む複数のアミノ酸残基と の水素結合の形成が確認された（図3B）．
長い間HEWLの触媒機構は，リゾチームの構造や非
酵素的なアセタールの分解機構，さらには（GlcNAc）4
の
δ
ラクトン体を用いた相互作用解析などを実験的根拠 とすることで，遊離のオキソカルベニウムイオンが活性 中心においてそのまま静電的に安定化されているとする Phillips機構で進行すると考えられてきた．しかしなが ら，Withersらの報告によって状況は一変し，今日では HEWLの触媒機構は多くの保持型β
-グリコシダーゼと 同様に共有結合中間体を経由して起こるというKosh- land機構が広く受け入れられつつある．しかしながら，天然型HEWLのグリコシル酵素中間体の形成に関する 報告はこれまで存在しなかった．今回筆者らが合成した GN3Mは天然型のHEWLの活性中心に関するX線共結 晶構造解析を初めて可能にした遷移状態アナログであ り，共有結合中間体形成の新たな実証例を示したことに なる．
おわりに
グリコシダーゼに対する低分子阻害剤の開発は，酵素 の反応機構や立体構造の研究に役立つばかりではなく，
生理機能や病態現象の解明にも役立つと期待される．ま た，その薬理的な作用を利用することで糖尿病の治療薬 をはじめ，抗ウイルス活性など医薬として臨床的な使用 が期待されている．よって，酵素の基質結合部位の構造 と触媒機構に着目した本HEWL遷移状態アナログの設 計原理は，サブサイト構造を有する種々の保持型グリコ シダーゼに対して適用可能であり，今後のさらなる展開 が期待される．
文献
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J. A. Rupley: “The Enzymes,” ed. by P. D. Boyer, 3rd Ed., 7, 1972, pp. 665‒868.
図3■HEWL‒GN3M複合体のX線結晶構造
HEWLとGN3Mとの複合体におけるX線結晶構造解析結果を図に 示した．上から，A. HEWLに結合したGN3Mのシミュレーテッド アニーリングオミットマップ，B. HEWLとGN3Mの結合様式，C.
天然型HEWL（黄）とGN3M（シアン）および不活性型HEWL
（E35Q; 緑）とNAG2FGlcF（青）の重ね合わせを示している．
10) J. A. Rupley & V. Gates: , 57, 496 (1967).
11) B. A. Malcolm, S. Rosenberg, M. J. Corey, J. S. Allen, A.
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30) T. Fukamizo: , 1, 105 (2000).
プロフィル
尾 形 慎（Makoto OGATA）
＜略歴＞2003年玉川大学農学部農芸化学 科卒業／2005年静岡大学大学院農学研究 科修士課程修了／2008年岐阜大学大学院 連合農学研究科博士課程修了／同年静岡大 学農学部博士研究員／2010年同大学創造 技術大学院特任助教／2012年福島工業高 等専門学校物質工学科助教，現在に至る
＜研究テーマと抱負＞糖質や糖鎖にかかわ る ものづくり を通して，生化学的現象 の解明を目指しています＜趣味＞散歩，ド ライブ（助手席）
碓氷 泰市（Taichi USUI）
＜略歴＞1970年東北大学農学部食糧化学 科卒業／1975年同大学大学院博士課程修 了／同年オハイオ州立大学化学科博士研究 員／1977年静岡大学農学部助手，助教授 を 経 て1989年 同 教 授／2005年 同 農 学 部 長／2010年同大学理事（副学長），現在に 至る＜研究テーマと抱負＞糖質・糖鎖の分 子認識機序の解明に基づく生物機能素材の 創出に関する研究＜趣味＞歴史探索（旅 行），スポーツ観戦
梅本 尚之（Naoyuki UMEMOTO）
＜略歴＞2010年近畿大学農学部バイオサ イエンス学科卒業／2012年同大学大学院 農学研究科バイオサイエンス専攻修士課程 終了／現在，同大学大学院農学研究科バイ オサイエンス専攻博士課程3年在籍＜研究 テーマと抱負＞顕著な糖転移活性をもつソ テツ由来キチナーゼのX線結晶構造解析
＜趣味＞美味しいお酒を探すこと 大沼 貴之（Takayuki OHNUMA）
＜略歴＞2002年九州大学大学院生物資源 環境科学研究科遺伝子資源工学専攻博士課 程修了／同年イリノイ大学獣医学部博士研 究員／2003年カリフォルニア大学バーク レー校／米国農務省Plant Gene Expres- sion Center博士研究員／2006年農業生物 資源研究所植物・微生物間相互作用研究ユ ニット特別研究員／2008年近畿大学農学 部バイオサイエンス学科助教／2012年同 大学農学部バイオサイエンス学科講師＜研 究テーマと抱負＞糖質関連酵素，タンパク 質の構造と機能および利用．特にキチン質 の分解，修飾，合成にかかわる酵素や，植 物の生体防御関連のタンパク質に興味を もっている＜趣味＞海外旅行，読書 深 溝 慶（Tamo FUKAMIZO）
＜略歴＞1977年九州大学農学部農芸化学 科卒業／1983年同大学大学院農学研究科 博 士 後 期 修 了／1985年 近 畿 大 学 助 手／
1992年同大学助教授／1999年同大学教授
＜研究テーマと抱負＞キチンキトサン加水 分解酵素および関連タンパク質の構造と機 能＜趣味＞野山の散策
沼田 倫征（Tomoyuki NUMATA）
＜略歴＞2003年九州大学大学院生物資源 環境科学府博士課程修了／同年日本学術振 興会特別研究員PD／2004年東京工業大学 大学院生命理工学研究科博士研究員／2005
〜2006年同研究科特任助手／2006〜2009 年科学技術振興機構さきがけ研究員／2007 年産業技術総合研究所生物機能工学研究部 門研究員／2010年同研究所バイオメディ カル研究部門研究員／2012年同主任研究 員，現在に至る＜研究テーマと抱負＞生体 高 分 子 複 合 体 の 構 造 機 能 解 析．特 に，
RNAがかかわる基礎生命科学研究に興味 をもっており，RNAとタンパク質からな る分子装置の作動原理を明らかにしていき たい＜趣味＞ドライブ，音楽鑑賞 Copyright © 2014 公益社団法人日本農芸化学会
