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化学と生物 Vol. 51, No. 7, 2013
原核生物の新規な獲得免疫機構 CRISPR/Cas システム
リピートとスペーサーの規則的反復構造が細菌の進化をコントロールする
近年，細菌学の分野でCRISPRという目新しい言葉が 注目されている．真正細菌・古細菌に広く保存されてお り，細菌の外来性遺伝子に対して獲得免疫機構を担って いることが示唆されていることから，細菌の生命現象を 理解するうえで欠かせない遺伝的要素であると言える．
しかしCRISPRに関する総説は，あまりに急激に研究が 進展しているため，本邦ではいまだ出版されていない．
本稿ではCRISPRに関する基本的事項について述べると ともに，菌株タイピングへの応用や獲得免疫以外の新機 能などの最新のトピックについても，われわれの研究成 果を交えながら紹介したい．
CRISPRは，細菌ゲノム上に1カ所ないし複数箇所に 限局して存在する反復配列領域で，おおむね30 〜40 bp 程度の塩基長の同一配列（リピート配列）の間に，同程 度の塩基長の多様な配列（スペーサー配列）が挟まれて 繰り返し構造をとる（図1）．Clustered regularly inter- spaced short palindromic repeat （CRISPR） は，この構 造的な特徴を示した略称で，リピート配列 （Repeat） が ゲノム上に限局的に密集し （Clustered）, 隣接リピート 間の間隔は規則的な長さで （Regularly Interspaced）, リ
ピート配列自体は短く回文構造をもつ （Short Palin- dromic） ことを示している．ゲノム配列が解読されてい る細菌種では，真正細菌の50%，古細菌の90%がCRIS- PRをもつことが報告されている（1）．CRISPRは後述す るリーダー配列と隣接し，CRISPR関連 （Cas : CRISPR- associated） 遺伝子群とともに存在するのが普通である．
歴史的に，CRISPRの特徴をもつ塩基配列領域が初め て報告されたのは，大阪大学の石野良純らによる1987 年にさかのぼる．このときは，アルカリフォスファター ゼアイソザイム変換に重要な遺伝子 の3′末端側に隣 接する配列として紹介されるのみであった（2）．その後，
同様の配列領域が真正細菌・古細菌に広く見られること が相次いで報告され，配列構造の特徴から2002年に
「CRISPR」 の 名 称 が 提 案 さ れ た（3）．さ ら に2007年，
CRISPRが細菌のファージ感染への抵抗性にかかわって いることが実験的に証明され（4），次いでプラスミド転移 や自然形質転換の抑制機能に関しても報告された．すな わち，細菌が外来性遺伝子の侵入を記憶して再感染時に 抵抗する「細菌の獲得免疫機構」として，制限修飾系な どと並列して議論される存在となった．近年では，後述
図1■CRISPRの構造と獲得免疫機 構
細菌は，バクテリオファージやプラ スミドなどに由来する外来性遺伝子 の一部を，PAM配列依存的もしくは 非依存的に，CRISPRの始端側に獲 得する（第一ステップ）．CRISPR領 域は1本の前駆crRNAとして転写さ れる．この後，I 〜 III型のそれぞれ に特異的なCasタンパク質群が，前 駆crRNAのプロセッシングを行うと ともに，crRNAとの複合体を形成す る（第二ステップ）．そして，スペー サーと相同な塩基配列をもつ外来性 遺伝子が菌体内に侵入した際，相補 的結合を形成して標的遺伝子を切断 する（第三ステップ）．
獲 得
1
発 現
2
切 断
3 Cas遺伝子群
I型 II型 III型
Cascade Cas9 Csm / Cmr
RNase III
0 Cas6
標的DNA 標的DNA 標的DNA
またはRNA 外来性遺伝子
PAM配列
プロセッシング
転 写 スペーサー
獲得
スペーサー リピート
リーダー配列 プロモーター
CRISPR
Cas3
（始端側） （終端側）
前駆crRNA 細 菌
ゲノムDNA プラスミド バクテリオ
ファージ
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する菌株タイピングなどへの利用が盛んであるほか，獲 得免疫以外の新機能も相次いで報告されている．
CRISPRのメカニズムは，遺伝子のノックダウンへの 応用で知られる真核生物のRNA干渉 （RNAi） に類似し たものであることが知られている．両者はともに，外来 配列の細胞内侵入に応答して転写され，small RNAと して標的配列と相補的結合し，標的配列を切断する機構 をもつ点で共通している．一方，CRISPRのみに見られ る特徴として，外来性の遺伝子断片をゲノム上に保存で きること，外来性遺伝子の再侵入時に獲得免疫系として 機能すること，複数の外来性遺伝子断片が限局した領域 内にリピート配列を介在して整列していること，転写後 に1スペーサー単位でプロセッシングされること，が挙 げられる．
CRISPRが獲得免疫機構を発揮するには3つのステッ プが重要である．すなわち，1） 外来性遺伝子断片の CRISPR内への獲得，2） 転写・プロセッシングによる CRISPRの発現，3） 外来性遺伝子の切断である（図1）． これら各ステップにはCas遺伝子群が必須である．Cas 遺伝子群はCRISPRの近傍に位置し，その種類は細菌・
古細菌全体で限られることから，代表的菌種名による CRISPR型分類（Ecoli型，Ypest型など）が用いられて きた（5）．しかし，その後のCRISPR関連報告の増加に伴 う同分類の問題点（オーソログ遺伝子に対する複数名称 の使用など）の改善を考慮した，Cas遺伝子群の種類と 並び方に基づくI 〜 III型の分類法（6） が現在では主流で ある（表1）．同法では各型をさらにA型などの亜型に 分類しているが，機能発揮するうえでのメカニズムの違 いはI 〜 III型の3パターンに集約される．
CRISPR獲得免疫の第一ステップでは，I 〜 III型のい ずれもCas1/2がスペーサー獲得時に機能する．I, II型 CRISPRはDNAを標的とし，DNA上に特定の塩基配列 モチーフを探してその領域の3′側配列をスペーサーとし て獲得する．このモチーフは protospacer-adjacent mo- tif （PAM） 配列と呼ばれ，亜型によって2 〜 8 bpの開 き が あ る．一 方，III型CRISPRはDNAだ け で な く RNAを標的とすることも可能で，一般的に明確なPAM 配列は認められない．獲得したスペーサーは，CRISPR 領域内にランダムに入るわけではなく，次の第二ステッ プでCRISPR領域が転写される際のプロモーター配列 側，すなわちCRISPRの始端側 （leader end） に端から 挿入される．その反対側は終端側 （trailer end） と呼ば れる．
第二ステップでは，CRISPR領域全体が1本のRNA
（前駆crRNA）として転写され，1スペーサー単位でプ ロセッシングされた後，第三ステップの準備としてCas タンパク質と複合体を形成する．まず最初の転写は，
CRISPR領域外の塩基配列上にあるプロモーター領域か ら始まる．プロモーターの位置する領域はリーダー配列
（leader sequence） と呼ばれ，多くの菌種において高 AT含量である．先の第一ステップで述べたCRISPR始 端側は，リーダー配列と隣接する側である．転写後のプ ロセッシングでは，スペーサーの両側に隣接するリピー トが部分的に連結された形で前駆crRNAが切断され，
crRNAとなる．このとき，I 〜 III型のいずれにおいて も，Casタンパク質が前駆crRNAに結合することに よってプロセッシングが起こる．I型ではCasタンパク 質複合体を特に CRISPR-associated complex for antivi-
表1■Casの型分類と機能
型 亜型 代表的菌種による分類 型／亜型に特有な遺伝子と機能
I ′ ″ 標的配列の切断
A Apern / Casタンパク質複合体形成
B Tneap-Hmari Casタンパク質複合体形成
C Dvulg Casタンパク質複合体形成
D − Casタンパク質複合体形成
E Ecoli Casタンパク質複合体形成
F Ypest Casタンパク質複合体形成
II Casタンパク質複合体形成
A Nmeni スペーサー獲得
B Nmeni −
III Casタンパク質複合体形成
A Mtube Casタンパク質複合体形成
B RAMP module Casタンパク質複合体形成
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ral defense （Cascade） と呼ぶ．II型ではCas9と複合体 を形成したcrRNAと，ゲノム上のCRISPRとは別の領 域から転写された -acting CRISPR-associated RNA
（tracrRNA） が相補的結合を形成した後，同じくゲノム 上の遺伝子発現から生じた RNase III によってリピート 配列の一部を切断する．またIII型ではCas6との複合体 に次いでCsmまたはCmr（いずれもCas遺伝子群の一 つ）との複合体をcrRNAが形成し，スペーサー自身と それに隣接する片側のリピートをそれぞれの複合体で切 断する．Cmrは，機能未知であった当初は repeat-asso- ciated mysterious protein （RAMP） と呼ばれていたが，
タンパク構造中のRNA認識モチーフ （RRM : RNA rec- ognition motif） が前駆crRNAのプロセッシングに重要 であることがわかり，Cascade構成タンパク質である Cas5などもRAMPファミリーとして分類されている．
第三ステップでは，Casタンパク質と複合体を形成し たcrRNAが自身と相同な塩基配列をもつ外来性遺伝子 を認識し，相補的結合を形成して外来性遺伝子を切断す る．前述のとおり，I, II型ではDNAのみを標的とする 一方，III型では亜型によるCas遺伝子の種類の違いに 基づいて，III-AはDNA, III-BはRNAをそれぞれ標的と する．I型ではCas3が標的DNAの切断に関与する．
細菌が生息環境に対応してCRISPRスペーサーを獲得 しているとすれば，スペーサー配列の相違が，異なる環 境に生息してきた同一菌種の相違をもたらす一つの要因
になっていると考えられる．これに着目して，CRISPR スペーサーの種類を菌株間で比較することでタイピング を行う手法が，近年種々の細菌種で行われている（1）．特 に，新規スペーサーが挿入される始端側のスペーサーの 種類を調べることにより，どのような外来性遺伝子に攻 撃を受けたかを知ることになり，感染制御によるその菌 種の環境適応を知る手がかりとなりうる．実際に，リ ピート配列と相同な逆向きプライマー一対で増幅した PCR断片を，既知のスペーサー配列とハイブリダイ ゼ ー シ ョ ン さ せ て 検 出 す る ス ポ リ ゴ タ イ ピ ン グ 法
（spoligotyping） が商品化されている．同法はPCRに基 づくため対象サンプル量が微量で済むこと，ハイブリダ イゼーションに基づくためシーケンシングが不要である ことが利点であるが，未知スペーサー配列の同定には シーケンシングが必須である．
また，獲得免疫以外にもCRISPRがさまざまな機能を もつことが近年報告されている（表2）．たとえば自己 の遺伝子発現の抑制やバイオフィルム形成抑制，遺伝子 水平伝播の抑制がこれに該当する．これらに加えて，わ れわれがCRISPR解析を行ってきたヒト咽頭炎の原因菌
, 歯周病の原因菌
では，菌種内の遺伝的多様性をCRISPRが制 御していることが示唆された．以下にその内容を簡単に 紹介する．
はゲノム上にプロファージ領域をもち，
表2■獲得免疫以外のCRISPRの機能
機能 詳細 菌種 参考文献
自己の遺伝子
発現抑制 グリコーゲンホスホリラー
ゼ遺伝子の転写抑制 Jorth and Whiteley, 2012 ヒスチジルtRNA合成遺伝
子の転写抑制 Aklujkar and Lovley, 2010
バイオフィル ム形成抑制
Cas遺 伝 子 群 と 特 定 の ス ペーサーによるバイオフィ
ルム形成抑制 Cady and OʼToole, 2011
遺伝子水平伝
播抑制 抗生物質耐性遺伝子の伝播
抑制 Marraffini and Sontheimer, 2008
菌種内の遺伝
的多様性制御 プロファージの出入りを制
限 Nozawa , 2011 ; Watanabe , 未発表
ゲノム再構成・菌体間組換
えの抑制 Watanabe , 2013
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われわれが行った多株ゲノム解析の結果，CRISPRス ペーサーはすべてプロファージ配列と相同であった．さ らに，観察されるプロファージの種類は，CRISPRが保 有するスペーサー数が少ないほど多様性に富んでいた（7）
ことから， はCRISPRを利用してゲノムへ のプロファージの出入りを制限し，菌種としての進化に 利用していると考えられた（Watanabe , 未発表）． 一方， は，複雑・大規模なゲノム再構成や 菌体間組換えにより菌種内の遺伝的多様性を創出してい ると考えられている菌種である（8, 9）．われわれの解析の 結果，CRISPRのスペーサーの約97%は既存の塩基配列 データベースに相同な配列が検出されなかった．しか し，残り数%のうち6割以上のスペーサーが，自己と同 じ菌種すなわち のゲノム配列と相同で，
さらにそのうち約4分の1は がゲノム上に 多数保有する挿入配列 （IS : insertion sequence） の配列 またはその近傍配列と相同であった．これらの結果か ら， では多様性創出が過剰にならないよ う，IS移動を介したゲノム再構成と菌体間組換えの両 者をCRISPRによって巧みに制御している菌種であると 考えられた（10）．いずれの菌種も，実験的検証による CRISPRの機能解明が待たれる．
われわれの研究成果の例だけでなく，CRISPRにはほ かにも未知なる機能が秘められている可能性があり，今 後のさらなる研究の進展が期待される．最後に，CRIS- PRを用いたゲノム編集技術が近年開発され，細菌だけ でなく真核生物にも広く応用可能であり，われわれの研 究室においても細菌を素材として技術導入を試みている ことを紹介しておく．
1） D. Bhaya : , 45, 273 （2011）.
2） Y. Ishino : , 169, 5429 （1987）.
3） R. Jansen : , 6, 23 （2002）.
4） R. Barrangou : , 315, 1709 （2007）.
5） D. H. Haft : , 1, e60 （2005）.
6） K. S. Makarova : , 9, 467 （2011）.
7） T. Nozawa : , 6, e19543 （2011）.
8） M. Enersen : , 3, 8487 （2011）.
9） T. Watanabe : , 193, 4259 （2011）.
10） T. Watanabe : , （2013）, doi : 10.
1093/gbe/evt075.
（渡辺孝康，中川一路，丸山史人，東京医科歯科大学 大学院医歯学総合研究科）
プロフィル
渡辺 孝康（Takayasu WATANABE）
＜略歴＞2008年東京医科歯科大学歯学 部歯学科卒業／同年歯科研修医プログラ ム／2009年同大学大学院（細菌感染制御 学分野，博士課程）／2012年日本学術振 興会特別研究員DC2／2013年東京医科歯 科大学大学院（細菌感染制御学分野，日 本学術振興会特別研究員PD），現在に至 る＜研究テーマと抱負＞歯周病の原因菌
がもつCRISPRの機能を研究 中． 以外の歯周病原因菌の CRISPR機能についても興味あり＜趣味＞
食べること，音楽鑑賞
中川 一路（Ichiro NAKAGAWA）
＜略歴＞1992年大阪大学歯学部歯学科卒 業／同年同大学大学院（口腔細菌学，博 士課程）／1995年日本学術振興会特別研究 員DC2／1996年大阪大学大学院（口腔細 菌学，日本学術振興会特別研究員PD）／
1997年 同 大 学 大 学 院（口 腔 細 菌 学，助 手）／1998年同大学大学院（口腔細菌学，
講師）／2006年東京大学（医科学研究所，
助教授）／2009年東京医科歯科大学（細菌 感染制御学分野，教授），現在に至る＜研 究テーマと抱負＞A群連鎖球菌の宿主細 胞内動態に興味あり，研究中．特に，オー トファジーによる感染制御の研究に注力し ている＜趣味＞読書，料理
丸山 史人（Fumito MARUYAMA）
＜略歴＞2000年国際基督教大学教養学部 理学科卒業／同年大阪大学大学院（薬学 研究科，修士課程）／2005年同大学大学院
（薬学研究科，博士課程）／同年同大学大学 院（薬学研究科，特任研究員）／2006年鳥 取大学（農学部，プロジェクト研究員）／
同年東京大学（医科学研究所，特別教育 研究員）／2008年同大学（医科学研究所，
特任研究員）／2009年東京工業大学大学院
（生命理工学研究科，助教）／2010年東京 医科歯科大学大学院（細菌感染制御学・環 境遺伝生態学分野，准教授），現在に至る
＜研究テーマと抱負＞環境における微生物 の進化や多様化を研究している．微生物と ヒトの相互作用に関しても興味あり，複数 の研究テーマを遂行中＜趣味＞旅行，切手 集め，酒
